Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Te&#769;le&#769;thon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.

1. Preparación de soluciones y sacó la aguja de cristal <ol><li> Hacer una solución 25x social de Tricaína (3-amino éster etílico del ácido benzoico, también llamado acetato de 3-aminobenzoato) a 4 mg / ml en 20 mM Tris pH 8,8, y llevar esa solución es a pH 7. Una alícuota de 4 ml y almacenar a -20 ° C. NOTA: El Tricaína anestésico actúa preferentemente sobre los canales de sodio dependientes de voltaje neuronales bloqueando así espasmos musculares y el movimiento 6. </li><li> Hacer una solución de trabajo de tricaína a una concentración final de 0,17 mg / ml en medio de embrión E3. 7 NOTA: Hacer que el Tricaína solución de trabajo de manera extemporánea como el pH de esta solución se desplaza. </li><li> Disolver la agarosa de bajo punto de fusión a una concentración final de 1.5% en medio de embrión E3 en un tubo de 50 ml por calentamiento de la solución en un horno de microondas. Deje que esta solución se equilibre a 42 - 45 ° C, ya sea en un baño de agua o de sobremesa incubadora. Si la preparación de grandes platos para verticales-Hoja de luz de imagen (paso 4), hace 25 ml adicionales de 1% de agarosa de fusión estándar en medio de embrión E3. </li><li> Utilizar el vidrio de borosilicato con filamento capilares con unas dimensiones de 1,20 mm OD, ID 0,69 mm, longitud 10 mm. </li><li> Si se tira de los capilares del tipo de calefacción-filamento extractor de aguja se describe en la tabla de equipos y reactivos, utilice la siguiente configuración: Calor 600, 120 Tire, Velocidad 50, Tiempo 225, 500. Presión Con un par de pinzas cortantes, ruptura la aguja justo después del punto en el que se flexiona para crear una aguja limpio y afilado para orientar embriones y eliminar el exceso de agarosa. Un micro-bisturí también se puede utilizar para eliminar el exceso de agarosa. </li></ol> 2. Incorporación de embriones para Microscopía vertical o invertida <ol><li> Elevar los embriones hasta la etapa apropiada en medio de embrión E3. 7 </li><li> En la etapa requerida, embriones dechorionate con un par de pinzas cortantes debajo de una disección binocularting microscopio. </li><li> Incubar los embriones dechorionated durante al menos 5 min en la solución de trabajo de tricaína. </li><li> Una vez que la solución de agarosa fundida se ha enfriado a 45 ° C, utilizar una pipeta Pasteur de vidrio para transferir el embrión dechorionated directamente en el tubo de 50 ml con transferencia mínima de medio E3. </li><li> Eliminar embrión junto con aproximadamente 1 ml de medio de montaje y añadir aprox. 100 l de medio de montaje junto con el embrión al círculo central de un fondo de vidrio placa de Petri de 35 mm con un 10 mm de micropocillos. </li><li> Como está fijando el medio de montaje, mueva el embrión hasta el borde del círculo de agarosa con la cola hacia el exterior (Figura 1A). Utilice la aguja capilar para mantener el embrión en la orientación lateral deseada hasta que el gel se ajusta por completo. Para el desarrollo posterior del cuerpo de la imagen, tener cuidado de orientar el embrión en el lateral como una orientación de lo posible. Por lo tanto, mantener el embrión en esta posición por adjustmen cuidadosasts con la aguja capilar. NOTA: múltiples embriones se pueden añadir a la placa de montaje en este punto, si es necesario. Si este es el caso, transferir el bajo punto de fusión de agarosa en el plato primero y añadir los embriones para el centro de la gota de agarosa. A continuación, empuje los embriones a los bordes del anillo de vidrio y orientar en la posición deseada. Hasta seis embriones puede ser montado de esta manera antes de que la agarosa se solidifica. </li></ol> 3. Eliminación del exceso de agarosa alrededor del cuerpo posterior NOTA: En esta sección se describe el procedimiento mediante el cual se extrae de agarosa de la región que rodea el cuerpo posterior. En el caso de la elongación posterior del cuerpo, es importante asegurarse de que la cola puede crecer de salida normalmente. Mediante la eliminación de la agarosa después de que el embrión ha sido completamente incluida por agarosa, el embrión se deja encerrado por la región de la cabeza y aproximadamente la mitad del saco vitelino. <ol><li> Una vez que la caída de agarosa se ha puesto, inundar el di Petrish con la solución de trabajo Tricaína. </li><li> Bajo un microscopio binocular de disección con una base de luz transmitida, ajustar la posición del espejo