Name: dissection, microct scanning and morphometric analyses of the baculum
Uploaded: 2017-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
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Tim Daley und Andrew Smith lieferte viele nützliche Rechen Diskussionen in den frühen Tagen; Tim Daley schrieb das Programm rotate_translate_cylindrical notwendig für das Protokoll 5. Computational Ressourcen, die von der High Performance Computing Cluster an der University of Southern California zur Verfügung gestellt wurden. Diese Arbeit wurde von NIH Zuschusses # GM098536 (MDD) unterstützt.

Alle Verfahren und Personal wurden von der University of Southern California Institute for Animal Care und Use Committee (IACUC), Protokoll # 11394 zugelassen. 1. Baculum Dissection und Vorbereitung <ol><li> Euthanize eine geschlechtsreife männliche Maus über Kohlendioxid Überbelichtung, nach Protokollen, die von der jeweiligen Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) dargelegt. </li><li> Legen Sie das Tier in Rückenlage, und verschleppen den Penis durch Druck mit den Daumen auf die Präputialöffnung lateral. </li><li> Sobald der Penis langwierig ist, das Gewebe durch die Vorhaut erstrecken so weit wie möglich. </li><li> Mit Schere, schneiden Sie den Penis Körper proximal zu der Eichel, wo die baculum befindet. </li><li> Übertragen Sie die seziert Penis zu einem 1,7 ml-Röhrchen und mit 200 &amp; mgr; l Leitungswasser. Stellen Sie sicher, dass der Penis vollständig in die Flüssigkeit eingetaucht ist. </li><li> Inkubieren des Gewebes in Wasser bei ~ 50 ° C für 3-5 Tage. </li><li&gt; Nach der ordnungsgemäßen Inkubation entfernen baculum das umgebende Gewebe, Pinzette unter einem Präpariermikroskop mit. Sanft spritzen 70% Ethanol verbleibende Gewebe abzustoßen und den Knochen zu reinigen. </li><li> Platzieren Sie den sezierten baculum in ein neues Reaktionsgefäß mit der Kappe geöffnet. Lassen Kappe offen O / N Knochen austrocknen. </li></ol> 2. MicroCT Scanning <ol><li> Drücken Sie eine microCT Scan zylindrischen Halter in einen Ziegel von Floristen Schaum einen Zylinder von Floristen Schaum zu erzeugen. </li><li> Extrahieren Sie den Zylinder von Floristen Schaum Scheiben schneiden und ~ 2-5 cm dick. </li><li> Push getrocknet bacula in den Floristen Schaum, um den Umfang eines einzelnen Slice Störungen zu minimieren während des Scannens. Die genaue Ausrichtung der Knochen sollte 4 in Protokoll für eine angemessene Identifizierung einzelner Proben bemerkt werden. </li><li> Sanft legen Sie die Scheibe mit den eingebetteten Knochen in den microCT Halter. </li><li> Erwerben Sie microCT Scans. Im Fall der Maus 14 bacula </sup&gt; Verwendeten wir ein uCT50 Scanner (Scanco Medical AG, Brüttisellen, der Schweiz) an der USC Molecular Imaging Center unter den folgenden Einstellungen: 90 kVp, 155 &amp; mgr; A, 0,5 mm Al-Filter, 750 Projektionen pro 180 (360 Deckung), Belichtungszeit 500 ms und Voxelgröße von 15,5 mm. </li></ol> 3. MicroCT Verarbeitung: eine .dcm Stapel zu einem einheitlichen .xyz Datei konvertieren HINWEIS: Jeder microCT Scan einen Stapel von .dcm erzeugt, oder &quot;dicom&quot;, Dateien, die Bildscheiben durch das Objekt genommen repräsentieren. Alle nachgelagerten algorithmischen Geometrie erfordert flache .xyz Dateien, die einfach eine Textdatei, die vier Spalten enthält - die x-, y- und z-Koordinaten jedes Pixels und die Intensität des Pixels, von -5.000 (schwarz) bis 5000 (Weiß). Ein Pixelschwelle über 3000 funktioniert im Allgemeinen gut als Schwelle für die Definition von Knochen. <ol><li> Installieren Sie Python (www.python.org) und die Python-Module BEFEHLE, DICOM, PYLAB, SYS und numpy. </li><li> Open &quot;01_process_dicom.py &quot;{Figshare} mit einem beliebigen Texteditor. Unter dem Abschnitt Variablen, ändern Weg, Pixelschwellen und Verzeichnisnamen wie nötig. </li><li> Run &quot;Python 01_process_dicom.py&quot;. Der Fortschritt wird auf Bildschirm gedruckt werden. Innerhalb jedes Verzeichnis in Schritt namens 3.2, wird eine neue Datei gemacht benannt; zum Beispiel directory_name.PT3000.xyz, wo PT3000 die Pixelschwelle anzeigt, in Schritt 3.2 angegeben. </li></ol> 4. MicroCT Verarbeitung: Segmentieren-out Einzel Specimen .xyz Dateien <ol><li> Installieren Sie R (https://www.r-project.org/) mit der Bibliothek RGL. </li><li> Öffnen Sie die Datei &#39;02_segment_dicoms.r&#39; {Figshare} mit einem beliebigen Texteditor. Unter dem Abschnitt Variablen, ändern Sie den Pfad zur Datei .xyz in Protokoll 3 oben erstellt zu zeigen. </li><li> Innerhalb R, führen Sie den Befehl &quot;Quelle ( &#39;02_segment_dicoms.r&#39;)&quot; (ohne Anführungszeichen). </li><li> Nach dem dreidimensionalen Bild der .xyz Datei in Protokoll 3 erscheint erstellt, geben Sie das number von Proben in der Gesamt .xyz Datei. Dann beschriften und die Punkte aus jeder Probe wählen Sie die Scroll- und Zoom-Funktionen. HINWEIS: Im Hintergrund getrennt .xyz Dateien werden für jede Probe durchgeführt werden. Diese erscheinen in einem Verzeichnis mit dem Namen, zum Beispiel XYZ_FILES_PT3000, wo PT3000 gibt die Pixelschwelle verwendet. </li></ol> 5. &quot;Ausrichten&quot; Specimen .xyz Dateien auf gemeinsamen Koordinaten. <ol><li> Öffnen Sie das Python-Skript &quot;03_transform.py&quot; {Figshare}, die das Zusatzmodul mattdean_modules.py {Figshare} erfordert, sowie zwei selbststehende Anwendungen: &quot;rotate_translate_cylindrical&quot; (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) und &quot;qconvex&quot; (www.qhull.org/html/qconvex.htm), die von diesem Skript verwendet werden. </li><li> Unter dem Abschnitt Variablen identifizieren die vollständigen Pfadnamen zu mattdean_modules.py, rotate_path und qconvex_dir. Darüber hinaus erkennen Sie den vollständigen Pfad zu dem Verzeichnis, das individuelle .xy enthältz-Dateien in Schritt 4 erstellt haben. </li><li> Führen Sie 03_transform.py, die pro Probe mit dem Suffix .TRANSFORMED.xyz eine neue Datei erstellt. </li></ol> 6. &quot;Slicing&quot; Aligned Specimen .xyz Dateien Halb Sehenswürdigkeiten zu identifizieren. <ol><li> Öffnen Sie und führen Sie das Python-Skript &quot;04_identify_landmarks.py&quot; {Figshare}. Im Abschnitt Variablen identifizieren vollständigen Pfadnamen in das Verzeichnis der .TRANSFORMED.xyz Dateien enthält. Dieses Skript identifiziert 802 semi-Wahrzeichen, die verwendet werden können, Größe und Form der Struktur zu quantifizieren. </li></ol>

