Name: subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons at JoVE.com

Agradeço ao Dr. Vincent Seutin por seu apoio constante, Christelle Gillissen e Laurent Massotte para excelente assistência técnica, Drs Jean Defourny e Sandra Ormenese para conselhos com o microscópio confocal, Dr Jacques destinar para o dom do segundo amplificador Axopatch 200B, o GIGA-Imaging plataforma para compartilhar o microscópio confocal e software Imaris e Dr. Stephen Freeman pela leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi apoiado por subsídios da FRS belgas - FNRS (U.N002.13 e T.N0015.13) e publicado com o apoio da Fundação Universidade belga (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

O autor declara que ele não tem interesses financeiros concorrentes.

Este relatório descreve um protocolo passo-a-passo para implementar gravações de célula inteira somatodendríticos duplas e gravações dendríticas locais. É útil para a determinação da influência de canais iónicos (isto é, I h) sobre o decurso de tempo de potenciais pós-sinápticos e mapeamento da distribuição do canal de iões (I h) ao longo do domínio somatodendrítico de neurónios da substância negra de DA, respectivamente. Resultantes medidas eletrofisiológicas são combinados para deixar histoquímica hoc para recuperar a morfologia das células. O procedimento foi utilizado para investigar neurónios DA localizados na substantia nigra, mas podem ser generalizados para os neurónios da substância negra vizinhos GABA, área tegmental ventral neurónios DA ou outros neurónios do mesencéfalo. Todas as etapas também podem ser seguidas para examinar outros canais iônicos expressos em dendrites dos neurónios da substância negra, sem modificações importantes. Visualização post hoc é particularmente pertinente para os neurônios com axônio-bearingdendrites, como neurônios da substância negra 25,26, hipocampo interneurônios Oriens-alveus 21 ou alguns neurônios piramidais CA1 67. Curiosamente, os neurônios que partilham esta característica parece ser mais comum do que geralmente se pensa 67. A análise morfológica revela também a posição precisa dos eletrodos e axônio. A detecção do último pode ser otimizado pela rotulagem de proteínas expressas no segmento axônio inicial (canais de Na + dependentes de voltagem ou Ankyrin G) usando imunohistoquímica 68,69. A fiabilidade dos dados recolhidos com as gravações dendríticas e rotulagem neuronal subsequente, invariavelmente, depende da qualidade fatia. Esforço máximo deve, pois, ser aplicado para preservar a viabilidade das células no tecido. Isto é conseguido com a manipulação suave de animais saudáveis, ferramentas de alta qualidade e reagentes, oxigenação suficiente das temperaturas de tecidos e geladas ao longo da preparação de fatias. condições de gravação estáveis ​​contam com a seleção de neurônios saudáveis. No modo de célula inteira, resistência em série inicialmente deverá ser tão baixo quanto possível e mantida constante ao longo da experiência. A estabilidade das gravações é mais dependente manipuladores de alta qualidade desprovidas de deriva e vibrações. Estas perturbações podem ser reduzidas através da optimização da estabilidade pipeta: verificar a ligação ao suporte da pipeta e a headstage, controlar que os cabos são micromaniplador folga, evitando alterações bruscas de temperatura ou o movimento fase e verificar o mecanismo do manipulador. Para as gravações dupla, metilsulfato 13,15,21 foi incluído na solução intracelular, mas gluconato 9,14,25 pode ser alternativamente empregue. No entanto, o principal anião podem alterar o potencial de membrana 70,71 e algumas correntes dependentes de voltagem 72. solução intracelular pode ser suplementado com ATP, GTP e fosfocreatina para preservar a physiolofunções gicos dos neurônios. Além disso, a adição de um corante fluorescente na solução de pipeta (por exemplo, Alexa 594 ou Sulforodamina 101 41) para visualizar os dendritos durante uma gravação somática pode ser útil, por exemplo para colocar um pedido de pressão (Figura 7 em Ref. 41) ou um estimulante eléctricos pipeta. A solução de pipeta para gravações ligado à célula contém uma alta concentração de K + e nenhum Na + para gravar grande I h. Digno de nota a proporção da concentração de Na + / K + influencia a amplitude da corrente 10, o potencial de inversão da corrente 11 e a propagação de h I 73. Como alternativa, eu h também podem ser gravados utilizando fora-outs 10. Nesta configuração de gravação no entanto, o