y el ángulo de la luz incidente de tal manera que el fuerte contraste que permite que los recortes en la agarosa por verse claramente a través de la operación. </li><li> Para realizar corte 1 (Figura 1), utilizar la aguja capilar o la micro-bisturí para cortar la mitad de camino de agarosa a lo largo de la yema, desde una posición justo posterior al campo que forman el corazón a la posición de la somite 5 (el 5º somite anterior). </li><li> Iniciar el corte inicial adyacente al corazón formando como se muestra, y la forma completa a través de la agarosa al vidrio. </li><li> Mantenga el capilar o micro-bisturí en lo profundo de la agarosa, y poco a poco vio arriba y abajo mientras empezando a hacer una larga incisión sobre el embrión como muestra la Figura 1. Cortar tan cerca del embrión como sea posible sin perforar el embrión o yema de huevo. </li><li> A continuación, hacer cortes 2 y 3 (Figura 1 </strong&gt;), Partiendo de la posición en contra del embrión y con el corte va todo el camino hasta el fondo de cristal plato. Hacer cortada 2 de modo que es tangente a los primeros 5 somitas, lo que permite la plena dorsalward despliegue del cuerpo posterior. Hacer corte 3 en un ángulo de 90 ° con la superficie de la yema y a partir de la Heartfield. NOTA: Cortar la agarosa hasta que el borde del círculo de vidrio (como se muestra en la Figura 1) ayuda en la eliminación de la agarosa como un bloque completo (paso 3.6). Sin embargo, esto no es necesario. </li><li> Comenzando en la intersección de los cortes 1 y 3, hacer un corte en diagonal lenta hacia el final del corte 2, mientras que levantar lentamente hacia arriba con el fin de desalojar la plaza de agarosa que rodea el cuerpo posterior. Notas: En algunos casos, esto se dará a conocer en un solo bloque y la operación se completa de una sola vez. En otros, puede tomar varios intentos para dis-presenten el conjunto de agarosa que rodea al embrión. </li><li> Con un par de pinzas cortantes, retire la b desalojadocerraduras de agarosa del medio de embrión. Para ayudar en este proceso, mover las piezas de agarosa a un lado del plato y el uso de la pared de la placa de Petri como soporte mientras que el levantamiento de las piezas de agarosa. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55210/55210fig1.jpg" /> Figura 1: Diagramas de montaje Set-ups. (A) El diagrama muestra la posición del embrión montado dentro del anillo de vidrio centro de una placa de Petri. A la derecha es un enfoque del embrión con cada corte sucesivo a través de la que rodea agarosa muestran con líneas rojas dottted. (B) Los embriones montados se diagrama en vista lateral que muestra la facilidad de acceso para ambos objetivos invertidos y verticales. (C) Un digram similar que muestra cómo los embriones pueden ser montados para la hoja de luz vertical de imagen montajes. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55210/55210fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, cl</a>ick aquí para ver una versión más grande de esta figura. <ol start="9"><li> Si espasmos musculares no está completamente bloqueado en ese punto, añadir gotas de tricaína de la solución madre de 4 mg / ml, pH 7. </li></ol> 4. El montaje de los embriones de Luz-Hoja vertical Microscopía NOTA: Esta es una variación en el método descrito anteriormente que permite el acceso de múltiples objetivos para la obtención de imágenes de muestras por SPIM orientado verticalmente. La idea detrás de esta variación es levantar la muestra ligeramente más alto que el fondo del plato, para permitir un fácil acceso de los dos objetivos de formación de imágenes. <ol><li> Antes de muestrear de montaje, capa de un plástico placa de Petri de 100 mm con 1% de agarosa en medio E3 a una altura de 5 mm y dejar solidificar. </li><li> Colocar una gota de 1 ml de agarosa de bajo punto de fusión al centro del plato y dejar solidificar. </li><li> Insertar en embriones de agarosa de bajo punto de fusión como en el apartado 2. Sin embargo, esta vez, quitar el embrión desde el tubo de 50 mlde agarosa con una caída menor de la solución (0,5 ml) y colocar esta pequeña gota en la parte superior de la 1 ml caer en el centro del plato. </li><li> Utilice la aguja capilar para colocar el embrión en el centro de la pequeña gota y mantener su orientación correcta hasta que se establece gel. </li><li> Inundar el plato con la solución de trabajo Tricaína y eliminar el exceso de agarosa al igual que en la sección 3, pero sin cortar a través del colchón de agarosa al 1% estándar. </li></ol>