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	<li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometrics+morphometrics.">Geometrics morphometrics.</a> Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).</li><li>Slice, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Modern morphometrics in physical anthropology. 6, (2005).</li><li>Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

Die kritischen Schritte in dem obigen Protokoll sind 1) sezieren die Bacula, 2) die microCT Bilder sammeln, 3) Umwandeln der microCT Ausgabe in eine flache Datei von XYZ-Koordinaten, 4) Segmentieren aus jeder Punkt Cloud Probe, 5) die Umwandlung jeder Probe zu ein standardisiertes System, und 6), die halb Sehenswürdigkeiten koordinieren. Diese Schritte werden leicht modifiziert, um verschiedene Objekte aufzunehmen. Diese Verfahren können wahrscheinlich auf jedes Objekt angewendet werden, das im wesentlichen &quot;stabförmig&quot; ist, oder zumindest nicht zu gekrümmt. Objekte , die Kurve auf sich selbst zurück zu werden &quot;u-förmigen&quot; derzeit nicht analysiert werden, da das Schneiden (1G) würde Punkte aus verschiedenen Teilen des Objekts zurück. Solche Objekte durch rechen Begradigung des Objekts vor dem Schneiden in der Zukunft untergebracht könnte. Wir haben ein allgemeines Verfahren zur mathematisch definieren, semi-Sehenswürdigkeiten von Formen präsentiert, s fehltolid Sehenswürdigkeiten. Diese allgemeinen Verfahren wurden modifiziert , um die Evolution der Wale Becken- und Rippenknochen 16 zu studieren, die sehr unterschiedliche Formen haben. Unsere Berechnungsmethoden für die Definition der Sehenswürdigkeiten sollte für jede Serie von XYZ-Koordinaten anwendbar sein. Wir beschäftigten microCT Scannen hier, angesichts der geringen Größe der Maus bacula 14. Für größere Knochen, wie die Wal Becken- und Rippenknochen beschäftigten wir einen Laserscanner, die die Oberfläche der Knochen 16 rekonstruiert. Es ist wichtig, visuell alle Sätze von halb Sehenswürdigkeiten prüfen die Qualität des Verfahrens zu überprüfen. Der Hauptvorteil unserer Berechnungsverfahren ist, dass sie genau die Größe quantifizieren und Variation der Form und die Übereinstimmung zwischen unterschiedlichen Regionen des Objekts zu erhalten.