meio intracelular na proximidade dos canais pode ser perturbado. Por conseguinte, as diferenças na activação dependente de voltagem de I &lt;sub&gt; h é observado quando as correntes comparando obtidos utilizando manchas ligado à célula e fora-outs 10. Inchaço dos neurônios é ocasionalmente encontrada durante a gravação de patch-clamp, e muitas vezes surge de causas distintas, tais como a baixa qualidade da água, forte desequilíbrio da osmolaridade ou pH entre a soluções de 39 ou erros intra e extracelular na composição de soluções. A qualidade dos registos electrofisiolicos tem uma incidência directa sobre a qualidade da morfologia de neurónios recuperados. Alta resistência pipetas somáticas são utilizados para gravações duplas (6 - 10 mohms, como nas refs 6,11.) E para gravações somáticos simples após gravações ligado de células para minimizar a diluição do meio intracelular 14. A gravação somática de célula completa após a gravação ligado de células é, portanto, mantido curto (&lt;10 min). patches de fora para fora de ambos os somáticas e dendríticas pipetas são essenciais para o fecho do cmembrana ell e subsequente recuperação da morfologia celular. Além disso a estrutura da célula, o conteúdo neuroquímica pode ser determinado para os neurónios gravados 59,74. Por exemplo, a proteína intracelular tirosina-hidroxilase pode ser immunolabeled para a identificação inequívoca dos neurónios DA 13. Neurónios DA concentram-se principalmente no SN pars compacta, com uma densidade muito mais baixa presentes no SN pars reticulata, onde eles são misturados com um maior número de neurónios GABA 75. Enquanto o corpo da célula dos neurónios DA é muitas vezes maior do que a de neurónios GABA, a identificação visual destas células com IR-videomicroscopia é incerto e parcialmente impedida pela opacidade da pars compacta. Para ultrapassar estas limitações, a pré-selecção de neurónios DA pode ser facilitada pela utilização de ratos transgénicos que expressam um marcador fluorescente, numa população específica de neurónios (TH 65 ou DAT para neurónios DA, GADpara os neurônios GABA) e iluminação de epifluorescência. Alternativamente, um corante fluorescente pode ser incluída na solução do eléctrodo somática para facilitar a visualização dos dendritos. O aumento da resolução da célula fluorescente é trazida por Nipkow confocal disco giratório 14,22,30 ou microscopia de dois fótons 7 combinados para IR-DGC 6. Várias vantagens estão relacionadas com DGC em comparação com DIC. Em primeiro lugar, na forma de prismas DIC não são requeridos, a imagem IR-DGC pode ser coberto com uma 49,52,53,76 imagem de fluorescência. Em segundo lugar, a DGC pode ser combinado com fotoestimulação e Optogenetics 77. Uma desvantagem de preparação fatia é a preservação da integridade dos neurónios. Neurónios DA alargar as suas dendrites nos três planos do espaço e, portanto, 78,79 truncamento do compartimento dendríticas não pode ser completamente evitada em fatias 80. A escolha da orientação de fatias (coronal, horizontal ou para-sagital) é um trade-off. A origem da inervação eo delineamento experimental devem ser considerados para selecionar a orientação da direita de fatias. patching dendrítica directa é a técnica utilizada para mapear a distribuição de canais de iões funcionais nos diferentes compartimentos das células. Além disso, esta técnica oferece para determinar a variabilidade nas propriedades funcionais dos canais 20. Como complemento a localização e densidade de canais de iões pode ser verificado usando imuno-histoquímica para a luz e microscopia eletrônica níveis 17,23. Essa abordagem também oferece a possibilidade de determinar a densidade de canais em estruturas de pequeno calibre que são inacessíveis para pipetas de patch. No entanto, estes canais pode estar em um estado funcional distinta 24 ou mesmo inativa em comparação com os registados utilizando técnicas de patch-clamp. Ambas as técnicas são, portanto, necessário para obter uma imagem completa da localização e propriedades decanais iônicos em uma região celular específica 17. Com o desenvolvimento de corantes sensíveis à voltagem, imagiologia de tensão foi usado para examinar a propagação de EPSPs de APs e em neurónios em vários locais 81. Como uma alternativa a dupla gravações de patch-clamp, esta abordagem pode ainda ser implementado por dendrites finas que não são acessíveis para pipetas patch, mas exigem uma calibração precisa do sinal e média. Enquanto neurónios DA na SN e área tegmental ventral são amplamente investigada por meio de gravações somáticas no contexto fisiológico e fisiopatológico, as propriedades funcionais das suas dendrites permanece largamente desconhecido em ambas as condições. Aplicação de patches de dendrites foi implementado para os neurónios dopaminérgicos da substância negra por vários grupos com sucesso 13,25,26 e continua a ser o método de escolha para dissecar propriedades excitáveis destas estruturas subcelulares finas 8. gravações dendríticas proporcionar uma maior opportuComunidade de fiscalizar a eficiência ea plasticidade da transmissão sináptica e da plasticidade da excitabilidade dendrítica 82,83.

