Name: activating autophagy by aerobic exercise in mice
Uploaded: 2017-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice at JoVE.com

We thank the Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratoryfor technical support and assistance, and Noboru Mizushima (University of Tokyo) for providing GFP-LC3 transgenic mice. A. R. and C. H. were supported by the startup funds from Northwestern University and the grant from National Institutes of Health (DK094980).

Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas pelo Comitê Animal Care Institucional e Use da Universidade Northwestern (IACUC). 1. mouse Models <ol><li> Use ratos 8-12 semanas de idade no treinamento físico. Para detectar autofagia induzida exercida in vivo, os ratinhos transgénicos usar GFP-LC3 (C57BL / 6, fundo) para estudos de imagiologia e murganhos C57BL / 6 para as análises bioquímicas. </li></ol> 2. Autophagy induzida pelo exercício <ol><li> Configuração de esteira - exercício forçado <ol><li> Aclimatar e treinar os ratos em um 10 ° esteira aberta para cima por 2 dias. No dia 1, exercer a ratos durante 5 min a 8 m / min, e no dia 2, exercer os ratos durante 5 min a 8 m / min, seguido por mais 5 min a 10 m / min 10. Incentivar os ratos para ser executado por cotovelada mão suave. </li><li> No 3º dia, deixou os ratos submetidos a uma única sessão de correr por 90 min no 10 ° subida esteira, starting a uma velocidade de 10 m / min. Após 40 minutos, aumente a velocidade da esteira a uma velocidade de 1 m / min a cada 10 min durante um total de 30 min, e em seguida aumentar a velocidade com a velocidade de 1 m / min a cada 5 minutos até atingir 17 m / min, para um total de 90 min de tempo de exercício e 1.070 metros de a distância de funcionamento. </li><li> Defina o estímulo elétrico na faixa de baixa intensidade (1,2 Hz), e incentivar os ratos que correr para evitar choques repetidos pé. </li><li> Para a coleta de tecidos, eutanásia os ratos por inalação de isoflurano, seguido por deslocamento cervical imediatamente após o exercício. Outros métodos de eutanásia aprovados também podem ser utilizados, tais como CO2 ou injecção IP de outros anestésicos. O nível de autofagia não parece ser afectado por métodos de eutanásia. </li></ol></li><li> Executar a instalação roda - exercício voluntário <ol><li> Coloque uma roda de execução do rato (11,4 cm de diâmetro) dentro de uma gaiola com um rato alojados individualmente. </li><li> Verificar a capacidade corrente e com uma conta-quilómetros de bicicleta.Configure o parâmetro de roda [distância (em mm) por rotação completa da roda] em 358 (11,4 * π). Medir a distância percorrida após 24 horas. </li><li> Deixe o mouse correr voluntariamente para 2 semanas com a roda de corrida. Para a coleta de tecidos, sacrificar o mouse na parte da manhã após o período de execução. </li></ol></li></ol> 3. Autophagy Avaliação Flux <ol><li> Para medir o fluxo autofágica sob repouso e exercício condições, tratar ratos com a cloroquina inibidor autofagia por três dias e compará-los com os ratinhos tratados com PBS. <ol><li> Dissolve-se cloroquina em PBS (5 mg / ml), e injectar cloroquina em ratinhos por via intraperitoneal na dose de 50 mg / kg / dia durante três dias consecutivos. Sacrificar os ratinhos e recolhem tecidos de 3 horas após a última injecção. </li><li> Para ratinhos exercidas, o pré-tratamento com cloroquina-los durante dois dias consecutivos, a uma dose de 50 mg / kg / dia. No terceiro dia, injectar os ratinhos com a mesma concentração de cloroquina, e depois90 min deixá-los correr na esteira por mais 90 min. </li><li> Eutanásia os ratos por inalação de isoflurano, seguido por deslocação cervical. Recolhe tecidos imediatamente após a execução, de modo que o tempo total de incubação de cloroquina é o mesmo que o controlo (de repouso) ratinhos (3 h). NOTA: Como alternativa, usar uma única injecção de cloroquina para determinar o fluxo autofagia em tecidos de ratinho. </li></ol></li></ol> 4. Tissue Colheita e Fixação <ol><li> Antes da colheita de tecido preparar a solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fresco a 4% de paraformaldeído (PFA, cuidado: equipamentos de protecção pessoal necessário) em PBS a um pH final de 7,4. Armazenar ambas as soluções a 4 ° C. </li><li> Encher 30 ml de seringa com 15 - 20 ml de 4% de PFA (para ratinhos GFP-LC3). Ligar a seringa com uma agulha G 20 cateter. </li><li> Depois do exercício, sacrificar os ratos por inalação de isoflurano, seguido por deslocação cervical. </li><li> Colocar o animal em uma superfície de trabalho limpa em seu back. Cortar e abrir a cavidade torácica, cortando o diafragma para expor o coração. </li><li> Fazer uma pequena incisão no fígado para permitir que o sangue sair, e injectar um total de 15 ml de 4% de PFA lentamente dentro do ventrículo direito do coração, através do cateter, até que o pulmão e fígado transformar completamente pálido. Perfundir o rato imediatamente após a sessão de exercício, usando uma bomba de seringa com um caudal constante de 90 ml / hr. </li><li> Após a perfusão, retire a agulha e recolher tecidos de interesse (por exemplo cerebrais 11 e no músculo esquelético). Para o músculo esquelético, dissecar vasto lateral. Resumidamente, puxar a pele da perna para trás para expor a musculatura, localizar os quadríceps 12, e dissecar vasto lateral, que é o músculo externo ligado à porção superior do osso femoral. </li><li> Para mais a fixação e a desidratação, colocar os tecidos de murganhos GFP-LC3 em PFA a 4% durante 24 h a 4 ° C, e, em seguida, transferi-los para 15%sacarose-PBS a 4 ° C durante a noite ou até que os tecidos tenham resolvido, e, em seguida, a 30% de sacarose-PBS a 4 ° C durante a noite ou durante mais tempo de armazenamento. Manter as amostras no escuro, tanto quanto possível uma vez que podem ser sensíveis a uma luz forte. </li><li> Para a análise Western Blot encaixe congelar os tecidos a partir de ratinhos C57BL / 6 directamente em azoto líquido, e armazená-las a -80 ° C. </li></ol> 5. Análise de Imagem de GFP-LC3 puncta <ol><li> processo de tecido <ol><li> Pré-tratamento dos tecidos (previamente fixas em PFA e armazenados em 30% de sacarose) em forma de incorporação tais como &quot;composto de temperatura óptima de corte&quot; (OCT) durante alguns minutos numa pequena placa de petri rotulados. </li><li> Transferir o tecido em um cryomold marcado contendo o suficiente fresco OCT para cobrir o tecido. Orient a superfície de corte para a parte inferior do cryomold (seção transversal para o músculo vasto lateral e corte sagital para o hemi-cérebro). Evitar a formação de bolhas. </li><li> freeze as amostras colocando a cryomold para poucos minutos em um aplicador coberto de espuma cheio de gelo seco, até que a OCT torna-se branca. Enrole amostras individuais em chapas marcadas, selá-los em um saco plástico, e armazená-los a -80 ° C durante a noite ou mais. </li><li> Use um criostato para cortar seções de amostra com uma espessura de 10 um, e montar as seções sobre os slides. Armazenar as lâminas a -20 ° C, e manter sempre as lâminas ao abrigo da luz, sempre que possível. </li></ol></li><li> preparação da lâmina <ol><li> Retirar as lâminas do congelador e descongelar-los à temperatura ambiente. Cobrir a secção de tecido com uma gota de meio de montagem com DAPI. Coloque uma lamela de tamanho adequado no topo e evitar a formação de bolhas. </li><li> Use unha polonês para selar as bordas da lamela, permitir que unha polonês para secar no escuro à temperatura ambiente, e, em seguida, armazenar as lâminas em um recipiente à prova de luz, a 4 ° C, ou prosseguir com captura de imagem de puncta GFP-LC3. </li></ol></li><li> &lt;strong&gt; Quantificação da GFP - LC3 puncta por microscopia de fluorescência <ol><li> Execute microscopia de epifluorescência, capturando imagens na mesma condição (de exposição e ajustes) para todas as amostras. Para GFP, usar um comprimento de onda de emissão de 525 nm; para DAPI, utilizar 490 nm. Adquirir, pelo menos, dez imagens por exemplo utilizando uma objectiva de 60X para vasto lateral e a região do córtex frontal do cérebro. </li><li> Quantificar o número de pontos lacrimais GFP-LC3 em uma área de tecido de 2,500 uM 2 em cada imagem para análise estatística, cego para os grupos experimentais. Calcule o número médio de 10 imagens de cada amostra, utilizando a função de medição automática de &quot;Contagem de Objetos&quot;. Definições para o músculo vasto lateral são: Limiar L = 10, H = 200; 2X suavizar; 1X limpo, e configurações para o córtex frontal do cérebro são: Limiar L = 11, H = 200; 2X suavizar; 1X limpo. </li></ol></li></ol> 6. Ocidental Análise Blot em Autophagy Markers <ol><li> &lt;strong&gt; processo Tissue <ol><li> Preparar o tampão de lise: Tris-HCl 50; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; 1% de Triton X-100; inibidor da protease e inibidores de fosfatase (recém-adicionado). </li><li> Remover o tecido de murganhos C57BL / 6 a partir de -80 ° C de armazenamento. Cortar o tecido muscular em pequenos pedaços com uma lâmina de barbear antes com o seguinte processo. Adicionar 800 uL (por hemi-cérebro), ou 500 ul (para vasto lateral) de tampão de lise frio para a amostra. Homogeneizar a amostra a 4 ° C com um homogeneizador a uma velocidade média. </li><li> Totalmente lisar a mistura homogeneizada durante mais 30 minutos a 1 hora a 4 ° C com rotação. </li><li> Girar o homogenato a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C, descartar o sedimento, e recolher o sobrenadante num novo tubo. </li></ol></li><li> análise de autofagia <ol><li> Determinar a concentração de proteína de lisados ​​de tecido, utilizando o kit de ensaio de BCA proteína de acordo com as especificações do fabricante. Normalizar cada amostraà mesma concentração. </li><li> Combinar a amostra com o tampão de amostra 2x Laemmli numa proporção de 1: 1, ferver a 95 ° C durante 5 - 10 min, e prosseguir com a análise de Western blot em autofagia marcadores 13, 14, tal como um anticorpo anti-p62 a p62 (, diluição de 1: 500) e anticorpo anti-LC3 LC3 (, diluição 1: 500). Ferver as amostras imediatamente após a adição do tampão de amostra, como mais tempo de incubação no gelo pode gerar múltiplas bandas degradadas de LC3. </li><li> Quantificar p62 e LC3 bandas por análise de densitometria usando ImageJ, e normalizar o valor para a banda de actina correspondente. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

A autofagia é um processo catabólico que fornece energia e reduz a citotoxicidade pela degradação lisossomal de componentes citoplasma ou organelas danificadas. Estudar a autofagia é importante compreender a regulação da homeostase celular e os mecanismos de resposta ao estresse. Novos modelos e metodologias estão a surgir no domínio da investigação 15, para estudar como autofagia deficiente contribui para inúmeros processos patológicos 16, 17. A perda de nutrientes (jejum) e a indução farmacológica são abordagens comumente usado para induzir autofagia in vitro e in vivo. Estes métodos, especialmente para modelos animais, podem mostrar efeitos adversos que podem influenciar os resultados globais. Por exemplo, uma vez que requer, pelo menos, 48 ​​horas de inanição de induzir um nível detectável de autofagia, os animais podem não ter energia necessária para a actividade motora normal, a qualafecta os resultados de muitos estudos comportamentais subsequentes. No entanto, os indutores farmacológicos podem também conduzir a efeitos colaterais, devido à sua falta de especificidade para a via autofagia. A principal rapamicina autofagia indutor e os seus derivados de suprimir a actividade da mTOR e causar disfunção metabólica e imunossupressão 18, 19, 20, que devem ser tidos em consideração na concepção experimental para o tratamento a longo prazo. Assim, temos vindo a trabalhar sobre as formas mais fisiológicas e robustos para a ativação da autofagia em modelos animais. Exercício recentemente, e outros têm identificado como uma forma eficaz, segura indutor autofagia mais rápido e in vivo 7, 8, 9. Ambos exercício forçado pela esteira e exercício voluntário executando roda têm sido usados ​​para analisar os efeitos do exercício sobre a autofagia umctivation, com variações na duração do exercício e intensidade 21, 22. Por exemplo, uma hora de esteira rolante (começando a uma velocidade de 10 m / min a um máximo de 40 m / min) induz lipidação abundante LC3 no músculo esquelético 21, e roda voluntária longo prazo executando durante 3 meses ou 4 - 5 semanas também aumenta basal autofagia e aumenta a expressão de proteínas no músculo esquelético autophagy 21, 22. Aqui nós descritos e comparados os dois métodos (esteira e rodas de corrida) para exercer ratos, e apresentou otimizado protocolos mais curtos com alta eficiência na indução de autofagia. Cada abordagem tem prós e contras. Uma única sessão de 90 minutos de exercício forçado em esteira é suficiente para induzir a autofagia no músculo esquelético e cérebro. Temos feito um curso de tempo de exercício em esteira 7, e descobriu que o exerciSE condições aqui descritas induzem o nível máximo de autofagia no músculo esquelético de rato, que também é validado por outros 23. Sob estas condições, os ratos submetidos a exercício aeróbico; Como relatado anteriormente, o exercício aeróbico é induzida pela execução prolongada com aumentos graduais na velocidade em uma escada rolante 24, 25, 26, ao passo que a condição anaeróbica é obtido por um curto período de exercício de alta intensidade, o que aumenta a massa muscular, mas não necessariamente aumentar o exercício endurance 27, 28. Além disso, a velocidade de corrida aqui relatados neste protocolo correlaciona-se positivamente com a capacidade de consumo de oxigênio, por métodos indirectos para avaliar a capacidade aeróbia 29. Portanto, o exercício aeróbico em esteira é uma maneira rápida e eficaz para induzir a autofagia. No entanto, forced executado em um espaço fechado pode exercer o estresse aos ratos. Assim, para evitar dar estresse adicional aos animais, usamos dedo cutuca ou borlas de fio como um método para manter os ratos correndo, em vez de o built-in choque elétrico. Em comparação com o tapete rolante, a utilização da roda de funcionamento tem muitas vantagens. É menos estressante, não requer tempo de observação dos pesquisadores, e é conveniente para estudar os efeitos a longo prazo da ativação autofagia. No entanto, o exercício em uma roda de corrida é voluntária e, portanto, gera variabilidade em termos de funcionamento de distância e velocidade entre os diferentes camundongos ou a mesma do mouse em dias diferentes. Portanto, é necessário executar os ratos de uma roda, por um período de tempo prolongado (por exemplo, várias semanas) para minimizar a variabilidade individual. Importante, a abordagem também requer o uso de um conta-quilómetros à noite para verificar se o mouse está atualmente em execução. Nós medimos a distância média de corrida de tipo selvagem C57BL / 6 ratos ao longo de um período de 2 semanas, e descobriu que eles correm aproximadamente 1 km / noite no início do treinamento (dia 1) e pode ser executado até 8 - 10 km / noite no dia 14. No geral, a roda de corrida é um método eficaz para estimular a autofagia na maioria dos órgãos, embora, é mais difícil para capturar acumulação autophagosome no músculo esquelético em relação ao uso da esteira. A razão é que o músculo esquelético tem um alto fluxo autophagic e uma velocidade de degradação rápida autophagosome, o que requer a colheita de tecido imediatamente após a execução para detectar a indução autofagia por medição de pontos lacrimais GFP-LC3. Em ambos os protocolos, rápida perfusão PFA e fixação dos tecidos após a eutanásia de animais é uma etapa crítica do processo para preservar as estruturas autophagosome que de outra forma facilmente degradados durante a dissecção. Este protocolo demonstra como usar o exercício aeróbico para estimular a autofagia em tecidos de camundongos, incluindo cérebro e músculo esquelético. Estes métodos podem ser utilizados para estudar os mecanismos da via autofagia na manutenção da função do tecido, como a manutenção mitocondrial 23, e para estudar os efeitos a longo prazo de indução de autofagia na regulação do comportamento e saúde de modelos de doenças dos animais, tais como melhorar os efeitos analgésicos da canabinóides 9. Tanto a esteira e rodas de corrida métodos induzir um bom nível de autofagia; no entanto, é importante considerar suas diferenças ao escolher a melhor abordagem para atender a diferentes objetivos de pesquisa.

Autophagy é uma via de degradação evolutivamente conservada, a qual é induzida em resposta a diversas condições de stress tais como hipoxia fome e 1, 2. Durante a autofagia, vesículas de dupla membrana, chamada autofagossomas, incorporar componentes subcelulares desnecessários ou danificados e transportá-los para lisossomos para degradação 3. Autofagia basal é essencial para a função celular e desenvolvimento organismo, e autofagia basal prejudicada está implicada em muitas doenças, incluindo a neurodegeneração, tumorigénese e diabetes 4, 5, 6 do tipo 2. O indutor autofagia fisiológico mais conhecido é fome. No entanto, tem duas limitações principais. Em primeiro lugar, a fome leva um longo período para induzir eficazmente a autofagia em animais, por exemplo, 48 horas de restrição alimentar em ratosna maioria dos órgãos. Em segundo lugar, apenas induz inanição autofagia cérebro, devido a um fornecimento de nutrientes relativamente estável no cérebro. Na verdade, também é difícil de detectar indução autofagia por indutores de pequenas moléculas, como muitas drogas não pode passar a barreira hemato-encefálica. Assim, para analisar melhor a função de activação autofagia na patogênese da doença, descobrimos recentemente que o exercício é um método fisiológico mais potente para induzir autofagia num curto período de tempo de 7, 8, 9. Em comparação com a fome, a autofagia é efetivamente induzido pela esteira correndo tão rápido quanto 30 min. Assim, o exercício é uma abordagem conveniente e potente fisiológico para estudar o mecanismo de autofagia na mediação de benefícios para a saúde e prevenção de doenças. Existem vários marcadores proteicos para a detecção de actividade autofagia, incluindo LC3 e p62. LC3 (associada a microtúbulos de proteína 1A / 1B-luz cHain 3) é uma proteína citosólica (LC3-I formam) que é conjugado com PE (fosfatidiletanolamina) após indução autofagia. LC3 PE-lipidada (forma LC3-II) é recrutado para membranas autophagosomal e pode ser usado para visualizar autofagossomas quando marcado com GFP. A sua translocação para o citosol a partir de estruturas puntiformes de autofagossomas sob microscopia é uma indicação da indução autofagia. p62 é um receptor de carga para substratos autophagy (tais como proteínas de ubiquitinação), e é incorporado autofagossomas bem. Uma vez que a proteína é degradada em lisossomas, juntamente com autofagossomas, os seus níveis podem ser usadas para medir o fluxo de autofagia. Aqui nós mostramos como utilizar esses marcadores para quantificar a autofagia em diferentes tecidos de camundongos induzida por exercício aeróbico, incluindo exercício forçado (esteira) e exercício voluntário (rodas de correr). Os mesmos procedimentos podem também ser aplicados para a medição in vivo de autofagia após o tratamento de outros indutores.

<table><tbody><tr><td>Treadmill</td><td>Columbus Instruments</td><td>150-RM Exer 3/6</td><td></td></tr><tr><td>Mouse running wheel</td><td>Super Pet</td><td>100079365</td><td>diameter 11.4 cm</td></tr><tr><td>Odometer</td><td>Bell</td><td>DASHBOARD 100</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>Model: inverted microscope ECLIPSE</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 1850UV</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>IKA</td><td>003737001 / Model: T10 Basic S1</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquine</td><td>CAYMAN CHEMICAL COMPANY</td><td>14194</td><td></td></tr><tr><td>Parafolmaldehye</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P6148</td><td>Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer.</td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>p62 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610833</td><td></td></tr><tr><td>LC3 antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

activating autophagy by aerobic exercise in mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Este protocolo descreve dois métodos diferentes para induzir a autofagia em tecidos de camundongos por exercício aeróbico: um total de 90 min de exercício forçado em uma esteira multi-lane passou por dois dias de aclimatação; ou duas semanas de exercício voluntário em uma roda de corrida usados ​​por camundongos alojados individualmente. Em cada protocolo de exercício, podemos medir o fluxo autofagia por microscopia de fluorescência e análise western blot em vários órgãos. Nós usamos uma linha de rato transgénico expressando LC3 GFP como um sistema repórter para monitorizar a autofagia pelo exercício 1. Após a indução autofagia, LC3 transloca desde o citosol para o autophagosome em estruturas puntiformes. Depois de cortar, a formação de pontos lacrimais GFP-LC3 pode ser directamente visualizadas por microscopia de fluorescência (Figura 1A). Alternativamente, as estruturas podem ser também autophagosome imunocoradas por um anticorpo para a LC3imagiologia. De qualquer 90 min de exercício esteira ou 2 semanas de corrida voluntária aumentou o número de pontos lacrimais GFP-LC3 em ambos músculo esquelético (músculo vasto lateral) e córtex cerebral, em comparação à condição de repouso (Figura 1B). Deve notar-se que a região do córtex frontal tem sido a principal região no cérebro onde é claramente autofagia induzida por qualquer um dos métodos até agora. Exercício também induziu a conversão de LC3 a partir da forma citosólica (LC3-I) para a forma conjugados com lípidos (LC3-II), que pode ser detectada por análise de Western blot (Figura 1C). incremento induzida pelo exercício de autofagossomas (representados por LC3-II e GFP-LC3 pontos lacrimais) é devido a um fluxo autophagic elevada, em vez de um bloco na degradação autophagosome, avaliada pelo uso de inibidores da degradação lisossomal, tal como a bafilomicina A1 ou cloroquina . Aqui nós medimos a degradação do p62 do receptor de carga autophagic como um examplo. Exercício (90 min de esteira) provocou uma degradação mais elevado de p62 no músculo esquelético do que a condição de repouso, o qual foi resgatada por injecção com cloroquina antes do exercício (Figura 2). Os resultados similares também são observados com exercício voluntário executando rodas. Assim, o exercício aeróbico por esteira ou rodas de correr induz a autofagia in vivo, medido pelo nível de estado estacionário de LC3 e a degradação da p62. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55099/55099fig1.jpg" /> Figura 1. Exercício aeróbico Induz Autophagy no mouse tecidos. Imagens representativas (A) e quantificação (B) dos pontos lacrimais GFP-LC3 no músculo esquelético (músculo vasto lateral) e cérebro (córtex frontal) dos ratinhos transgénicos GFP-LC3 sob a condição de controle (em repouso), Após 90 min de exercício forçado (esteira ) ou após 2 semanas de exercício voluntário (roda). Resultados representam a média ± SEM de 10 fotos por mouse. N = 5 ratinhos. Foram utilizados os seguintes comprimentos de onda de emissão: GFP - 525 nm; DAPI - 490 nm. (C) a detecção de Western blot de LC3 no músculo esquelético (vasto lateral) de camundongos descansado e exercitados (pela esteira). dados de quantificação representam o nível de LC3-II normalizado para actina (esquerda) e a proporção de LC3-II para LC3-I (direita). N = 3 ratos. Estatística é comparar cada valor para a amostra de controlo. Os resultados representam a média ± sem *, P &lt;0,05; **, P &lt;0,01; ***, P &lt;0,001, teste t. Barra de escala, 25 um. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55099/55099fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55099/55099fig2.jpg" /> Figura 2. O exercício aumenta Autophagy Flux no mouse Skeletal Muscle. (A) Western blotdetecção de p62 no vasto lateral de ratos descansado e exercidas na presença ou ausência da cloroquina inibidores do lisossoma. (B) (esquerda) Quantificação da análise de p62 normalizada para a banda de actina correspondente. (Direita) O fluxo de p62 é determinada subtraindo-se o valor densitométrico normalizada de p62 tratado com PBS a partir de que p62 tratadas com cloroquina. Os resultados representam a média ± SEM n = 3 ratos. *, P &lt;0,05, teste-t. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55099/55099fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Autophagy activação é benéfico na prevenção de uma série de doenças. Uma das abordagens fisiológicas para induzir autofagia in vivo é o exercício físico. Aqui nós mostramos como ativar a autofagia pelo exercício aeróbico e medir os níveis de autofagia em camundongos.

Ativando Autophagy pelo exercício aeróbio em ratos

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.8K visualizações.  Northwestern University.  Autophagy activação é benéfico na prevenção de uma série de doenças. Uma das abordagens fisiológicas para induzir autofagia in vivo é o exercício físico. Aqui nós mostramos como ativar a autofagia pelo exercício aeróbico e medir os níveis de autofagia em camundongos. 

Vídeo: Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

Assessment of Murine Exercise Endurance Without the Use of a Shock Grid: An Alternative to Forced Exercise

Using laboratory mouse models, the molecular pathways responsible for the metabolic benefits of endurance exercise are beginning to be defined. The most common method for assessing exercise endurance in mice utilizes forced running on a motorized treadmill equipped with a shock grid. Animals who quit running are pushed by the moving treadmill belt onto a grid that delivers an electric foot shock; to escape the negative stimulus, the mice return to running on the belt. However, avoidance behavior and psychological stress due to use of a shock apparatus can interfere with quantitation of running endurance, as well as confound measurements of postexercise serum hormone and cytokine levels. Here, we demonstrate and validate a refined method to measure running endurance in na&#239;ve C57BL/6 laboratory mice on a motorized treadmill without utilizing a shock grid. When mice are preacclimated to the treadmill, they run voluntarily with gait speeds specific to each mouse. Use of the shock grid is replaced by gentle encouragement by a human operator using a tongue depressor, coupled with sensitivity to the voluntary willingness to run on the part of the mouse. Clear endpoints for quantifying running time-to-exhaustion for each mouse are defined and reflected in behavioral signs of exhaustion such as splayed posture and labored breathing. This method is a humane refinement which also decreases the confounding effects of stress on experimental parameters.

A method to assess exercise endurance in laboratory mice without the use of a shock grid is demonstrated. This method is a humane refinement that can decrease the confounding effects of stress on experimental parameters.

Avaliação da Murino exercício de resistência sem o uso de um choque grade: uma alternativa para o exercício forçado

Using laboratory mouse models, the molecular pathways responsible for the metabolic benefits of endurance exercise are beginning to be defined. The most ...

Comportamento

Supramaximal Intensity Hypoxic Exercise and Vascular Function Assessment in Mice

Exercise training is an important strategy for maintaining health and preventing many chronic diseases. It is the first line of treatment recommended by international guidelines for patients suffering from cardiovascular diseases, more specifically, lower extremity artery diseases, where the patients' walking capacity is considerably altered, affecting their quality of life. 
Traditionally, both low continuous exercise and interval training have been used. Recently, supramaximal training has also been shown to improve athletes' performances via vascular adaptations, amongst other mechanisms. The combination of this type of training with hypoxia could bring an additional and/or synergic effect, which could be of interest for certain pathologies. Here, we describe how to perform supramaximal intensity training sessions in hypoxia on healthy mice at 150% of their maximal speed, using a motorized treadmill and a hypoxic box. We also show how to dissect the mouse in order to retrieve organs of interest, particularly the pulmonary artery, the abdominal aorta, and the iliac artery. Finally, we show how to perform ex vivo vascular function assessment on the retrieved vessels, using isometric tension studies.

High-intensity training in hypoxia is a protocol that has been proven to induce vascular adaptations potentially beneficial in some patients and to improve athletes&#39; repeated sprint ability. Here, we test the feasibility of training mice using that protocol and identify those vascular adaptations using ex vivo vascular function assessment.

Supramaximal intensidade exercício hipóxica e avaliação da função Vascular em ratos

Exercise training is an important strategy for maintaining health and preventing many chronic diseases. It is the first line of treatment recommended by ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

Aplicação da estimulação crônica para estudar ratos induzida pela atividade contrátil adaptações fenotípica de músculo esquelético

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Biologia do Desenvolvimento

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

Cecal ligadura e punção induzida Sepsis como um modelo para estudar a autofagia em Ratos

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Imunologia e Infecção

Short Session High Intensity Interval Training and Treadmill Assessment in Aged Mice

High intensity interval training (HIIT) is emerging as a therapeutic approach to prevent, delay, or ameliorate frailty. In particular short session HIIT, with regimens less than or equal to 10 min is of particular interest as several human studies feature routines as short as a few minutes a couple times a week. However, there is a paucity of animal studies that model the impacts of short session HIIT. Here, we describe a methodology for an individually tailored and progressive short session HIIT regimen of 10 min given 3 days a week for aged mice using an inclined treadmill. Our methodology also includes protocols for treadmill assessment. Mice are initially acclimatized to the treadmill and then given baseline flat and uphill treadmill assessments. Exercise sessions begin with a 3 min warm-up, then three intervals of 1 min at a fast pace, followed by 1 min at an active recovery pace. Following these intervals, the mice are given a final segment that starts at the fast pace and accelerates for 1 min. The HIIT protocol is individually tailored as the speed and intensity for each mouse are determined based upon initial anaerobic assessment scores. Additionally, we detail the conditions for increasing or decreasing the intensity for individual mice depending on performance. Finally, intensity is increased for all mice every two weeks. We previously reported in this protocol enhanced physical performance in aged male mice and here show it also increases treadmill performance in aged female mice. Advantages of our protocol include low administration time (about 15 min per 6 mice, 3 days a week), strategy for individualizing for mice to better model prescribed exercise, and a modular design that allows for the addition or removal of the number and length of intervals to titrate exercise benefits.

Short session (&#8804;10 min) high intensity interval training (HIIT) is emerging as an alternative to longer exercise modalities, yet the shorter variants are rarely modeled in animal studies. Here, we describe a 10 min, 3 day a week, uphill treadmill HIIT protocol that enhances physical performance in male and female aged mice.

Avaliação de esteira em ratos envelhecidos e curta sessão de alta intensidade de treinamento intervalado

High intensity interval training (HIIT) is emerging as a therapeutic approach to prevent, delay, or ameliorate frailty. In particular short session HIIT, ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Coloração imunofluorescente in situ de autofagia em células estaminais musculares

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Biologia

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and further explore whether its mechanism is related to the impact of mitophagy. This study also aimed to demonstrate the therapeutic effect of safflower acid on oxidative stress in cardiomyocytes and explore whether its mechanism is related to the effect of mitophagy. Here, an H2O2-based oxidative stress model was constructed and assessed the degree of oxidative stress injury of cardiomyocytes by detecting the levels of lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK), malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GSH Px). Reactive oxygen species (ROS)-detecting fluorescent dye DCFH-DA, JC-1 dye, and TUNEL dye were employed to assess mitochondrial damage and apoptosis. Autophagic flux was measured by transfecting Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirus. Mitophagy-related proteins were then detected via western blotting and immunofluorescence. However, crocetin (0.1-10 &#181;M) could significantly improve cell viability and reduce apoptosis and oxidative stress damage caused by H2O2. In cells with excessive autophagic activation, crocetin could also reduce autophagy flow and the expression of mitophagy-related proteins PINK1 and Parkin, and reverse the transfer of Parkin to mitochondria. Crocetin could reduce H2O2-mediated oxidative stress damage and the apoptosis of H9c2 cells, and its mechanism was closely related to mitophagy.

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

Based on in vitro experiments, this study revealed the mechanism of crocetin in repairing oxidative stress damage of cardiomyocytes by influencing mitophagy, in which the PINK1/Parkin signaling pathway plays an important role.

Proteção de Células Miocárdicas H9c2 contra o Estresse Oxidativo por Crocetina via Mitofagia Mediada pela Via PINK1/Parkin

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and ...

Medicina

Explorando intervenções de exercícios T2DM: um dispositivo de treinamento estático para camundongos

Static Strength Training Method for Type 2 Diabetic Mice

The treatment of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a major difficulty in improving patient health. Exercise is one of the main interventions for T2DM. Static strength training is one of the key forms of traditional sports in China. Research shows that static strength training is an effective clinical method for T2DM intervention, but there is no experimental device suitable for static training in mice. One of the difficulties in moving from clinical to basic research is to design appropriate experimental devices. In order to further study the mechanism of static training intervention in T2DM, a simple method for making a static training device for mice is introduced in this paper. This device has the advantages of simple operation, cheap material, and high feasibility. Previous studies conducted under this protocol have shown that static training can effectively reduce blood glucose levels and improve the mitochondrial function of skeletal muscle cells in T2DM mice. The purpose of introducing this device is to promote research on the mechanism of traditional exercise in the intervention of T2DM and to lay a foundation for the quantitative intervention of exercise.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa do diabetes com treinamento de exercícios estáticos em camundongos

This protocol provides a simple method of making static training equipment for mice. The device maintains the muscle isometric contraction of the limbs of mice so as to verify the intervention effect of traditional exercise on type 2 diabetes (T2DM) and provides new exercise therapy for the clinical treatment of T2DM.

Método de treinamento de força estática para camundongos diabéticos tipo 2

The treatment of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a major difficulty in improving patient health. Exercise is one of the main interventions for T2DM. ...

Ativando Autophagy pelo exercício aeróbio em ratos

Resumo

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Avaliação da Murino exercício de resistência sem o uso de um choque grade: uma alternativa para o exercício forçado

Supramaximal intensidade exercício hipóxica e avaliação da função Vascular em ratos

Aplicação da estimulação crônica para estudar ratos induzida pela atividade contrátil adaptações fenotípica de músculo esquelético

Cecal ligadura e punção induzida Sepsis como um modelo para estudar a autofagia em Ratos

Avaliação de esteira em ratos envelhecidos e curta sessão de alta intensidade de treinamento intervalado

Coloração imunofluorescente in situ de autofagia em células estaminais musculares

Proteção de Células Miocárdicas H9c2 contra o Estresse Oxidativo por Crocetina via Mitofagia Mediada pela Via PINK1/Parkin

Método de treinamento de força estática para camundongos diabéticos tipo 2

Método de treinamento de força estática para camundongos diabéticos tipo 2

Método de treinamento de força estática para camundongos diabéticos tipo 2