Das Feld der morphometrics umfasst eine Vielfalt von Methoden , um die Größe und Form der biologischen Form, einen entscheidenden Schritt in der wissenschaftlichen Forschung 1, 2, 3, 4, 5, 6 , zu quantifizieren. Herkömmlicherweise beginnt die statistische Analyse der Größe und Form von Landmarken auf einer biologischen Struktur, und dann Messen linearen Abstände, Winkel und Verhältnisse zu identifizieren, die in einer multivariaten Rahmen analysiert werden konnte. Landmark-basierte Geometrische Morphometrie ist ein Ansatz, der die räumliche Lage von Sehenswürdigkeiten behält, geometrische Informationen von der Datenerfassung durch die Analyse zu erhalten und Visualisierung 5. Generalized Prokrustes-Analyse (GPA) kann Variation in Position, Skalierung und Drehung von Sehenswürdigkeiten entfernt werden angewendet, um eine Ausrichtung zwischen Proben zu erzeugen, die minimizes ihre quadrierten Differenzen - was bleibt Form Unähnlichkeit 7. Ein wichtiges Konzept jeder morphometrische Analyse ist Homologie, oder die Idee, dass man Ziele zuverlässig identifizieren können biologisch sinnvolle und diskrete Merkmale darstellt, die zwischen Proben oder Strukturen entsprechen. Zum Beispiel haben menschliche Schädel homologe Prozesse, Foramen, Nähte und Kanäle, die morphometrischen Analysen ermöglichen können. Leider ist die Identifizierung der entsprechenden Ziele schwierig in vielen biologischen Strukturen, insbesondere solche mit glatten Oberflächen oder Kurven 8, 9, 10. Wir nähern uns, dieses Problem unter Verwendung von algorithmischen Geometrie. Der allgemeine Arbeitsablauf ist eine dreidimensionale Abtastung des Objekts zu erzeugen, die als Punktwolke dargestellt werden kann, und dann drehen und dass die Punktwolke verwandeln, so dass alle specimens sind auf einem gemeinsamen Koordinatensystem orientiert. Dann definieren wir mathematisch semi-Grenzsteine ​​aus bestimmten Regionen des Objekts. Diskrete Halb Sehenswürdigkeiten auf solche Regionen platziert sind biologisch willkürlich 11. Durchführung von GPA und die anschließende statistische Analysen können unerwünschte Artefakte 8, 12 produzieren , weil willkürlich platziert Sehenswürdigkeiten biologisch nicht homolog sein kann. Deshalb lassen wir diese Halb Sehenswürdigkeiten mathematisch &quot;gleiten&quot;. Dieses Verfahren minimiert die Potentialdifferenz zwischen den Strukturen. Wie an anderer Stelle der Schiebe Algorithmus ist hier geeignet , verwendet argumentiert ähnliche anatomische Bereiche zu quantifizieren ohne Anhaltspunkte leicht identifiziert entsprechende 3, 6, 8, 10, 11, 12. Diese Verfahren haben ihre limitations 13, sollte aber auf Gegenstände unterschiedlicher Größe und Form anpassungsfähig sein. Hier veranschaulichen wir , wie diese Methode in einer neueren Studie der Maus baculum 14 angelegt wurde, ein Knochen in den Penis, der gewonnen wurde und verlor mehrere unabhängige Zeiten während Säuger evolution 15. Wir diskutieren die Präparation und Herstellung einer bestimmten Knochen, die baculum (Protokoll 1), die Erzeugung von microCT Bilder (Protokoll 2), und die Umwandlung dieser Bilder in ein Format, das alle nachgelagerten algorithmischen Geometrie (Protokolle 3 und 4) ermöglicht. Nach diesen Schritten wird jede Probe dargestellt durch ~ 100K xyz-Koordinaten. Wir gehen dann durch eine Reihe von Transformationen, die alle Proben in eine gemeinsame Ausrichtung (Protokoll 5) effektiv ausrichten, dann definieren halb Sehenswürdigkeiten aus ausgerichteten Proben (Protokoll 6). Protokolle 1-4 sollte unabhängig davon, wobei das Objekt analysiert ähnlich sein. Protokoll 5 und das Protokoll 6 sind speziell für einen baculum entworfen, aber es ist unsere Hoffnung, dass diese Schritte durch Detaillierung, können die Ermittler Änderungen vorstellen, die für ihr Objekt von Interesse relevant wäre. So wurden beispielsweise Modifikationen dieser Methoden Beckenknochen und Rippenknochen 16 zu studieren Wal angewendet.