Os neurónios receber informações sináptica predominantemente nas suas dendrites. Excitatórios e sinais inibitórios sinápticas espalhados do seu local de produção para o local de integração onde potenciais de acção (APs) são evocadas como o sinal de saída. Em seu caminho, potenciais sinápticos são influenciados tanto pela estrutura dos dendritos e da interação entre propriedades da membrana passivos e ativos. A combinação destes parâmetros altamente variáveis aumenta o poder computacional de neurónios 1,2. No entanto, o pequeno diâmetro de dendritos dificulta no entanto, o estudo das suas propriedades eléctricas. O contínuo desenvolvimento da técnica de patch-clamp 3, a óptica 4 e aperfeiçoamento de métodos para a preparação fatia 5 durante as últimas décadas têm permitido gravações de muito fina (0,7-3 mm Ø) dendrites 6,7. Estes métodos eram, e são, em grande parte, ainda usado para examinar a excitabilidade dos dendritos em uma varieneurônios F 8. Gravações dendríticas diretos são essenciais para determinar a distribuição 9-19 e as diferenças nas propriedades funcionais 20-22 de canais iônicos em compartimentos neuronais distintas. Estes dados são o complemento necessário das distribuições de canais de iões detectados com imunohistoquímica combinada à luz e microscopia eletrônica 23,24. Gravações somatodendríticos dupla têm sido implementadas para explorar a propagação dos potenciais de ação 9,13-15,21,22,25-27 e disseminação de potenciais sinápticos 13,16,18 ao longo do domínio somatodendrítico de neurônios, obtenção de modelos de cabos passivos detalhados 28- 30 e investigar a resolução temporal de integração neuronal 31. A substância negra (SN) é uma região localizada no meio do cérebro envolvida em várias funções, tais como o controlo do movimento, a codificação de recompensa e comportamentos habituais. A diminuição de dopamina devido à específicaperda de dopaminérgicos (DA) neurónios no SN está associado com os distúrbios motores observadas em pacientes que sofrem de doença de Parkinson 32. O circuito nigral é composto por dois tipos de células principais: dopaminérgicos e GABAérgicos neurónios. Curiosamente, esses neurônios têm várias características específicas que os distinguem de outros neurônios. O axônio de uma grande proporção de neurônios DA e alguns neurônios GABA origina de um site dendrítica, indicando que o mandril dendrítica é heterogênea (axônio-rolamento e dendrites-falta axônio) 25,26,33. A morfologia desses neurônios contrasta, por conseguinte, com a organização típica de neurônios em que a transferência de informações segue a lei da polarização dinâmica emitida por Cajal: a partir de dendrites, a soma e, finalmente, para axônio 34. Neurónios DA também são conhecidos para a libertação de dopamina a partir de suas dendrites 35, gerar actividade de rotura 36 e 37 plasticidade NMDA-receptor. a dissecçãoção desses fenômenos é evasivo, sem gravações directos a partir do local onde eles são iniciados. Para obter conhecimentos sobre a relação entre a localização precisa e propriedades funcionais dos canais de iões e o seu papel na excitabilidade e informações dendrítica transferência em neurónios da substância negra, gravações dendríticas directos são o método de escolha. Este relatório descreve um procedimento detalhado que pode ser usado para obter gravações de patch-clamp simples e dupla de dendrites dos neurónios da substância negra eo hoc biocitina rotulagem lugar correspondente. Os princípios básicos para remendar o somático e da membrana dendrítica são muito semelhantes. Praticamente no entanto, as gravações de sites dendríticas requerem otimização específica em comparação com gravações somáticas. gravações dendríticas sucedidas dependem da qualidade das fatias, ajuste ideal da óptica, abordagem suave da pipeta patch e estabilidade das gravações.