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	<li>Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Zebrafish+Embryonic+Brain+by+Confocal+Microscopy.">Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell-Resolution+Imaging+of+the+Impact+of+Notch+Signaling+and+Mitosis+on+Segmentation+Clock+Dynamics.">Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics.</a> Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).</li><li>Lawton, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+tissue+fluidity+steers+zebrafish+body+elongation.">Regulated tissue fluidity steers zebrafish body elongation.</a> Development. 140 (3), 573-582 (2013).</li><li>Dray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Fibronectin+Interactions+Propel+Vertebrate+Trunk+Elongation+via+Tissue+Mechanics.">Cell-Fibronectin Interactions Propel Vertebrate Trunk Elongation via Tissue Mechanics.</a> Curr Biol. 23 (14), 1335-1341 (2013).</li><li>Steventon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species+tailoured+contribution+of+volumetric+growth+and+tissue+convergence+to+posterior+body+elongation+in+vertebrates.">Species tailoured contribution of volumetric growth and tissue convergence to posterior body elongation in vertebrates.</a> Development. 143, 1732-1741 (2016).</li><li>Attili, S., Hughes, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetic+Tricaine+Acts+Preferentially+on+Neural+Voltage-Gated+Sodium+Channels+and+Fails+to+Block+Directly+Evoked+Muscle+Contraction.">Anaesthetic Tricaine Acts Preferentially on Neural Voltage-Gated Sodium Channels and Fails to Block Directly Evoked Muscle Contraction.</a> PLoS ONE. 9 (8), 103751-103756 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book, 5th Edition; A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2007).</li><li>Schr&#246;ter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+zebrafish+somitogenesis.">Dynamics of zebrafish somitogenesis.</a> Dev Dyn. 237 (3), 545-553 (2008).</li><li>Megason, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+toto+imaging+of+embryogenesis+with+confocal+time-lapse+microscopy.">In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods Mol Biol (Clifton, N.J.). 546, 317-332 (2009).</li><li>Sugiyama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cell-cycle+progression+in+the+developing+zebrafish+embryo.">Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo.</a> PNAS. 106 (49), 20812-20817 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Esta técnica de montaje permite que los embriones que se le mantenga aún durante la transferencia al microscopio y más de los experimentos de imagen de lapso de tiempo a largo plazo destinados a la elongación posterior del cuerpo después en múltiples escalas de longitud. Además, es versátil en que permite la formación de imágenes en ambos microscopía en posición vertical e invertida montajes, y una sugerencia se hace para cómo esto puede ser adaptado además para SPIM orientado verticalmente. <p class="...

Posterior elongación cuerpo es un proceso esencial en el desarrollo embrionario en la que el embrión se extiende para formar una gran parte del eje del cuerpo. Es un ejemplo de un proceso morfogenético complejo mediante el cual múltiples comportamientos celulares actúan coordinadamente para generar la morfogénesis en el nivel de los tejidos individuales. Estas deformaciones de tejido diferencial entonces actúan juntos para generar el alargamiento del cuerpo posterior en todo el nivel de la estructura. Para entender cómo estos procesos son controlados y coordinados durante el desarrollo, debemos ser capaces de seguir estos procesos en múltiples escalas (es decir, en el nivel de moléculas, células, las poblaciones de células y tejidos) y relacionar esto directamente a la morfogénesis de toda la estructura . embriones de pez cebra son ideales para la elongación posterior del cuerpo de imagen como su transparencia óptica y pequeño tamaño permite la aplicación de impresión débil mínimamente invasiva enfoques adecuados para live imágenes. 1 Esto se ha evidenciado por una serie de publicaciones recientes que han arrojado luz sobre el desarrollo posterior del cuerpo a nivel de moléculas, 2 células individuales, 3 e inter-tejido comportamientos, 4, así como a nivel de la población de células y órganos en general. 5 Las técnicas de imagen avanzadas, como confocal, microscopía multifotónica y el plano selectiva microscopía de iluminación (SPIM) están permitiendo la formación de imágenes a largo plazo de los procesos de desarrollo, con una disminución del efecto de la toxicidad de la luz y foto-blanqueo. se requieren técnicas robustas para el montaje de muestras vivas para lograr tres objetivos: 1) el apoyo suficiente para mantener las muestras en la orientación correcta durante la transferencia al microscopio y durante la adquisición, 2) la suficiente libertad de movimiento de la muestra para permitir la derivación de la región posterior del cuerpo sin afectar a su desa normalesrrollo y, finalmente, 3) un cierto grado de versatilidad del método de montaje para permitir la formación de imágenes en diversas imágenes montajes. Este protocolo presenta una técnica de montaje para la formación de imágenes el desarrollo del pez cebra D. rerio. Esta técnica consiste en embriones de montaje de tal manera que las regiones de la cabeza y el saco vitelino son casi totalmente incluyen en agarosa, dejando la región del cuerpo posterior para alargar y desarrollarse normalmente. Como tal, también es un método apropiado para la formación de imágenes a largo plazo de otras regiones del cuerpo en desarrollo como la agarosa permite obtener imágenes mediante técnicas de imagen la luz estándar. Este protocolo demuestra montaje de los embriones en una orientación lateral, aunque también es posible montar los embriones en orientaciones alterativas. Se mostrará aún más cómo adaptar el método para configuraciones de microscopía de luz hojas verticales, invertidos y verticales.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;CONSUMABLES&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass-bottomed dishes</td><td>Mattek</td><td>P35-1.5-10-C</td><td>35 mm Petri dish, 10 mm microwell. No. 1.5 cover glass</td></tr><tr><td>Capillaries for injection needles</td><td>&amp;nbsp;Sutter&amp;nbsp;</td><td>BF 120-94-10</td><td>We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work.</td></tr><tr><td>Micro-scalpel</td><td>Feather</td><td>P-715</td><td>Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle</td></tr><tr><td>Pasteur Pipettes</td><td></td><td></td><td>230 mm long</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;REAGENTS&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting point agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;EQUIPMENT&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps&amp;nbsp;</td><td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH&amp;nbsp;</td><td>11252-30&amp;nbsp;</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Needle puller&amp;nbsp;</td><td>Sutter&amp;nbsp;</td><td>P97</td><td>Heating-filament needle puller</td></tr><tr><td>Binocular dissecting microscope</td><td>Leica</td><td>S8 Apo</td><td></td></tr></tbody></table>

a versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development

embriones de pez cebra ofrecen un sistema experimental ideal para estudiar los procesos morfogenéticos complejos debido a su facilidad de acceso y la transparencia óptica. En particular, la elongación posterior del cuerpo es un proceso esencial en el desarrollo embrionario mediante el cual múltiples deformaciones de tejido actúan juntos para dirigir la formación de una gran parte del eje del cuerpo. Con el fin de observar este proceso mediante formación de imágenes de lapso de tiempo a largo plazo, es necesario utilizar una técnica de montaje que permite un apoyo suficiente para mantener las muestras en la orientación correcta durante la transferencia al microscopio y de adquisición. Además, el montaje también debe proporcionar la suficiente libertad de movimiento para la derivación de la región posterior del cuerpo sin afectar su desarrollo normal. Por último, debe haber un cierto grado de versatilidad del método de montaje para permitir la formación de imágenes en diversas imágenes set-ups. A continuación, presentamos una técnica de montaje para obtener imágenes del desarrollo de elongatio posterior del cuerpon en el pez cebra D. rerio. Esta técnica consiste en embriones de tal manera que las regiones de la cabeza y del saco vitelino son casi en su totalidad incluidos en agarosa de montaje, dejando fuera de la región posterior del cuerpo para alargar y desarrollarse normalmente. Vamos a mostrar cómo esto puede ser adaptado para su posición vertical, invertida y vertical de la ficha técnica de microscopía de luz montajes. Si bien este protocolo se centra en los embriones para obtener imágenes de la parte posterior del cuerpo de montaje, que podría adaptarse fácilmente para la formación de imágenes en vivo de varios aspectos del desarrollo del pez cebra.

El protocolo descrito anteriormente detalla una técnica versátil para el montaje de embriones de pez cebra para la imagen de lapso de tiempo a largo plazo. Un ejemplo de esto se muestra en la figura 2A y en animada / video Figura 1. Los embriones fueron inyectados en la etapa de 1 célula con ARNm que codifica la proteína fluorescente fotoconvertible kikumeGR. En la etapa 15 somite se montaron como se describió anteriormente y la imagen de 12 hr en u...

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A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K vistas.  Institut Pasteur. Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

Video: A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions. 
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.

Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.

Utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra Desarrollo

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Biología

Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene knockdown approaches can be utilized to examine the molecular mechanisms underlying nervous system development. Second, large clutches of developmentally synchronized embryos provide large experimental sample sizes. Third, the optical clarity of the zebrafish embryo permits researchers to visualize progenitor, glial, and neuronal populations. Although zebrafish embryos are transparent, specimen thickness can impede effective microscopic visualization. One reason for this is the tandem development of the spinal cord and overlying somite tissue. Another reason is the large yolk ball, which is still present during periods of early neurogenesis. In this article, we demonstrate microdissection and removal of the yolk in fixed embryos, which allows microscopic visualization while preserving surrounding somite tissue. We also demonstrate semipermanent mounting of zebrafish embryos. This permits observation of neurodevelopment in the dorso-ventral and anterior-posterior axes, as it preserves the three-dimensionality of the tissue.

Developmental processes such as proliferation, patterning, differentiation, and axon guidance can be readily modeled in the zebrafish spinal cord. In this article, we describe a mounting procedure for zebrafish embryos, which optimizes visualization of these events.

La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal

The zebrafish spinal cord is an effective investigative model for nervous system research for several reasons. First, genetic, transgenic and gene ...

Neurociencias

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Visualización del cerebro en desarrollo en el pez cebra vivo mediante imágenes confocales de barco iris y lapso de tiempo

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Dispositivo de proyección de imagen de vivo a largo plazo para mejor manipulación Experimental de larvas de pez cebra

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Bioingeniería

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

Multicapa de montaje para microscopía de luz Hoja de largo plazo del pez cebra

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

4-Dimensional Imaging of Zebrafish Optic Cup Morphogenesis

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of visual impairment, yet mechanisms of eye morphogenesis are still poorly understood. The basic organization of the embryonic eye is conserved throughout vertebrates, thus live imaging of zebrafish embryos has become a powerful approach to directly observe eye development at real time under normal and pathological conditions. Dynamic cell processes including movements, morphologies, interactions, division, and death can be visualized in the embryo. We have developed methods for uniform labeling of subcellular structures and timelapse confocal microscopy of early eye development in zebrafish. This protocol outlines the method of generating capped mRNA for injection into the 1-cell zebrafish embryo, mounting embryos at optic vesicle stage (~12 hours post fertilization, hpf), and performing multi-dimensional timelapse imaging of optic cup morphogenesis on a laser scanning confocal microscope, such that multiple datasets are acquired sequentially in the same imaging session. Such an approach yields data that can be used for a variety of purposes, including cell tracking, volume measurements, three-dimensional (3D) rendering, and visualization. Our approaches allow us to pinpoint the cellular and molecular mechanisms driving optic cup development, in both wild type and genetic mutant conditions. These methods can be employed directly by other groups or adapted to visualize many additional aspects of zebrafish eye development.

This protocol describes an approach for in toto labeling and multidimensional imaging of zebrafish early eye development. We describe labeling, embedding, and four dimensional (4D) imaging using laser scanning confocal microscopy, and considerations for optimizing acquisition of datasets for dissecting mechanisms of optic cup morphogenesis.

Imágenes en 4 dimensiones de la morfogénesis de la copa óptica del pez cebra

Visual system function requires the establishment of precise tissue and organ structures. In the vertebrate eye, structural defects are a common cause of ...

Layered Agar Mounting: Preparing Live Zebrafish Embryos for Long-Term Imaging with an Inverted Microscope

Source: Upadhyay S., et.al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/60321/" target="_blank">A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos</a>. J. Vis. Exp. (2020).
This article describes a method to mount live zebrafish embryos for long term imaging. This method is cost effective and easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on Inverted Microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

Montaje en agar en capas: preparación de embriones vivos de pez cebra para la obtención de imágenes a largo plazo con un microscopio invertido

Source: Upadhyay S., et.al. A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2020).
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