Name: activating autophagy by aerobic exercise in mice
Uploaded: 2017-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice at JoVE.com

We thank the Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratoryfor technical support and assistance, and Noboru Mizushima (University of Tokyo) for providing GFP-LC3 transgenic mice. A. R. and C. H. were supported by the startup funds from Northwestern University and the grant from National Institutes of Health (DK094980).

Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida approvate dal Comitato Northwestern University istituzionale cura degli animali e Usa (IACUC). 1. modelli murini <ol><li> Utilizzare 8-12 settimane di età topi nella formazione esercizio. Per rilevare l&#39;autofagia esercitato indotta in vivo, utilizzare il topi transgenici GFP-LC3 (C57BL / 6 di fondo) per studi di imaging e C57BL / 6 topi per le analisi biochimiche. </li></ol> 2. L&#39;autofagia indotta da esercizio <ol><li> Messa a punto Treadmill - esercizio forzata <ol><li> Acclimatarsi e formare i topi in un 10 ° in salita tapis roulant aperto per 2 giorni. Il giorno 1, esercitare i topi per 5 min a 8 m / min, e il giorno 2, esercitare i topi per 5 min a 8 m / min seguito da un altro 5 min a 10 m / min 10. Incoraggiare i topi per eseguire delicatamente gomitata mano. </li><li> Il giorno 3 °, lasciare che i topi sottoposti a un singolo attacco di corsa per 90 minuti a 10 ° in salita tapis roulant, starting alla velocità di 10 m / min. Dopo 40 min, aumentare la velocità treadmill ad una velocità di 1 m / min ogni 10 min per un totale di 30 min, e quindi aumentare la velocità alla velocità di 1 m / min ogni 5 min fino a raggiungere 17 m / min, per un totale di 90 minuti di tempo di esercizio e 1.070 metri di corsa a distanza. </li><li> Impostare lo stimolo elettrico ad una gamma bassa intensità (1,2 Hz), e incoraggiare i topi a correre per evitare scosse piede ripetuto. </li><li> Per la raccolta dei tessuti, eutanasia i topi per inalazione isoflurano, seguita da dislocazione cervicale immediatamente dopo l&#39;esercizio. Altri metodi approvati eutanasia possono anche essere utilizzati, come CO2 o iniezione IP di altri anestetici. Il livello di autofagia non sembra essere influenzata da metodi di eutanasia. </li></ol></li><li> Messa a punto della ruota Running - esercizio volontario <ol><li> Posizionare una rotella del mouse-esecuzione (11,4 cm) all&#39;interno di una gabbia con un mouse a singolo alloggiati. </li><li> Verificare la capacità corrente con una contachilometri bicicletta.Impostare il parametro della ruota [distanza (in mm) per ogni rotazione completa della ruota] a 358 (11.4 * π). Misurare la distanza in esecuzione dopo 24 ore. </li><li> Lasciate il mouse correre volontariamente per 2 settimane con la ruota in esecuzione. Per la raccolta dei tessuti, sacrificare il mouse al mattino dopo il periodo di esecuzione. </li></ol></li></ol> 3. L&#39;autofagia Flux valutazione <ol><li> Per misurare il flusso autofagica in condizioni di riposo e di esercizio, trattare i topi con la clorochina inibitore autofagia per tre giorni e confrontarle con topi trattati con PBS. <ol><li> Sciogliere clorochina in PBS (5 mg / ml), e iniettare clorochina in topi per via intraperitoneale alla dose di 50 mg / kg / giorno per tre giorni consecutivi. Sacrificio topi e raccogliere i tessuti 3 ore dopo l&#39;ultima iniezione. </li><li> Per i topi esercitati, li pretrattare con clorochina per due giorni consecutivi alla dose di 50 mg / kg / giorno. Il terzo giorno, iniettare i topi con la stessa concentrazione di clorochina, e dopo90 min li fanno correre sul tapis roulant per altri 90 min. </li><li> Euthanize topi per inalazione isoflurano, seguita da dislocazione cervicale. Raccogliere tessuti immediatamente dopo l&#39;esecuzione, in modo che il tempo totale di incubazione della clorochina è la stessa di controllo (a riposo) topi (3 ore). NOTA: In alternativa, utilizzare una singola iniezione di clorochina per determinare il flusso autofagia nei tessuti di topo. </li></ol></li></ol> 4. Tessuto Raccolta e Fixation <ol><li> Prima della raccolta dei tessuti preparare tampone fosfato salino (PBS) e fresca 4% paraformaldeide (PFA, attenzione: dispositivi di protezione individuale richiesto) in PBS a un pH finale di 7,4. Conservare entrambe le soluzioni a 4 ° C. </li><li> Riempire 30 ml siringa con 15 - 20 ml di PFA 4% (per i topi GFP-LC3). Collegare la siringa con un ago G 20 del catetere. </li><li> Dopo l&#39;esercizio, eutanasia i topi per inalazione isoflurano, seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Posto l&#39;animale su una superficie di lavoro pulita sul suo back. Tagliare e aprire la cavità toracica tagliando il diaframma per esporre il cuore. </li><li> Effettuare una piccola incisione sul fegato per lasciare il sangue uscire, e iniettare un totale di 15 ml 4% PFA lentamente nel ventricolo destro del cuore attraverso il catetere, fino al polmone e fegato girare completamente pallido. Profumato il mouse immediatamente dopo la sessione di esercizio, utilizzando una pompa a siringa con una portata costante di 90 ml / h. </li><li> Dopo la perfusione, rimuovere l&#39;ago e raccogliere i tessuti di interesse (ad esempio, del cervello 11 e muscolo scheletrico). Per muscolo scheletrico, sezionare vasto laterale. Brevemente, tirare la pelle della gamba all&#39;indietro per esporre i muscoli, localizzare il quadricipite femorale 12 e sezionare vasto laterale, che è il muscolo esterno collegato alla parte superiore dell&#39;osso femorale. </li><li> Per ulteriori fissazione e disidratazione, posizionare i tessuti di topi GFP-LC3 in 4% PFA per 24 ore a 4 ° C, e poi trasferirli al 15%saccarosio-PBS a 4 ° C durante la notte o fino a quando i tessuti sono stabiliti, e quindi al 30% di saccarosio-PBS a 4 ° C durante la notte o per più lunghi periodi. Conservare i campioni al buio per quanto possibile in quanto possono essere sensibili a luce intensa. </li><li> Per l&#39;analisi Western Blot scatto congelare i tessuti da C57BL / 6 topi direttamente in azoto liquido, e conservare a -80 ° C. </li></ol> 5. Analisi Imaging di GFP-LC3 Puncta <ol><li> processo Tissue <ol><li> Pre-trattare i tessuti (precedentemente fissate in PFA e conservati nel 30% di saccarosio) nel mezzo di inclusione come &quot;ottimali di taglio composto temperatura&quot; (OCT) per pochi minuti in una piccola capsula di Petri etichettati. </li><li> Trasferire il tessuto in una cryomold l&#39;etichetta che contiene abbastanza fresco di Office per coprire il tessuto. Orient superficie sezionamento verso il fondo della cryomold (sezione per il muscolo vasto laterale e sezione sagittale per la emi-cervello). Evitare la formazione di bolle. </li><li> freÈze campioni ponendo il cryomold per pochi minuti in un dispositivo di raffreddamento di schiuma coperto riempito con ghiaccio secco, fino PTOM diventa bianco. Avvolgere singoli campioni in fogli etichettati, chiuderli in un sacchetto di plastica, e conservarli a -80 ° C durante la notte o più a lungo. </li><li> Utilizzare un criostato per tagliare le sezioni di esempio con uno spessore di 10 micron, e montare le sezioni sulle slitte. Conservare i vetrini a -20 ° C, e sempre tenere i vetrini al riparo dalla luce, quando possibile. </li></ol></li><li> preparazione del vetrino <ol><li> Estrarre i vetrini dal congelatore e scongelare a temperatura ambiente. Coprire la sezione di tessuto con una goccia di mezzo di montaggio con DAPI. Collocare un vetrino di dimensioni adeguate in cima ed evitare la formazione di bolle. </li><li> Utilizzare smalto per sigillare i bordi del vetrino, consentire smalto si asciughi al buio a temperatura ambiente, e quindi memorizzare le diapositive in un contenitore a tenuta di luce a 4 ° C, o procedere con l&#39;imaging cattura di GFP-LC3 puncta. </li></ol></li><li> &lt;strong&gt; La quantificazione di GFP - LC3 puncta al microscopio a fluorescenza <ol><li> Eseguire epifluorescenza, catturando le immagini nella stessa condizione (esposizione e le impostazioni) per tutti i campioni. Per GFP, utilizzare una lunghezza d&#39;onda di emissione di 525 nm; per DAPI, usare 490 nm. Acquisire almeno dieci immagini al campione utilizzando un obiettivo 60X per vasto laterale e la regione della corteccia frontale del cervello. </li><li> Quantificare il numero di GFP-LC3 puncta in una zona di tessuto di 2.500 micron 2 in ogni immagine per l&#39;analisi statistica, accecato per gruppi sperimentali. Calcolare il numero medio di 10 immagini di ogni campione, utilizzando la funzione di misura automatica di &quot;conteggio degli oggetti&quot;. Impostazioni per il muscolo vasto laterale sono: Soglia L = 10, H = 200; 2X liscia; 1X pulito, e le impostazioni per la corteccia frontale del cervello sono: Soglia L = 11, H = 200; 2X liscia; 1X pulito. </li></ol></li></ol> 6. occidentale Analisi Blot su autofagia Marcatori <ol><li> &lt;strong&gt; processo Tissue <ol><li> Preparare il tampone di lisi: 50 mM Tris-HCl; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; inibitore della proteasi e inibitori della fosfatasi (appena aggiunto). </li><li> Rimuovere il tessuto di C57BL 6 topi / da -80 ° C di stoccaggio. Tagliare il tessuto muscolare in piccoli pezzi con una lama di rasoio prima il seguente processo. Aggiungere 800 ml (per emi-cervello) o 500 ml (per vasto laterale) di tampone di lisi freddo al campione. Omogeneizzare il campione a 4 ° C con un omogeneizzatore ad una velocità media. </li><li> Completamente lisare la miscela omogeneizzata per altri 30 minuti per 1 ora a 4 ° C con rotazione. </li><li> Centrifugare l&#39;omogeneizzato a 12.000 xg per 10 min a 4 ° C, scartare il pellet, e raccogliere il surnatante in una nuova provetta. </li></ol></li><li> analisi autofagia <ol><li> Determinare la concentrazione di proteine ​​di lisati di tessuto utilizzando il kit di test BCA Protein in base alle specifiche del costruttore. Normalizzare ogni campionealla stessa concentrazione. </li><li> Unire il campione con il tampone 2x Laemmli in un rapporto 1: 1, far bollire a 95 ° C per 5 - 10 minuti, e procedere con l&#39;analisi Western Blot su autofagia marcatori 13, 14, come ad esempio P62 (anticorpo anti-P62, diluizione 1: 500) e LC3 (anticorpo anti-LC3, diluizione 1: 500). Lessare i campioni immediatamente dopo l&#39;aggiunta del tampone, come più incubazione in ghiaccio può generare più bande degradate LC3. </li><li> Quantificare P62 e LC3 bande di analisi densitometria utilizzando ImageJ, e normalizzare il valore al corrispondente banda di actina. </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Autofagia è un processo catabolico che fornisce energia e riduce citotossicità dalla degradazione lisosomiale di anticitoplasma o organelli danneggiati. Studiare l&#39;autofagia è importante capire la regolazione dell&#39;omeostasi cellulare e meccanismi di risposta allo stress. Nuovi modelli e metodologie stanno emergendo nel campo della ricerca 15, per studiare come alterata autofagia contribuisce a numerosi processi patologici 16, 17. Privazione di nutrienti (inedia) e induzione farmacologica sono comunemente usati approcci per indurre autofagia in vitro e in vivo. Questi metodi, in particolare per i modelli animali, possono mostrare effetti negativi che possono influenzare i risultati complessivi. Ad esempio, dal momento che richiede almeno 48 ore di fame per indurre un livello rilevabile dell&#39;autofagia, gli animali non possono avere l&#39;energia necessaria per l&#39;attività motoria regolare,colpisce il risultato di molti studi comportamentali successivi. Eppure induttori farmacologici possono anche portare ad effetti collaterali a causa della loro mancanza di specificità al percorso autofagia. Il principale rapamicina autofagia induttore e suoi derivati sopprimere l&#39;attività di mTOR e causano disfunzioni metaboliche e immunosoppressione 18, 19, 20, che dovrebbe essere preso in considerazione nel progetto sperimentale per il trattamento a lungo termine. Così, abbiamo lavorato sui modi più fisiologico e robusti per l&#39;attivazione dell&#39;autofagia in modelli animali. Esercizio Recentemente noi ed altri hanno identificato come un efficace, sicuro autofagia induttore velocemente e in vivo 7, 8, 9. Entrambi esercizio costretto da tapis roulant e esercizio volontario eseguendo ruota sono stati utilizzati per analizzare gli effetti dell&#39;esercizio fisico sulla autofagia unctivation, con variazioni di durata e di intensità di esercizio 21, 22. Ad esempio, un&#39;ora di treadmill in esecuzione (Avvio a velocità di 10 m / min fino ad un massimo di 40 m / min) induce abbondante lipidation LC3 nel muscolo scheletrico 21, e la ruota volontaria a lungo termine in esecuzione per 3 mesi o 4 - 5 settimane aumenta anche basali autofagia e aumenta l&#39;espressione delle proteine autofagia nel muscolo scheletrico 21, 22. Qui abbiamo descritto e confrontato i due metodi (tapis roulant e ruota in esecuzione) di esercitare i topi, e presentato ottimizzato i protocolli più brevi ad alta efficienza in induzione autofagia. Ogni approccio ha i suoi pro e contro. Un singolo attacco di 90 minuti di esercizio fisico forzata sul tapis roulant è sufficiente per indurre l&#39;autofagia nel muscolo scheletrico e nel cervello. Abbiamo fatto un corso a tempo di tapis roulant esercizio 7, e ha scoperto che il Esercicondizioni SE qui descritte inducono il livello massimo di autofagia nel topo muscoli scheletrici, che viene convalidato anche da altri 23. In queste condizioni, i topi sottoposti a esercizio aerobico; come riportato in precedenza, l&#39;esercizio aerobico è indotta eseguendo prolungato con un graduale incremento velocità su un tapis roulant 24, 25, 26, mentre la condizione anaerobica si ottiene una breve durata di esercizio ad alta intensità, che aumenta la massa muscolare, ma non necessariamente aumentare esercizio la resistenza 27, 28. Inoltre, la velocità di funzionamento riportata qui in questo protocollo è correlata positivamente con capacità di consumo di ossigeno, con metodi indiretti per valutare la capacità aerobica 29. Pertanto, l&#39;esercizio aerobico su un tapis roulant è un modo veloce ed efficace per indurre l&#39;autofagia. Tuttavia, FORCEd in esecuzione in uno spazio chiuso può esercitare stress per topi. Così, per evitare di dare ulteriore stress per gli animali, usiamo dito trilli o nappe di filo come un metodo per mantenere i topi correre, anziché il built-in di scosse elettriche. Rispetto al treadmill, l&#39;uso di ruota portante ha molti vantaggi. E &#39;meno stressante, non necessita di tempo di osservazione dei ricercatori, ed è comodo per studiare gli effetti a lungo termine di attivazione autofagia. Eppure esercizio su una ruota in esecuzione è volontaria e genera quindi la variabilità in termini di esecuzione di distanza e velocità tra i diversi topi o lo stesso mouse su diversi giorni. Pertanto, è necessario eseguire topi su una ruota per un lungo periodo di tempo (ad esempio, diverse settimane) per ridurre al minimo la variabilità individuale. È importante sottolineare che l&#39;approccio richiede anche utilizzando un odometro notte per verificare che il mouse è effettivamente in esecuzione. Abbiamo misurato la distanza media di funzionamento di wild-type C57BL 6 topi / per un periodo di 2 settimane, e abbiamo trovato che corrono Approxinell&#39;intervallo 1 km / notte all&#39;inizio della formazione (giorno 1) e può funzionare fino a 8 - 10 km / notte al giorno 14. Nel complesso, la ruota portante è un metodo efficace per stimolare l&#39;autofagia nella maggior parte degli organi, anche se, è più difficile catturare accumulo dell&#39;autofagosoma nel muscolo scheletrico rispetto all&#39;utilizzo del tapis roulant. La ragione è che il muscolo scheletrico ha un elevato flusso autophagic e un tasso di degradazione rapida autofagosoma, che richiede la raccolta immediata del tessuto dopo l&#39;esecuzione per rilevare l&#39;induzione autofagia mediante misurazione puncta GFP-LC3. In entrambi i protocolli, rapida perfusione PFA e la fissazione dei tessuti dopo l&#39;eutanasia degli animali è un passaggio fondamentale della procedura di preservare le strutture autofagosoma che altrimenti si degrada facilmente durante la dissezione. Questo protocollo viene illustrato come utilizzare l&#39;esercizio aerobico per stimolare l&#39;autofagia nei tessuti di topo, tra cervello e muscoli scheletrici. Questi metodi possono essere utilizzati per studiare i meccanismi della via autophagy in manutenzione di funzione del tessuto, come la manutenzione mitocondriale 23, e per studiare gli effetti a lungo termine di induzione autofagia sulla regolazione del comportamento e della salute dei modelli di malattie degli animali, come ad esempio potenziando gli effetti analgesici dei cannabinoidi 9. Entrambi i metodi di tapis roulant e ruota in esecuzione inducono un buon livello di autofagia; ma è importante prendere in considerazione le loro differenze al momento di scegliere l&#39;approccio migliore per soddisfare le diverse obiettivi di ricerca.

Autofagia è un percorso di degradazione evolutivamente conservato, che viene indotta in risposta a varie condizioni di stress come la fame e ipossia 1, 2. Durante l&#39;autofagia, vescicole a doppia membrana, chiamato autofagosomi, incorporano componenti subcellulari inutili o danneggiati e trasportarli nei lisosomi per la degradazione 3. Autofagia basale è essenziale per la funzione cellulare e lo sviluppo dell&#39;organismo, e alterata autofagia basale è implicato in molti disturbi, tra cui neurodegenerazione, tumorigenesi e diabete di tipo 2 4, 5, 6. Il più noto autofagia induttore fisiologico è fame. Tuttavia, ha due limitazioni principali. In primo luogo, la fame richiede un lungo periodo di indurre l&#39;autofagia in modo efficace negli animali, ad esempio, 48 ore di restrizione alimentare nei topinella maggior parte degli organi. In secondo luogo, la fame induce a malapena autofagia cervello, a causa di un apporto di sostanze nutritive relativamente stabile nel cervello. In realtà, è anche difficile da rilevare induzione autofagia dagli induttori di piccole molecole, come molti farmaci non possono passare la barriera emato-encefalica. Così, per analizzare meglio la funzione di attivazione dell&#39;autofagia nella patogenesi della malattia, abbiamo recentemente scoperto che l&#39;esercizio fisico è più potente metodo fisiologico per indurre autofagia in un breve periodo di tempo 7, 8, 9. Rispetto fame, autofagia è effettivamente indotta da tapis roulant in esecuzione veloce come 30 min. Pertanto, l&#39;esercizio fisico è un approccio fisiologico comodo e potente per studiare il meccanismo di autofagia nel mediare benefici per la salute e la prevenzione delle malattie. Ci sono diversi marcatori proteici per la rilevazione di attività autofagia, tra cui LC3 e P62. LC3 (associata ai microtubuli proteina 1A / 1B-luce cHain 3) è una proteina citoplasmatica (LC3-formo) che viene coniugato con PE (fosfatidiletanolamina) su induzione autofagia. LC3 PE-lipidated (modulo LC3-II) viene reclutato su membrane autophagosomal e può essere utilizzato per visualizzare autophagosomes quando etichettati con GFP. La sua traslocazione dal citosol puntata strutture di autophagosomes al microscopio è un&#39;indicazione di induzione autofagia. p62 è un recettore di carico per supporti autofagia (come proteine ​​ubiquitinazione), ed è incorporato autophagosomes pure. Poiché la proteina è degradata in lisosomi insieme autophagosomes, i suoi livelli possono essere usati per misurare il flusso autofagia. Qui mostriamo come utilizzare questi marcatori di quantificare l&#39;autofagia in diversi tessuti di topo indotte da esercizio aerobico, compreso l&#39;esercizio forzato (tapis roulant) e esercizio volontario (in esecuzione ruote). Le stesse procedure possono essere applicate anche alla misurazione in vivo dell&#39;autofagia dopo il trattamento di altri induttori.

<table><tbody><tr><td>Treadmill</td><td>Columbus Instruments</td><td>150-RM Exer 3/6</td><td></td></tr><tr><td>Mouse running wheel</td><td>Super Pet</td><td>100079365</td><td>diameter 11.4 cm</td></tr><tr><td>Odometer</td><td>Bell</td><td>DASHBOARD 100</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>Model: inverted microscope ECLIPSE</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 1850UV</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>IKA</td><td>003737001 / Model: T10 Basic S1</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquine</td><td>CAYMAN CHEMICAL COMPANY</td><td>14194</td><td></td></tr><tr><td>Parafolmaldehye</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P6148</td><td>Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer.</td></tr><tr><td>Mounting media</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>p62 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>610833</td><td></td></tr><tr><td>LC3 antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

activating autophagy by aerobic exercise in mice

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Questo protocollo descrive due diversi metodi per indurre l&#39;autofagia nei tessuti di topo di esercizio aerobico: un totale di 90 minuti di esercizio fisico forzato su un tapis roulant a più corsie preceduto da due giorni di acclimatazione; o due settimane di esercizio volontario su una ruota in esecuzione usato dai topi alloggiati individualmente. In ogni protocollo di esercizio, siamo in grado di misurare il flusso autofagia da microscopia a fluorescenza e l&#39;analisi Western Blot in vari organi. Abbiamo usato una linea di topo transgenico che esprimono GFP-LC3 etichettato come un sistema reporter per monitorare l&#39;autofagia con l&#39;esercizio 1. Al momento di induzione autofagia, LC3 trasloca dal citoplasma al autofagosoma in strutture puntiformi. Dopo il sezionamento, la formazione di GFP-LC3 puncta può essere direttamente visualizzato mediante microscopia a fluorescenza (Figura 1A). In alternativa, strutture dell&#39;autofagosoma possono anche essere immunoistochimica da un anticorpo LC3 perimaging. O 90 minuti di esercizio treadmill o 2 settimane di corsa volontaria aumentato il numero di GFP-LC3 puncta sia muscolo scheletrico (vasto laterale) e nella corteccia cerebrale, rispetto alla condizione di riposo (Figura 1B). Va notato che la regione corteccia frontale è stato regione importante nel cervello dove autofagia è chiaramente indotta da entrambi i metodi finora. Esercizio anche indotto la conversione di LC3 dalla forma citosolica (LC3-I) alla forma lipidi coniugato (LC3-II), che può essere rilevato mediante analisi western blot (Figura 1C). incremento Esercizio indotta autophagosomes (rappresentate da LC3-II e GFP-LC3 puncta) è dovuto ad un flusso autophagic elevata, piuttosto che un blocco nella degradazione autofagosoma, valutata mediante l&#39;uso di inibitori di degradazione lisosomiale, come bafilomicina A1 o clorochina . Qui abbiamo misurato il degrado del autofagica p62 recettore carico come un exampio. Esercizio (90 min di treadmill) ha causato una maggiore degradazione di p62 nel muscolo scheletrico rispetto alla condizione di riposo, che è stato salvato da iniezione con clorochina prima dell&#39;esercizio (Figura 2). I risultati simili si osservano anche con l&#39;esercizio fisico volontario eseguendo ruote. Così, l&#39;esercizio aerobico con tapis roulant o in esecuzione ruote induce l&#39;autofagia in vivo, misurato dal livello di stato stazionario di LC3 e la degradazione di p62. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55099/55099fig1.jpg" /> Figura 1. Esercizio aerobico Induce autofagia in mouse tessuti. Immagini rappresentative (A) e la quantificazione (B) di GFP-LC3 puncta nel muscolo scheletrico (vasto laterale) e il cervello (corteccia frontale) di GFP-LC3 topi transgenici sotto la condizione di controllo (a riposo), dopo 90 minuti di esercizio fisico forzato (tapis roulant ) o dopo 2 settimane di esercizio volontario (ruota). Risultatos rappresentano media ± SEM di 10 immagini al mouse. N = 5 topi. I seguenti lunghezze d&#39;onda di emissione sono stati utilizzati: GFP - 525 nm; DAPI - 490 nm. (C) la rilevazione Western Blot di LC3 nel muscolo scheletrico (vasto laterale) da topi riposato e esercitate (dal tapis roulant). dati di quantificazione rappresentano il livello di LC3-II normalizzata actina (sinistra) e il rapporto di LC3-II LC3-I (a destra). N = 3 topi. Statistica sta confrontando ogni valore al campione di controllo. I risultati rappresentano media ± sem *, P &lt;0.05; **, P &lt;0,01; ***, P &lt;0.001, t-test. barra della scala, 25 micron. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55099/55099fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55099/55099fig2.jpg" /> Figura 2. L&#39;esercizio fisico aumenta autofagia Flux in mouse muscolo scheletrico. (A) Western blotrilevamento di p62 nel vasto laterale di topi riposato e esercitato in presenza o assenza degli inibitori lisosomiali clorochina. (B) (Sinistra) analisi Quantificazione di p62 normalizzata per fascia di actina. (Destro) Il flusso p62 è determinata sottraendo il valore densitometrica normalizzato di p62 PBS trattati da quella di p62 clorochina-trattata. I risultati rappresentano media ± SEM n = 3 topi. *, P &lt;0,05, t-test. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55099/55099fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

attivazione autofagia è utile nella prevenzione di varie malattie. Uno degli approcci fisiologiche per indurre autofagia in vivo è l&#39;esercizio fisico. Qui mostriamo come attivare l&#39;autofagia da esercizi aerobici e misurare i livelli di autofagia nei topi.

Attivazione di autofagia per esercizio aerobico nei topi

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  Northwestern University.  attivazione autofagia è utile nella prevenzione di varie malattie. Uno degli approcci fisiologiche per indurre autofagia in vivo è l'esercizio fisico. Qui mostriamo come attivare l'autofagia da esercizi aerobici e misurare i livelli di autofagia nei topi. 

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Assessment of Murine Exercise Endurance Without the Use of a Shock Grid: An Alternative to Forced Exercise

Using laboratory mouse models, the molecular pathways responsible for the metabolic benefits of endurance exercise are beginning to be defined. The most common method for assessing exercise endurance in mice utilizes forced running on a motorized treadmill equipped with a shock grid. Animals who quit running are pushed by the moving treadmill belt onto a grid that delivers an electric foot shock; to escape the negative stimulus, the mice return to running on the belt. However, avoidance behavior and psychological stress due to use of a shock apparatus can interfere with quantitation of running endurance, as well as confound measurements of postexercise serum hormone and cytokine levels. Here, we demonstrate and validate a refined method to measure running endurance in na&#239;ve C57BL/6 laboratory mice on a motorized treadmill without utilizing a shock grid. When mice are preacclimated to the treadmill, they run voluntarily with gait speeds specific to each mouse. Use of the shock grid is replaced by gentle encouragement by a human operator using a tongue depressor, coupled with sensitivity to the voluntary willingness to run on the part of the mouse. Clear endpoints for quantifying running time-to-exhaustion for each mouse are defined and reflected in behavioral signs of exhaustion such as splayed posture and labored breathing. This method is a humane refinement which also decreases the confounding effects of stress on experimental parameters.

A method to assess exercise endurance in laboratory mice without the use of a shock grid is demonstrated. This method is a humane refinement that can decrease the confounding effects of stress on experimental parameters.

Valutazione della murini esercizio di resistenza senza l&#39;uso di una griglia Shock: Un&#39;alternativa alla Esercizio forzato

Using laboratory mouse models, the molecular pathways responsible for the metabolic benefits of endurance exercise are beginning to be defined. The most ...

Ricerca

Comportamento

Supramaximal Intensity Hypoxic Exercise and Vascular Function Assessment in Mice

Exercise training is an important strategy for maintaining health and preventing many chronic diseases. It is the first line of treatment recommended by international guidelines for patients suffering from cardiovascular diseases, more specifically, lower extremity artery diseases, where the patients' walking capacity is considerably altered, affecting their quality of life. 
Traditionally, both low continuous exercise and interval training have been used. Recently, supramaximal training has also been shown to improve athletes' performances via vascular adaptations, amongst other mechanisms. The combination of this type of training with hypoxia could bring an additional and/or synergic effect, which could be of interest for certain pathologies. Here, we describe how to perform supramaximal intensity training sessions in hypoxia on healthy mice at 150% of their maximal speed, using a motorized treadmill and a hypoxic box. We also show how to dissect the mouse in order to retrieve organs of interest, particularly the pulmonary artery, the abdominal aorta, and the iliac artery. Finally, we show how to perform ex vivo vascular function assessment on the retrieved vessels, using isometric tension studies.

High-intensity training in hypoxia is a protocol that has been proven to induce vascular adaptations potentially beneficial in some patients and to improve athletes&#39; repeated sprint ability. Here, we test the feasibility of training mice using that protocol and identify those vascular adaptations using ex vivo vascular function assessment.

Sopramassimale intensità di esercizio Hypoxic e valutazione di funzione vascolare in topi

Exercise training is an important strategy for maintaining health and preventing many chronic diseases. It is the first line of treatment recommended by ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To investigate the underlying mechanisms that bring about various muscle adaptations, a number of exercise protocols such as treadmill, wheel running, and swimming exercise have been used in the animal studies. However, these exercise models require a long period of time to achieve muscle adaptations, which may be also regulated by humoral or neurological factors, thus limiting their applications in studying the muscle-specific contraction-induced adaptations. Indirect low frequency stimulation (10 Hz) to induce chronic contractile activity (CCA) has been used as an alternative model for exercise training, as it can successfully lead to muscle mitochondrial adaptations within 7 days, independent of systemic factors. This paper details the surgical techniques required to apply the treatment of CCA to the skeletal muscle of rats, for widespread application in future studies.

This protocol describes the use of the chronic contractile activity model of exercise to observe stimulation-induced skeletal muscle adaptations in the rat hindlimb.

Applicazione di stimolazione cronica per lo studio del ratto indotta da attività contrattile del muscolo scheletrico fenotipica adattamenti

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Biologia dello sviluppo

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

Cecal legatura e la puntura indotta da sepsi come modello per studiare autofagia nei topi

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Immunologia e infezioni

Short Session High Intensity Interval Training and Treadmill Assessment in Aged Mice

High intensity interval training (HIIT) is emerging as a therapeutic approach to prevent, delay, or ameliorate frailty. In particular short session HIIT, with regimens less than or equal to 10 min is of particular interest as several human studies feature routines as short as a few minutes a couple times a week. However, there is a paucity of animal studies that model the impacts of short session HIIT. Here, we describe a methodology for an individually tailored and progressive short session HIIT regimen of 10 min given 3 days a week for aged mice using an inclined treadmill. Our methodology also includes protocols for treadmill assessment. Mice are initially acclimatized to the treadmill and then given baseline flat and uphill treadmill assessments. Exercise sessions begin with a 3 min warm-up, then three intervals of 1 min at a fast pace, followed by 1 min at an active recovery pace. Following these intervals, the mice are given a final segment that starts at the fast pace and accelerates for 1 min. The HIIT protocol is individually tailored as the speed and intensity for each mouse are determined based upon initial anaerobic assessment scores. Additionally, we detail the conditions for increasing or decreasing the intensity for individual mice depending on performance. Finally, intensity is increased for all mice every two weeks. We previously reported in this protocol enhanced physical performance in aged male mice and here show it also increases treadmill performance in aged female mice. Advantages of our protocol include low administration time (about 15 min per 6 mice, 3 days a week), strategy for individualizing for mice to better model prescribed exercise, and a modular design that allows for the addition or removal of the number and length of intervals to titrate exercise benefits.

Short session (&#8804;10 min) high intensity interval training (HIIT) is emerging as an alternative to longer exercise modalities, yet the shorter variants are rarely modeled in animal studies. Here, we describe a 10 min, 3 day a week, uphill treadmill HIIT protocol that enhances physical performance in male and female aged mice.

Breve sessione ad alta intensità Interval Training e valutazione di tapis roulant in topi invecchiati

High intensity interval training (HIIT) is emerging as a therapeutic approach to prevent, delay, or ameliorate frailty. In particular short session HIIT, ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

In Situ Immunofluorescenti colorazione di autofagia nelle cellule staminali muscolari

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Biologia

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and further explore whether its mechanism is related to the impact of mitophagy. This study also aimed to demonstrate the therapeutic effect of safflower acid on oxidative stress in cardiomyocytes and explore whether its mechanism is related to the effect of mitophagy. Here, an H2O2-based oxidative stress model was constructed and assessed the degree of oxidative stress injury of cardiomyocytes by detecting the levels of lactate dehydrogenase (LDH), creatine kinase (CK), malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and glutathione peroxidase (GSH Px). Reactive oxygen species (ROS)-detecting fluorescent dye DCFH-DA, JC-1 dye, and TUNEL dye were employed to assess mitochondrial damage and apoptosis. Autophagic flux was measured by transfecting Ad-mCherry-GFP-LC3B adenovirus. Mitophagy-related proteins were then detected via western blotting and immunofluorescence. However, crocetin (0.1-10 &#181;M) could significantly improve cell viability and reduce apoptosis and oxidative stress damage caused by H2O2. In cells with excessive autophagic activation, crocetin could also reduce autophagy flow and the expression of mitophagy-related proteins PINK1 and Parkin, and reverse the transfer of Parkin to mitochondria. Crocetin could reduce H2O2-mediated oxidative stress damage and the apoptosis of H9c2 cells, and its mechanism was closely related to mitophagy.

Protection of H9c2 Myocardial Cells from Oxidative Stress by Crocetin via PINK1/Parkin Pathway-Mediated Mitophagy

Based on in vitro experiments, this study revealed the mechanism of crocetin in repairing oxidative stress damage of cardiomyocytes by influencing mitophagy, in which the PINK1/Parkin signaling pathway plays an important role.

Protezione delle cellule miocardiche H9c2 dallo stress ossidativo mediante Crocetina tramite la mitofagia mediata dalla via PINK1/Parkin

This study aimed to explore the oxidative stress-protective effect of crocetin on H2O2-mediated H9c2 myocardial cells through in vitro experiments, and ...

Medicina

Esplorare gli interventi di esercizio T2DM: un dispositivo di allenamento statico per topi

Static Strength Training Method for Type 2 Diabetic Mice

The treatment of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a major difficulty in improving patient health. Exercise is one of the main interventions for T2DM. Static strength training is one of the key forms of traditional sports in China. Research shows that static strength training is an effective clinical method for T2DM intervention, but there is no experimental device suitable for static training in mice. One of the difficulties in moving from clinical to basic research is to design appropriate experimental devices. In order to further study the mechanism of static training intervention in T2DM, a simple method for making a static training device for mice is introduced in this paper. This device has the advantages of simple operation, cheap material, and high feasibility. Previous studies conducted under this protocol have shown that static training can effectively reduce blood glucose levels and improve the mitochondrial function of skeletal muscle cells in T2DM mice. The purpose of introducing this device is to promote research on the mechanism of traditional exercise in the intervention of T2DM and to lay a foundation for the quantitative intervention of exercise.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca sul diabete con l'allenamento con esercizio statico nei topi

This protocol provides a simple method of making static training equipment for mice. The device maintains the muscle isometric contraction of the limbs of mice so as to verify the intervention effect of traditional exercise on type 2 diabetes (T2DM) and provides new exercise therapy for the clinical treatment of T2DM.

Metodo di allenamento della forza statica per topi diabetici di tipo 2

The treatment of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a major difficulty in improving patient health. Exercise is one of the main interventions for T2DM. ...

Attivazione di autofagia per esercizio aerobico nei topi

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Valutazione della murini esercizio di resistenza senza l'uso di una griglia Shock: Un'alternativa alla Esercizio forzato

Sopramassimale intensità di esercizio Hypoxic e valutazione di funzione vascolare in topi

Applicazione di stimolazione cronica per lo studio del ratto indotta da attività contrattile del muscolo scheletrico fenotipica adattamenti

Cecal legatura e la puntura indotta da sepsi come modello per studiare autofagia nei topi

Breve sessione ad alta intensità Interval Training e valutazione di tapis roulant in topi invecchiati

In Situ Immunofluorescenti colorazione di autofagia nelle cellule staminali muscolari

Protezione delle cellule miocardiche H9c2 dallo stress ossidativo mediante Crocetina tramite la mitofagia mediata dalla via PINK1/Parkin

Metodo di allenamento della forza statica per topi diabetici di tipo 2

Metodo di allenamento della forza statica per topi diabetici di tipo 2

Metodo di allenamento della forza statica per topi diabetici di tipo 2