<table><tbody><tr><td>Double-distillated water</td><td>Millipore</td><td>Super Q</td><td>Resistivity &gt;14 M&amp;Omega; cm, ideal 18.2 M&amp;Omega; cm at 25&amp;nbsp;&amp;deg;C, filtered (0.22 &amp;micro;m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>Microfilter candles</td><td>Robu</td><td>Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter</td><td></td></tr><tr><td>Tissue slicer with vibroprobe</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40</td></tr><tr><td>Tissue slicer</td><td>Dosaka</td><td>DTK-1000</td><td>cutting parameters: speed 4, frequency 7</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Gilette</td><td>Super Silver</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reserve chamber</td><td></td><td></td><td>Custom-made</td></tr><tr><td>PP beckers</td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0.22 &amp;micro;m</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue&amp;nbsp;</td><td>UHU</td><td>&quot;Sekunden Kleber&quot;</td><td>liquid glue</td></tr><tr><td>Recording chamber&amp;nbsp;</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>Slice mini chamber</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed</td></tr><tr><td>Dental wax</td><td>Colt&amp;egrave;ne/Whaledent</td><td></td><td>orthodontic tray wax strips</td></tr><tr><td>Platinum grid</td><td></td><td></td><td>to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>to fire-polish pipette tips</td></tr><tr><td>Potassium methyl sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Molecular probes</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>Manometer</td><td>GREISINGER electronic</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt Gradient Contrast</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulators</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>Frame grabber</td><td>The Imaging Source</td><td>DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>Condenser</td><td>Zeiss</td><td></td><td>high numerical aperture condenser working with oil</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective</td></tr><tr><td>Fourfold-changer</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td></td><td>between the camera and the microscope</td></tr><tr><td>Black &amp;amp; white video monitor</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>16-inch, 850 TV lines, analog</td></tr><tr><td>Sample Bottles, Amber Glass, with Cap</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>to transfer slices from the setup to histology room</td></tr><tr><td>The Axon Guide</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Book</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>Analysis of electrophysiological data</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td></tr><tr><td>Well cell culture plate</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td><td>for the staining of fixed slices</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td></tr><tr><td>mouse anti-TH monoclonal primary</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>working concentration: 1/1,000</td></tr><tr><td>goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>working concentration: 1/500</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade</td><td>Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Avidin DCS</td><td>Vector Lab</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td><td>plugin for ImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>Reconstruction of biocytin filled neurons</td></tr><tr><td>Neuromantic</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td><td>Reconstruction of biocytin filled neurons</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>Analysis of electrophysiological data</td></tr></tbody></table>

subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons

Dendrites dos neurónios dopaminérgicos receber e transmitir entrada sináptica, suporte potencial de ação back-propagação e liberação de neurotransmissores. Entender essas funções fundamentais irá lançar luz sobre a transferência de informações nestes neurônios. Dendríticas gravações de patch-clamp prevê a possibilidade de examinar diretamente as propriedades elétricas dos dendritos e canais de iões dependentes da voltagem subjacentes. No entanto, estas estruturas finas não são facilmente acessíveis para pipetas de patch por causa do seu pequeno diâmetro. Este relatório descreve um procedimento passo-a-passo para recolher gravações estáveis ​​e fiáveis ​​a partir dos dendritos de neurônios dopaminérgicos em fatias aguda. Medidas eletrofisiológicas são combinados com a recuperação post hoc da morfologia celular. experiências bem sucedidas dependem melhorado de preparação de fatias, soluções e pipetas, um ajuste adequado da óptica e estabilidade da pipeta em contacto com a estrutura gravada. princípios padrão de somatic gravação de patch-clamp são aplicados aos dendritos, mas com uma abordagem mais suave da pipeta. Estas técnicas versáteis podem ser implementadas para abordar várias questões relativas às propriedades excitáveis ​​de dendrites.

O protocolo descrito acima tem a intenção de facilitar a recolha de dados através de gravações de patch-clamp dendríticas. Esta técnica, combinada com histoquímica post hoc, ajuda a obter insights sobre os mecanismos de muitos sinais elétricos originários ou espalhamento em dendrites. Acesso directo à dendrites com pipetas de patch é difícil, mas especial atenção a vários aspectos metodológicos irá melhorar a taxa de sucesso das gravações. Um experimentador suficientemente experientes em gravação somática estável pode esperar obter selos de alta resistência (GÊ) e experiências completas sobre a maioria das tentativas. Uma a duas gravações dendríticas de alta qualidade podem ser recolhidos por dissecção. A disponibilidade de fatias de cérebro de alta qualidade contendo somata saudável e dendrites é um pré-requisito para acesso a essas estruturas finas (Figura 1). o criteriuma para selecionar esses neurônios são uma superfície lisa e homogênea em todo o celular e um soma e dendritos de baixo contraste, quando observada com óptimas ajustado óptica (Figura 1A e 1B). Seleção de neurônios muito fortemente contrastada geralmente leva a gravações instáveis (Figura 1C e 1c). Por conseguinte, tais neurónios deve ser evitada. Em comparação com outros neurônios, os neurônios da substância negra DA exibir características morfológicas e eletrofisiológicas específicos. Estas características geralmente avaliadas com uma única pipeta somática também pode ser observada em dupla somática (Figura 2) e gravações de somatodendríticos (Figura 3). Longos injeções atuais hiperpolarizantes induzir uma rectificação potencial de membrana chamada &quot;sag&quot; (Figuras 2B e 5D). O axónio origina, na maioria dos casos, num sítio dendrítica tal como identificadousando critérios complementares 13,25,26, indicando que o compartimento dendrítica nestes neurónios é heterogénea (Figura 3A - 3B). Como consequência, o compartimento onde o AP é observado em primeiro lugar corresponde ao compartimento no qual o axónio emerge (Figura 3C - 3D) 13,25,26. O axónio é geralmente terminada por uma bolha axonal causado por um corte do axónio durante corte 64, mas esta estrutura não é sistematicamente detectado. A retracção pronunciada observada em neurónios da substância negra consecutivo para a activação da I h sugere uma elevada expressão de subunidades de HCN. Para determinar a influência da I h na integração de sinais sinápticos, correntes (EPSC) formas de onda sinápticas-like foram gerados e injetado através do eletrodo de registro dendríticas durante as gravações dupla somatodendríticos 55 (&lt;forte&gt; Figura 4). A cinética destas EPSCS simulados foram baseadas em ascensão e tempo de decaimento constantes de EPSCS espontâneas reais. O aEPSP resultante foi gravado com o eletrodo somática. Aplicação no banho do I h bloqueador ZD 7288 aumentou a duração da aEPSP, indicando a contribuição de I h para o curso de tempo dos sinais sinápticas (Figura 4B). ZD 7288 aboliu também a membrana rectificação potencial confirmando que os resultados SAG da activação da I h (Figura 4C). Os resultados obtidos com os EPSPs simuladas pode ser correlacionada com experiências que utilizam EPSPs evocados electricamente 65. Para mapear a distribuição precisa do canal no domínio somatodendrítico de neurónios DA, gravações ligado de células foram executadas (Figura 5). A selagem de alta resistência (&gt;&gt; 1 GÊ) é uma necessidade absoluta para as gravações ligado de células (Figura 5B </strong&gt;). Em dendrites dos neurónios DA, Eu h activa lentamente com degraus de tensão hiperpolarizantes de comprimento e o estado de equilíbrio de corrente é atingido após centenas de ms (Figura 5C), como mostrado anteriormente 66. Esta observação indica que os canais HCN expressos em dendrites dos neurónios DA possuem diferentes subunidades em comparação com aqueles em neurónios piramidais ou de outros tipos de células 10,16,66. À medida que a distribuição do canal pode ser não homogénea no compartimento dendrítica e como o compartimento dendrítica é em si heterogéneos, a identidade do dendrito (axónio-rolamento ou dendrito nonaxon-rolamento) é revelada por comparação da imagem IR-DGC com a imagem confocal após coloração biocitina (Figura 3A e B). Recuperação da morfologia das células é, portanto, necessário para ambas as gravações de somatodendríticos dupla e para gravações ligado à célula por meio de gravações de células somáticas toda subsequentes. Figura 1. Visualizando o Soma e proximal dendrites dos neurônios dopaminérgicos da substância negra usar o infravermelho Videomicroscopia. (A) IR-DGC imagem de um neurônio DA nigral mostrando a soma e dendritos proximais e duas pipetas somáticas e dendríticas. Uma gravação somatodendrítico dupla foi realizada com sucesso neste neurônio saudável. Observar o baixo contraste e a superfície lisa em todo o domínio somatodendrítico da célula. (B) Um outro exemplo de um neurónio DA saudável. (C) DA neurónio com uma superfície mais áspera e desigual e um contraste forte. Embora tenha sido obtida uma gravação dupla, a estabilidade foi abaixo do ideal, e a duração da gravação foi curto (~ 15 min) devido a um aumento gradual da resistência acesso em ambas as pipetas. (D) segundo exemplo de um neurônio DA mostrando uma fortemente contrastada soma e dendritos proximal. Neste caso, um forte aumento da resistência acesso foi observada pouco depois da pausa no modo de célula inteira. Uma tentativa de diminuir a resistência acesso por pressão negativa não teve sucesso. Neurónios no painel C e D podem ter sido danificados durante o procedimento de corte e deve ser evitado para experiências. (E) simultânea dupla gravação somática num neurónio DA saudável no início da gravação. (F) O mesmo neurónio como no painel E com um corpo da célula inchada depois de ~ 17 min. Note a ausência completa de contraste, a aparência bola-like da soma e a presença do grande núcleo que não é aparente em neurônios saudáveis. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> Figura 2. </strong&gt; simultânea Duplo Somatic gravação de uma DA Neuron. (A) IR-DGC imagem durante a gravação de dupla somática a partir de um neurônio DA. (B) hiperpolarizando e despolarização 1 s injeções de corrente longa (-160 a 80 pA, incremento de 80 pA) e variações de tensão correspondentes gravados simultaneamente com as duas pipetas de patch. Note a presença do afundamento no rastreio de tensão com a etapa atual de hiperpolarização longa e grande pós-hiperpolarização após a AP durante o pulso de corrente de despolarização. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> Figura 3. dupla S Gravação omatodendritic num DA Neuron. (A) imagem IR-DGC de um neurônio DA. A distância entre a dendrítica e somapipeta tique é 29 uM imagem. (B) z-confocal projecção do neurónio no painel A marcado com avidina conjugada com isotiocianato de fluoresceína (FITC). O neurônio foi preenchido com biocitina durante a gravação. O axônio originado de um dendrito proximal perto da soma, tal como indicado pela seta. (C) a gravação de tensão de célula inteira somatodendrítico dupla simultânea do neurônio no painel A. AP registrado na soma (vestígios de tensão preto) e dendritos (tensão vermelho traços) em resposta a um 1 s passo de injecção de corrente longa via somática (da esquerda; traçado atual preto) e pipeta alternativamente dendríticas (direita; traço corrente vermelha) (D) somática e AP dendrítica mostradas na escala de tempo expandido.. Com qualquer somática ou injeção de corrente dendrítica, a AP somáticas (preto) precedeu a AP dendríticas (vermelho). O atraso entre APs neste neurônio foi de 120 ms e 210 mS com somático e injeção de corrente dendrítica, respectivamente. atrasosforam medidos no AP amplitude semi-máxima durante a fase de subida do AP. A AP é observada pela primeira vez no compartimento próximo ao qual o axônio emerge, confirmando observações anteriores 25,26. Neste caso, a gravação dendrítica é feita a partir de uma dendrite-falta axónio. Um exemplo de uma gravação de uma dendrite axônio de rolamento está em Ref. 13 (na sua Fig. 1). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> Figura 4. Propagação da EPSPs artificiais ao longo do somatodendrítico Axis of DA neurônios. (A) imagem IR-DGC de um neurônio DA. A distância entre a pipeta e dendrítica somática é de 45 uM. Ambas as pipetas de patch está no modo de célula inteira de gravação actual-clamp. (B) Correntegravado com a pipeta dendrítica na corrente de grampo e usado para gerar o EPSP artificial (topo). A corrente é obtida pela injecção de uma forma de onda semelhante EPSC (t rise = 0,6 ms; τ decaimento = 3 ms de amplitude = 100 Pa) através do dendrítica pipeta de gravação 55. Na parte inferior, aEPSPs registados no soma em condições de controle (preto) propagado e depois da aplicação do banho do ZD7288 I h bloqueador (30 mM; traço vermelho). Cada traço de tensão é a média de 40 varreduras individuais. Observar o grande aumento da duração do EPSP na presença de ZD7288 indicando a contribuição de I h para o curso de tempo de EPSP. (C) Tensão vestígios gravados a partir do soma, em condições de controlo (preto) e após a aplicação de 30 | iM ZD 7288 ( vermelho) em resposta a uma longa (30 pa; 1 s) passo actual hiperpolarizante. Note-se a ausência do potencial de membrana de rectificação (SAG), após o bloqueio de I &lt;sub&gt; h. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> Figura 5. Presença de I h em dendritos das DA Neuron. (A) IR-DGC imagem de um neurônio DA e pipeta sobre dendrito proximal. (B) capacitivo e de vazamento de correntes durante um comando de tensão 5 mV na configuração anexado à célula. A resistência de selagem foi GÊ 5, neste exemplo, o passo (C) tensão de hiperpolarização. (90 mV; parte superior) a partir de um potencial de membrana 0 mV induzida uma activação lentamente I h. O rastreio da corrente foi invertida e equipada com uma única função exponencial dá uma constante de tempo de t = 632 ms. (D) Tensãorespostas da soma registrada de células inteiras (painel A) a 1 s hiper e despolarizantes pulsos de corrente (-160 a 120 Pa, 40 pA de incremento). A gravação de célula inteira somáticas foi realizado após a gravação ligado à célula. Note-se a ausência de APs devido à aplicação extracelular da TTX e Cd 2+ suprime a ativação espontânea durante a gravação ligado à célula. Estes voltagem dependentes de Na + e Ca 2+ bloqueadores atuais foram adicionados a suprimir as correntes de ação. Os painéis A - D, são do mesmo neurónio (E) imagem IR-DIC de outro neurónio DA e uma pipeta dendrítica correntes (F) de tensão-dependentes activados por um pulso de teste de 0 mV a partir de um pré-pulso de 50 ms a -120 mV.. em um patch de fora para fora excisada do dendrito proximal do neurônio no painel E. Segurar potencial de -80 mV. