Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Te&#769;le&#769;thon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

1. Preparação de Soluções e puxou vidro Needle <ol><li> Adicione uma solução de estoque de 25x tricaina (3-amino éster de etilo do ácido benzóico, também chamado de acetato de 3-aminobenzoato de metilo) a 4 mg / mL em Tris 20 mM, pH 8,8 e trazer esta solução é a pH 7. alíquota, de 4 ml e armazenar a -20 ° C. NOTA: O tricaina anestésico actua preferencialmente nos canais de sódio dependentes da voltagem neurais bloqueando assim espasmos musculares e movimento 6. </li><li> Adicione uma solução de trabalho de tricaina a uma concentração final de 0,17 mg / mL em meio de embrião E3. 7 NOTA: Faça o tricaina solução de trabalho de improviso como o pH desta solução deriva. </li><li> Dissolve-se o de agarose de baixo ponto de fusão até uma concentração final de 1,5% em meio de embrião E3, em um tubo de 50 ml por aquecimento da solução em um forno de microondas. Deixe que esta solução se equilibrar a 42 - 45 ° C em qualquer um banho de água ou de bancada incubadora. Se preparando grandes pratos para verticaisluz folhas de imagem (passo 4), faça um adicional de 25 mL de 1% de fusão padrão de agarose em meio embrião E3. </li><li> Use o vidro de borosilicato com capilares de filamentos com dimensões de OD 1,20 mm, 0,69 mm ID, comprimento 10 mm. </li><li> Se capilares são puxados sobre o tipo de aquecimento-filamento extrator de agulhas descrito na Tabela de equipamentos e reagentes, use as seguintes configurações: Calor 600, Pull 120, Velocity 50, Tempo 225, Pressão 500. Com um par de fórceps afiadas, ruptura a agulha apenas após o ponto em que se flexiona para criar uma agulha limpa e nítida para orientar os embriões e removendo o excesso de agarose. Um micro-bisturi também pode ser utilizado para remover o excesso de agarose. </li></ol> 2. Incorporação de embriões para Invertido ou Microscopia Vertical <ol><li> Levantar os embriões até o estágio adequado em meio embrião E3. 7 </li><li> Na fase necessária, embriões dechorionate com um par de fórceps afiadas debaixo de uma dissecção binocularmicroscópio ting. </li><li> Incubar os embriões dechorionated para, pelo menos, 5 minutos na solução de trabalho tricaina. </li><li> Uma vez que a solução de agarose fundida foi arrefecida até 45 ° C, utilizar uma pipeta de Pasteur de vidro para transferir o embrião dechorionated directamente para o tubo de 50 ml com transferência mínima de meio E3. </li><li> Remover embrião em conjunto com cerca de 1 ml de meio de montagem e adicionar aprox. 100 ul de meio de montagem em conjunto com o embrião ao círculo central de uma placa de Petri com fundo de vidro com 35 milímetros de micropoços de 10 mm. </li><li> À medida que o meio de montagem é a criação, mover o embrião para a borda do círculo de agarose com a cauda virada para fora (Figura 1A). Usar a agulha capilar para manter o embrião na orientação lateral desejada até que o gel é completamente definido. Para a imagem desenvolvimento corporal posterior, ter o cuidado de orientar o embrião de uma orientação que de lateral possível. Assim, manter o embrião nesta posição por adjustmen cuidadosasst com a agulha capilar. NOTA: Múltiplos embriões podem ser adicionados ao prato de montagem neste ponto, se necessário. Se este for o caso, a transferência da agarose de baixa fusão no primeiro prato e adicionar os embriões para o centro da gota de agarose. Em seguida, empurrar os embriões para as extremidades do anel de vidro e orientação para a posição desejada. Até seis embriões pode ser montado desta maneira antes da agarose torna-se solidificou. </li></ol> 3. remoção do excesso de agarose em torno do corpo Posterior NOTA: Esta seção descreve o procedimento pelo qual agarose é removido da região em torno do corpo posterior. No caso do alongamento do corpo posterior, é importante para garantir que a cauda podem crescer-out normalmente. Ao remover a agarose após o embrião tenha sido completamente incluídos por agarose, o embrião é deixado fechado pela região da cabeça e aproximadamente metade do saco vitelino. <ol><li> Uma vez que a queda de agarose definiu, inundar o petri dish com a solução de trabalho tricaina. </li><li> Sob um microscópio de dissecação binocular