<table><tbody><tr><td>Dissecting scissors</td><td>VWR</td><td>470106-338</td><td>Most sizes should work</td></tr><tr><td>Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved</td><td>VWR</td><td>82027-406</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS 64-17-5</td><td>To be diluted to 70% for dissections</td></tr><tr><td>Floral Foam</td><td>Wholesale Floral</td><td>6002-48-07</td><td></td></tr><tr><td>uCT50 scanner&amp;nbsp;</td><td>Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection, microct scanning and morphometric analyses of the baculum

Moderne morphometrics bietet leistungsfähige Methoden Größe und Formvariation zu quantifizieren. Eine Grundvoraussetzung ist eine Liste von Koordinaten, die Sehenswürdigkeiten zu definieren; aber solche Koordinaten müssen homologe Strukturen in Proben repräsentieren. Während viele biologische Objekte leicht identifiziert Sehenswürdigkeiten bestehen die Annahme der Homologie zu erfüllen, fehlen viele solcher Strukturen. Eine mögliche Lösung ist mathematisch Platz halb Sehenswürdigkeiten auf ein Objekt, das den gleichen morphologischen Region über Proben repräsentieren. Hier zeigen wir eine kürzlich entwickelte Pipeline mathematisch halb Sehenswürdigkeiten aus der Maus baculum (Penisknochen) definieren. Unsere Methoden sollten auf eine breite Palette von Objekten anwendbar sein.

Die XYZ - Koordinaten der Halb Sehenswürdigkeiten in Protokoll erzeugt 6 kann direkt in jeder Grenzstein-basierte Analyse geometrische Morphometrie 17 importiert werden. Die rechnerische Pipeline oben angewendet wurde 16 Maus bacula 14 sowie Wal Becken- und Rippenknochen zu studieren. Weitere Einzelheiten über die rechnerische Definition von Halb Sehenswürdigkeiten werden hier vorgestellt, in einem Versuch, die Forscher zu helfen, Schritte zu visualisieren, die geändert werden könnten, ihre besondere Objekt von Interesse gerecht zu werden. Die baculum enthält einige einzigartige Eigenschaften, die bestimmte Transformationen automatisieren ausgebeutet wurden. Beispielsweise nach rechnerisch den Knochen in zwei Hälften entlang einer proximal-distalen Achse schneiden, identifizierten wir die proximale Hälfte einfach durch die Gesamtzahl von Punkten zu vergleichen (der proximal hat mehr). Solange es einzigartige Features wie diese existieren, sollten unsere Methoden zu einem anpassungsfähig seinObjekt. Darüber hinaus sollte es, dass wir empirisch bestimmte Schwellenwerte, wie &quot;10% proximal&quot; bestimmt betont werden, dass auch in unserem baculum Studien durchgeführt, aber die meisten müssen sicherlich für andere Objekte neu bewertet werden. Ab Protokoll 5 ist die erste Rechenschritt die konvexe Hülle (die kleinste Menge von Punkten, die alle anderen Punkte in einer Probe enthält) zu berechnen, die beiden Punkte zu identifizieren, die am weitesten voneinander entfernt sind. Diese beiden Punkte (rote Kugeln, 1C) beginnen , eine neue z-Achse (rote Linie, 1C) zu definieren , die ausgeführt wird proximal-distal durch den Knochen. In dem Fall der baculum die Hälfte der Punktwolke, die mehr Punkte enthält als das proximale Ende definiert. Zweitens wird das gesamte Punktwolke transformiert, so daß der proximale Punkt nimmt die x, y, z-Koordinaten von 0,0,0 und der distale Punkt takes auf die x, y, z Koordinaten 0,0, + z, wobei z + einige positive Wert abhängig von der Größe des Knochens ist. Am Ende dieser Stufe wird eine z-Achse verläuft durch die Länge des Knochens. Für folgenden Verfahren wird die Länge von der minimalen bis zur maximalen z-Koordinaten bezeichnet als Zlength. Drittens für Varianz mit der genauen Anordnung der proximalen und distalen Punkten oberhalb assoziiert zu korrigieren, die 10% am meisten proximal und 10% distalsten Punkte separat abgetastet werden (1D), ihre jeweiligen Flächenschwerpunkte identifiziert (rote Kugeln, 1E) und die Punktwolke transformiert , so dass der proximale Zentroid ist 0,0,0 und das distale Zentroid ist 0,0, + z, mit einer neuen z-Achse , die die Mitte der Probe durchläuft (rote Linie, 1E) . Viertens ist die Punktwolke um die z-Achse gedreht wird, indem zuerst eine SLIC Einnahmee Punkte in dem proximalen 15-15,25% Zlength der Struktur (blaue Punkte, 1E). Diese Scheibe Punkte in der z - Dimension abgeflacht (dh z-Koordinaten werden einfach ignoriert), die konvexe Hülle genommen, und die minimale Begrenzungsrechteck (das kleinste Rechteck , das alle anderen Punkte enthält) berechnet. Stellen Sie sich eine Linie, die die Mittelpunkte der beiden kurzen Seiten dieser minimalen Begrenzungsrechteck zu verbinden. Wir drehen die Punktwolke, bis diese beiden Mittelpunkte -x geworden, 0, + z und + x, 0, + z jeweils damit diese Zeile wird eine neue x-Achse. Nach der Transformation werden die Distanz zwischen den maximalen und minimalen x-Werte bezeichnet als Xlength. Eine neue Datei wird von specimen.xyz zu specimen.TRANSFORMED.xyz erstellt. Fünftens Punkte innerhalb von 1% Xlength der z-Achse in Scheiben geschnitten aus (blaue Punkte, 1F), und die einzelne proximale und einzige am weitesten distal von diesem zentralen sl identifizierten PunktEis und markierte distaler und proximaler sind. Diese sind die beiden ersten Halb Sehenswürdigkeiten identifiziert. Sechstens 50 gleichmäßig beabstandeten Scheiben von Punkten entlang der z-Achse (rote Punkte, 1G) abgetastet. Jede Scheibe ist mit einer Dicke von 1% Zlength. Jede Scheibe wird dann in der z - Dimension abgeflacht, und zu gleichen Teilen von sieben vertikalen Linien (rote Linien, Abbildung 1H). Punkte innerhalb von 2% Xlength jeder Zeile vorhanden sind (rote Punkte, Figur 1H), dann werden die Punkte mit den maximalen und minimalen y-Koordinate gehalten werden, auf jede jeweilige Linie projiziert und ventralen und dorsalen gekennzeichnet, respectively. Darüber hinaus enthalten die Etiketten Slice - Nummer und die Zeilennummer, zum Beispiel P15_VENTRAL4 der ventrale Punkt aus der 4. vertikalen Linie der 15. Scheibe abgetastet wird. Wichtig ist, tritt auf einmal jeder Punkt markiert, zum Beispiel P15_VENTRAL4, und nur einmal in allen Proben, die Erhaltung entsprepondence. Zusätzlich zu den ventralen und dorsalen Punkte jeder der 7-Leitungen (14 semi-Grenzsteine ​​insgesamt), die Punkte mit den maximalen und minimalen x-Wert abgetastet und LEFT und RIGHT gekennzeichnet, respectively. Die y und z - Koordinaten von links und rechts mit der Lowess Funktion in R. geglättet Für die baculum, insgesamt 16 halbOrientierungsPunkte werden pro Scheibe (rote Kugeln, Abbildung 1H) definiert; mit 50 Scheiben plus proximaler und distaler halb Sehenswürdigkeiten oben definiert, 802 semi-Orientierungspunkte werden pro Probe (grüne Kugeln, 1I) abgetastet. Alle anderen Punkte aus dem ursprünglichen microCT Scan werden verworfen. Es sollte angemerkt werden, dass, obwohl ventral / dorsal und proximal / distal Polarität mathematisch bestimmt wurde, wurden alle Proben Alignments wurden visuell bestätigt und manuell nach Bedarf eingestellt. In unserem Beispiel von 369 bacula etwa 10 hatte manuell eingestellt werden. Abbildung 1: Visuelle Darstellung des Computational Workflow (Protokoll 4-6). (A) Ein Screenshot aus dem 02_segment_dicoms.r Skript (Protokoll 4), die Zuordnung von einzelnen Punktwolken zu einzelnen Proben zeigen. (B) vergrößerte Ansicht eines baculum, von einer Wolke aus ~ 100K xyz Punkte dargestellt. (C) Identifizierung der beiden Punkte am weitesten voneinander entfernt (rote Kugeln), verwendet , um eine neue z-Achse zu definieren , die ausgeführt wird proximal-distal durch den Knochen (rote Linie). (D) Abtasten der am weitesten proximal gelegenen 10% und am weitesten distal gelegenen 10% der Punkte (rote Punkte) stellt ein Mittel für geringe Varianz in der genauen Platzierung der z-Achse einzustellen. (E) die Schwerpunkte der am weitesten proximal gelegenen 10% und am weitesten distal gelegenen 10% (rote Kugeln) werden verwendet , um eine neue z-Achse (rote Linie) zu definieren. Dann fallen eine Scheibe Punkte zwischen 15,00-15,25% dieses neuen z-Achse (blaue Punkte) getroffen, um die minimale Begrenzungsrechteck zu berechnen. Die Punktwolke wird gedreht, bis die lange Seite des kleinsten begrenzenden Rechtecks ​​parallel zu einer neuen x-Achse. F) eine Scheibe Punkten entlang der Mittellinie (blaue Punkte ausgeführt wird ) abgetastet und die am meisten proximalen und distalen meisten Punkt als halbWahrZeichen definiert. G) 50 gleichmäßig verteilten Scheiben Punkte abgetastet (rote Punkte), mit H) eine solche Scheibe zeigt. 16 Punkte (rote Kreise) definiert den Umriss jeder Scheibe zu erfassen. I) Wenn in allen Scheiben wiederholt, insgesamt 802 halb Sehenswürdigkeiten (grüne Kugeln) definieren die Struktur und in allen nachfolgenden morphometrische Anwendungen eingesetzt. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55342/55342fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55342/55342fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Viele biologische Strukturen fehlen leicht definierbaren Sehenswürdigkeiten, was es schwierig macht moderne morphometrische Methoden anzuwenden. Hier zeigen wir Methoden, um die Maus baculum (ein Knochen im Penis) zu studieren, einschließlich Dissektion und microCT Scannen, gefolgt von Rechenmethoden halb Sehenswürdigkeiten zu definieren, die verwendet werden, eine Größe zu quantifizieren und Variation zu gestalten.

Sezierung, MicroCT Scanning und morphometrische Analysen der Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

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Serie: Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength and flexibility and allows it to fulfill its functions. Bone is continuously exposed to a variety of stimuli, which in pathological conditions can deregulate bone remodeling. To study bone biology and diseases and evaluate potential therapeutic agents, it has been necessary to develop in vitro and in vivo models.
This manuscript describes the dissection process and culture conditions of calvarias isolated from neonatal mice to study bone formation and the bone tumor microenvironment. In contrast to in vitro and in vivo models, this ex vivo model allows preservation of the three-dimensional environment of the tissue as well as the cellular diversity of the bone while culturing under defined conditions to simulate the desired microenvironment. Therefore, it is possible to investigate bone remodeling and its mechanisms, as well as the interactions with other cell types, such as the interactions between cancer cells and bone.
The assays reported here use calvarias from 5-7 day old BALB/C mice. The hemi-calvarias obtained are cultured in the presence of insulin, breast cancer cells (MDA-MB-231), or conditioned medium from breast cancer cell cultures. After analysis, it was established that insulin induced new bone formation, while cancer cells and their conditioned medium induced bone resorption. The calvarial model has been successfully used in basic and applied research to study bone development and cancer-induced bone diseases. Overall, it is an excellent option for an easy, informative, and low-cost assay.

The ex vivo culture of bone explants can be a valuable tool for the study of bone physiology and the potential evaluation of drugs in bone remodeling and bone diseases. The presented protocol describes the preparation and culture of calvarias isolated from newborn mice skulls, as well as its applications.

Messung der Knochenumgestaltung und Nachbildung der Tumor-Knochen-Mikroumgebung mit Calvaria-Kokultur und Histomorphometrie

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Forschung

Krebsforschung

Establishment of a Segmental Femoral Critical-size Defect Model in Mice Stabilized by Plate Osteosynthesis

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a model organism, the mouse has already been widely used in bone-related research. Large diaphyseal bone defect models in mice, however, are sparse and often use bone fixation which fills the bone marrow cavity and does not provide optimal mechanical stability. The objectives of the current study were to develop a critical-size, segmental, femoral defect in nude mice. A 3.5-mm mid-diaphyseal femoral ostectomy (approximately 25% of the femur length) was performed using a dedicated jig, and was stabilized with an anterior located locking plate and 4 locking screws. The bone defect was subsequently either left empty or filled with a bone substitute (syngenic bone graft or coralline scaffold). Bone healing was monitored noninvasively using radiography and in vivo micro-computed-tomography and was subsequently assessed by ex vivo micro-computed-tomography and undecalcified histology after animal sacrifice, 10 weeks postoperatively. The recovery of all mice was excellent, a full-weight-bearing was observed within one day following the surgical procedure. Furthermore, stable bone fixation and consistent fixation of the implanted materials were achieved in all animals tested throughout the study. When the bone defects were left empty, non-union was consistently obtained. In contrast, when the bone defects were filled with syngenic bone grafts, bone union was always observed. When the bone defects were filled with coralline scaffolds, newly-formed bone was observed in the interface between bone resection edges and the scaffold, as well as within a short distance within the scaffold. 
The present model describes a reproducible critical-size femoral defect stabilized by plate osteosynthesis with low morbidity in mice. The new load-bearing segmental bone defect model could be useful for studying the underlying mechanisms in bone regeneration pertinent to orthopaedic applications.

Although mouse models are invaluable tools for bone tissue engineering, models of long bone defects are sparse. This need motivated development of the present protocol which uses a locking plate with four screws and a dedicated jig to perform and stabilize a reproducible, femoral, critical-size defect with low morbidity.

Einrichtung eines segmentalen Femoral Critical-size Defektmodell in Mäusen durch Plattenosteosynthese Stabilisierte

The use of tissue-engineered bone constructs is an appealing strategy to overcome drawbacks of autografts for the treatment of massive bone defects. As a ...

Medizin

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in every tissue to be identified and characterized. Our laboratory is actively working to make technological advances in X-ray micro-computed tomography (micro-CT) that will bring the diagnostic power of histology to the study of full tissue volumes at cellular resolution (i.e., an X-ray Histo-tomography modality). Toward this end, we have made targeted improvements to the sample preparation pipeline. One key optimization, and the focus of the present work, is a straightforward method for rigid embedding of fixed and stained millimeter-scale samples. Many of the published methods for sample immobilization and correlative micro-CT imaging rely on placing the samples in paraffin wax, agarose, or liquids such as alcohol. Our approach extends this work with custom procedures and the design of a 3-dimensional printable apparatus to embed the samples in an acrylic resin directly into polyimide tubing, which is relatively transparent to X-rays. Herein, sample preparation procedures are described for the samples from 0.5 to 10 mm in diameter, which would be suitable for whole zebrafish larvae and juveniles, or other animals and tissue samples of similar dimensions. As proof of concept, we have embedded the specimens from Danio, Drosophila, Daphnia, and a mouse embryo; representative images from 3-dimensional scans for three of these samples are shown. Importantly, our methodology leads to multiple benefits including rigid immobilization, long-term preservation of laboriously-created resources, and the ability to re-interrogate samples.

We developed protocols and designed a custom apparatus to enable embedding of millimeter-scale specimens. We present sample preparation procedures with an emphasis on embedding in acrylic resin and polyimide tubing to achieve rigid immobilization and long-term storage of specimens for the interrogation of tissue architecture and cell morphology by micro-CT.

Starre Einbettung von fixiert und gefärbt, im großen und ganzen Millimeter-Skala Exemplare für Abschnitt-free 3D Histologie durch Mikro-Computertomographie

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...

Biotechnik

Biomechanical Testing of Murine Tendons

Tendon disorders are common, affect people of all ages, and are often debilitating. Standard treatments, such as anti-inflammatory drugs, rehabilitation, and surgical repair, often fail. In order to define tendon function and demonstrate efficacy of new treatments, the mechanical properties of tendons from animal models must be accurately determined. Murine animal models are now widely used to study tendon disorders and evaluate novel treatments for tendinopathies; however, determining the mechanical properties of mouse tendons has been challenging. In this study, a new system was developed for tendon mechanical testing that includes 3D-printed fixtures that exactly match the anatomies of the humerus and calcaneus to mechanically test supraspinatus tendons and Achilles tendons, respectively. These fixtures were developed using 3D reconstructions of native bone anatomy, solid modeling, and additive manufacturing. The new approach eliminated artifactual gripping failures (e.g., failure at the growth plate failure rather than in the tendon), decreased overall testing time, and increased reproducibility. Furthermore, this new method is readily adaptable for testing other murine tendons and tendons from other animals.

The protocol describes efficient and reproducible tensile biomechanical testing methods for murine tendons through the use of custom-fit 3D printed fixtures.

Biomechanische Prüfung von Murine tendons

Tendon disorders are common, affect people of all ages, and are often debilitating. Standard treatments, such as anti-inflammatory drugs, rehabilitation, ...

Analysis of Craniomaxillofacial Malformations in Mice Using Three-dimensional Microcomputed Tomography

To model craniofacial malformations caused by vitamin A deficiency (VAD), we expressed a dominant-negative retinoid receptor mutation in osteoblasts to specifically inhibit RAR transcriptional activity in mice. This approach allowed us to investigate the effects of VAD on cranial hypomineralization, mandibular deformity, and clavicular hypoplasia in clinical cases. In this study, microcomputed tomography (microCT) scanning of the craniomaxillofacial region of mice represented a valuable tool for studying the growth and development of this animal model. The manual estimation of images is both time-consuming and inaccurate. Hence, here, we present a straightforward, efficient, and accurate approach for segmenting and quantifying the microCT images of each craniomaxillofacial bone. MicroCT software was used to slice the mandible, frontal bone, parietal bone, nasal bone, premaxilla, maxilla, interparietal bone, and occipital bone of mice and measure their corresponding lengths and widths. This segmentation method can be applied to study growth and development in developmental biology, biomedicine, and other related sciences and allows researchers to analyze the effects of genetic mutations on individual craniofacial bones.

Here, we describe in depth a method, which is based on microcomputed tomography, to segment and measure 3D models of craniomaxillofacial bones in mice, for better assessment of craniomaxillofacial bone development in mice than what is possible with current methods.

Analyse von kraniomaxillofazialen Fehlbildungen bei Mäusen mittels dreidimensionaler Mikrocomputertomographie

To model craniofacial malformations caused by vitamin A deficiency (VAD), we expressed a dominant-negative retinoid receptor mutation in osteoblasts to ...

Entwicklungsbiologie

Grundsätze und Protokolle der mechanischen Prüfung auf Anfälligkeit für Knochenbrüche

Practical Considerations for the Design, Execution, and Interpretation of Studies Involving Whole-Bone Bending Tests of Rodent Bones

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care costs. The ability to understand the mechanisms underlying bone disease and the response to treatment is not only desired, but critical. Mechanical testing of bone serves as a valuable technique for understanding and quantifying a bone&#39;s susceptibility to fracture. While this method appears simple to perform, inappropriate and inaccurate conclusions may be reached if governing assumptions and key steps are disregarded by the user. This has been observed across disciplines as studies continue to be published with misuse of methods and incorrect interpretation of results. This protocol will serve as a primer for the principles associated with mechanical testing along with the application of these techniques-from considerations of sample size through tissue harvesting and storage, to data analysis and interpretation. With this in hand, valuable information regarding a bone&#39;s susceptibility to fracture may be obtained, furthering understanding for both academic research and clinical solutions.

Autor im Rampenlicht: Verbesserung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit bei Biegetests für ganze Knochen 

Mechanical testing of rodent bones is a valuable method for extracting information regarding a bone's susceptibility to fracture. Lacking proper practical understanding, the results may be overinterpreted or lack validity. This protocol will serve as a guide to ensure mechanical tests are performed accurately to provide valid and functional data.

Praktische Überlegungen für das Design, die Durchführung und die Interpretation von Studien mit Ganzknochenbiegetests an Nagetierknochen

Skeletal fragility leading to fracture is an American public health crisis resulting in 1.5 million fractures each year and $18 billion in direct care ...

A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the structural and cellular components of the mandibular condylar cartilage (MCC). This manuscript describes methods for analyzing these changes and a method for altering the loading of the TMJ in mice (i.e., compressive static TMJ loading). The structural evaluation illustrated here is a simple morphometric approach that uses the Digimizer software and is performed in radiographs of small bones. In addition, the analysis of cellular changes leading to alterations in collagen expression, bone remodeling, cell division, and proteoglycan distribution in the MCC is described. The quantification of these changes in histological sections - by counting the positive fluorescent pixels using image software and measuring the distance mapping and stained area with Digimizer - is also demonstrated. The methods shown here are not limited to the murine TMJ, but could be used on additional bones of small experimental animals and in other regions of endochondral ossification.

This manuscript presents methods for analyzing morphometric and cellular changes within the mandibular condyle of rodents.

Eine morphometrische und zelluläre Analysemethode für das Murine mandibulares Kondylus

The temporomandibular joint (TMJ) has the capacity to adapt to external stimuli, and loading changes can affect the position of condyles, as well as the ...

Biologie

HE-Färbung und Mikro-CT zur Bewertung der Mikroarchitektur des trabekulären Knochens von Mäusen

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton is crucial for gaining insight into the pathophysiology of osteoporosis and improving its treatment. However, handling bone samples can be complex due to their hard and dense properties. Secondly, specialized software makes image processing and analysis difficult. In this protocol, we present a cost-effective and easy-to-use solution for trabecular bone microstructure analysis. Detailed steps and precautions are provided. Micro-CT is a non-destructive three-dimensional (3D) imaging technique that provides high-resolution images of trabecular bone structure. It allows for the objective and quantitative evaluation of bone quality, which is why it is widely regarded as the gold standard method for bone quality assessment. However, histomorphometry remains indispensable as it offers crucial cellular-level parameters, bridging the gap between two-dimensional (2D) and 3D assessments of bone specimens. As for the histologic techniques, we chose to decalcify the bone tissue and then perform traditional paraffin embedding. In summary, combining these two methods can provide more comprehensive and accurate information on bone microstructure.

Autor im Rampenlicht: Eine wirtschaftliche und effiziente Methode zur quantitativen Bewertung der Knochenmikroarchitektur in einem murinen Osteoporosemodell 

This protocol presents an economical and efficient method for quantitative evaluation of bone microarchitecture in a mouse model of osteoporosis by combining Hematoxylin-Eosin (HE) staining and micro-computed tomography (Micro-CT) techniques.

Bewertung der trabekulären Knochenmikroarchitektur in einem Osteoporose-Mausmodell

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...

Sezierung, MicroCT Scanning und morphometrische Analysen der Baculum

Zusammenfassung

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Messung der Knochenumgestaltung und Nachbildung der Tumor-Knochen-Mikroumgebung mit Calvaria-Kokultur und Histomorphometrie

Einrichtung eines segmentalen Femoral Critical-size Defektmodell in Mäusen durch Plattenosteosynthese Stabilisierte

Starre Einbettung von fixiert und gefärbt, im großen und ganzen Millimeter-Skala Exemplare für Abschnitt-free 3D Histologie durch Mikro-Computertomographie

Biomechanische Prüfung von Murine tendons

Analyse von kraniomaxillofazialen Fehlbildungen bei Mäusen mittels dreidimensionaler Mikrocomputertomographie

Praktische Überlegungen für das Design, die Durchführung und die Interpretation von Studien mit Ganzknochenbiegetests an Nagetierknochen

Praktische Überlegungen für das Design, die Durchführung und die Interpretation von Studien mit Ganzknochenbiegetests an Nagetierknochen

Praktische Überlegungen für das Design, die Durchführung und die Interpretation von Studien mit Ganzknochenbiegetests an Nagetierknochen

Eine morphometrische und zelluläre Analysemethode für das Murine mandibulares Kondylus

Bewertung der trabekulären Knochenmikroarchitektur in einem Osteoporose-Mausmodell