com uma base de luz de transmissão, ajustar a posição do espelho e o ângulo de luz incidente de tal forma que o contraste forte permite que os cortes na agarose para ser visto claramente por meio da operação. </li><li> Para executar corte 1 (Figura 1), utilizar a agulha capilar ou o micro-bisturi para cortar a meio caminho de agarose ao longo da gema, a partir de uma posição imediatamente posterior ao campo do coração formando para a posição de somito 5 (a 5 th somite anterior). </li><li> Inicie o corte inicial adjacente ao coração formando como mostrado, e a forma total através da agarose ao vidro. </li><li> Mantenha o capilar ou micro-escalpelo nas profundezas da agarose, e, lentamente, viu cima e para baixo, enquanto começando a fazer um longo corte sobre o embrião como mostra a Figura 1. Cortar o mais perto do embrião quanto possível, sem perfurar o embrião ou gema. </li><li> Em seguida, fazer cortes 2 e 3 (Figura 1 </strong&gt;), A partir da posição contra o embrião e com o corte indo todo o caminho até o fundo de vidro prato. Adicione corte 2, de modo que é tangencial aos primeiros 5 somitos, permitindo dorsalward desdobramento completo do corpo posterior. Adicione cortar 3 a um ângulo de 90 ° com a superfície da gema e a partir da HEARTFIELD. NOTA: o corte de agarose até que a extremidade do círculo de vidro (como se mostra na Figura 1) auxiliares na remoção da agarose como um bloco completo (passo 3.6). No entanto, isso não é necessário. </li><li> Começando na intersecção dos cortes 1 e 3, fazer um corte diagonal lento no final do corte 2 enquanto levanta-se lentamente para cima, a fim de desalojar o quadrado de agarose em torno do corpo posterior. Notas: Em alguns casos, este será lançado em um bloco e a conclusão da operação de uma só vez. Em outros, pode levar várias tentativas para dis-lodge toda a agarose em torno do embrião. </li><li> Com um par de pinças cortantes, remover o b desalojadomechas de agarose a partir do meio do embrião. Para ajudar neste processo, movimentar as peças de agarose para o lado do prato e usar a parede da placa de Petri como suporte de elevação enquanto os pedaços de agarose. </li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> Figura 1: Diagrama de montagem set-ups. (A) O diagrama mostra a posição do embrião montado no interior do anel central de vidro numa placa de Petri. À direita é um zumbido do embrião com cada corte sucessivo através do circunda agarose mostrado com linhas vermelhas dottted. (B) Os embriões montados é diagramado em vista lateral exibindo a facilidade de acesso para ambos os objetivos invertidos e verticais. (C) A digram semelhante mostrando como os embriões podem ser montado para imagiologia folha de luz vertical set-ups. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">Por favor cl</a>ick aqui para ver uma versão maior desta figura. <ol start="9"><li> Se espasmos musculares não está completamente bloqueada nesse ponto, adicionar gotas de tricaina a partir da solução stock de 4 mg / ml, pH 7. </li></ol> 4. Montagem de embriões para Luz folhas Vertical Microscopia NOTA: Esta é uma variação do método descrito acima, que permite o acesso de múltiplos objetivos para geração de imagens de amostras por SPIM verticalmente orientada. A ideia subjacente a esta variação é a de elevar a amostra ligeiramente maior do que o fundo do recipiente, para permitir o fácil acesso de dois objectivos de imagem. <ol><li> Antes da amostra de montagem, um revestimento 100 milímetros placa de petri de plástico com 1% de agarose em forma E3 a uma altura de 5 mm e deixar solidificar. </li><li> Colocar uma gota de 1 ml de agarose de baixo ponto de fusão para o centro do prato e deixar solidificar. </li><li> embriões incorporar em agarose de baixo ponto de fusão como no ponto 2. No entanto, este tempo, retire o embrião a partir do tubo de 50 mlde agarose com uma queda menor de solução (0,5 ml) e colocar esta pequena gota no topo de 1 ml a cair no centro do prato. </li><li> Usar a agulha capilar para colocar o embrião no centro da pequena gota e manter a sua orientação correcta até gel é definido. </li><li> Inundar o prato com solução de trabalho tricaina e remover o excesso de agarose, como na seção 3, mas sem cortar a almofada de 1% de agarose padrão. </li></ol>

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	<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics.">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li><li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation.">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics.">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li><li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates.">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction.">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Schr&#246;ter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Esta técnica de montagem permite que embriões que permanecer estática durante a transferência para o microscópio e mais experimentos com imagens de lapso de tempo de longo prazo destinadas a seguinte alongamento do corpo posterior em várias escalas de comprimento. Além disso, é versátil na medida em que permite a imagem em microscopia invertida na vertical e fixados-ups, e uma sugestão é feita para como isto pode ser ainda adaptado para SPIM orientada verticalmente. Um passo essen...

Posterior alongamento corpo é um processo essencial do desenvolvimento embrionário em que o embrião se estende de modo a formar uma grande parte do eixo do corpo. É um exemplo de um processo morfogenético complexo, através da qual vários comportamentos de células agir coordenadamente para gerar a morfogénese no nível de tecidos individuais. Estas deformações tecido diferencial, em seguida, actuar em conjunto para gerar o alongamento do corpo posterior em todo o nível da estrutura. Para entender como esses processos são controlados e coordenados durante o desenvolvimento, que deve ser capaz de seguir esses processos em múltiplas escalas (ou seja, no nível de moléculas, células, populações de células e tecidos) e relacionar esta diretamente para a morfogênese de toda a estrutura . embriões de peixe-zebra são ideais para imagiologia alongamento posterior do corpo como a sua transparência óptica e pequeno tamanho permite a aplicação de luz de imagens minimamente invasiva abordagens bem adequado para live imagiologia. 1 Isto foi evidenciado por uma série de publicações recentes que lançaram luz sobre o desenvolvimento corporal posterior ao nível de moléculas, 2 células individuais, 3 e inter-tecidos comportamentos, 4, bem como ao nível da população celular e órgão inteiro. 5 técnicas de imagem avançadas, como confocal, microscopia multi-fotão e microscopia de iluminação avião seletiva (SPIM) estão permitindo que a imagem a longo prazo dos processos de desenvolvimento, com efeitos de toxicidade luz e foto-branqueamento diminuiu. técnicas robustas para a montagem de amostras vivas são necessárias para atingir três objectivos: 1) um apoio suficiente para manter as amostras na orientação correcta, durante a transferência para o microscópio e durante a aquisição, 2) liberdade de movimento suficiente da amostra para permitir a excrescência de a região do corpo posterior sem afectar a sua devel normaisvolvimento, e, finalmente, 3) um certo grau de versatilidade do método de montagem para permitir a imagiologia em diversas imagem set-ups. Este protocolo apresenta uma técnica de montagem para a imagiologia do desenvolvimento do peixe-zebra D. rerio. Esta técnica envolve a montagem de embriões de tal forma que as regiões da cabeça e do saco vitelino são quase inteiramente incluídas na agarose, deixando região do corpo posterior para alongar e desenvolver normalmente. Como tal, também é um método adequado para a imagiologia de longo prazo de outras regiões do corpo em desenvolvimento como a agarose permite imagiologia por meio de técnicas de imagiologia de luz padrão. Este protocolo demonstra a montagem de embriões em uma orientação lateral, embora também seja possível a montagem em orientações embriões alternativos. Ela vai mostrar ainda mais como adaptar o método para configurações de microscopia na vertical, invertida e verticais de luz folhas.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CONSUMABLES&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottomed dishes</td><td>Mattek</td><td>P35-1.5-10-C</td><td>35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass</td></tr><tr><td>Capillaries for injection needles</td><td>&amp;nbsp;Sutter&amp;nbsp;</td><td>BF 120-94-10</td><td>We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.</td></tr><tr><td>Micro-scalpel</td><td>Feather</td><td>P-715</td><td>Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle</td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes</td><td></td><td></td><td>230 mm long</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting point agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps&amp;nbsp;</td><td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&amp;nbsp;</td><td>11252-30&amp;nbsp;</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Needle puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter&amp;nbsp;</td><td>P97</td><td>Heating-filament needle puller</td></tr><tr><td>Binocular dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>S8 Apo</td><td></td></tr></tbody></table>

a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development

embriões de peixe-zebra oferecer um sistema experimental ideal para estudar processos morfogenéticos complexas devido à sua facilidade de acessibilidade e transparência óptica. Em particular, o alongamento do corpo posterior é um processo essencial do desenvolvimento embrionário, através da qual múltiplos deformações tecido agir em conjunto para dirigir a formação de uma grande parte do eixo do corpo. A fim de observar esse processo por meio de imagens de lapso de tempo de longo prazo, é necessário utilizar uma técnica de montagem que permite um apoio suficiente para manter amostras na orientação correta durante a transferência para o microscópio e aquisição. Além disso, a montagem também deve proporcionar liberdade suficiente de movimento para a excrescência da região do corpo posterior, sem afectar o seu desenvolvimento normal. Finalmente, deve haver um certo grau de versatilidade do método de montagem para permitir a imagiologia em diversas imagem set-ups. Aqui, apresentamos uma técnica de montagem para a imagiologia do desenvolvimento de posterior elongatio corpon no peixe-zebra D. rerio. Esta técnica envolve a montagem de embriões de tal forma que as regiões da cabeça e do saco vitelino são quase inteiramente incluídas no agarose, deixando de fora região do corpo posterior para alongar e desenvolver normalmente. Vamos mostrar como isso pode ser adaptado para microscopia de luz folhas na vertical, invertida e vertical set-ups. Embora este protocolo centra-se na montagem de embriões para a imagem latente para o corpo posterior, poderia ser facilmente adaptado para a imagem ao vivo de vários aspectos do desenvolvimento do peixe-zebra.

O protocolo descrito acima detalha uma técnica versátil para a montagem de embriões de peixes-zebra para imagiologia de lapso de tempo de longa duração. Um exemplo disto é mostrado na Figura 2A e na animação / vídeo Figura 1. Os embriões foram injectados no estádio de uma célula com o ARNm que codifica a proteína fluorescente photoconvertible kikumeGR. Na fase de 15 somito eles foram montados como descrito acima e trabalhada durante 12 horas...

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A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Um método de montagem versátil para Long Term Imagens de Desenvolvimento Zebrafish

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K visualizações.  Institut Pasteur. Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

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Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Biologia do Desenvolvimento

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Usando folha de luz microscopia de fluorescência para Imagem Desenvolvimento Zebrafish Eye

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

Dois fótons axotomia e lapso de tempo de imagem confocal em embriões de peixe-zebra ao vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Biologia

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

Dissecção e montagem lateral de embriões Zebrafish: Análise de Desenvolvimento da Medula Espinhal

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Neurociência

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

A longo prazo dispositivo de imagens ao vivo para melhor manipulação Experimental de larvas de Zebrafish

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Bioengenharia

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Multicamadas de montagem para longo prazo Microscopia de Luz Folha de Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

Imagem 4-Dimensional da Morfogense da Copa Óptica de Zebrafish

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

Layered Agar Mounting: Preparing Live Zebrafish Embryos for Long-Term Imaging with an Inverted Microscope

Source: Upadhyay S., et.al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60321/" target="_blank">A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This article describes a method to mount live zebrafish embryos for long term imaging. This method is cost effective and easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on Inverted Microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Montagem em ágar em camadas: Preparando embriões vivos de peixe-zebra para imagens de longo prazo com um microscópio invertido

Source: Upadhyay S., et.al. A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2020).
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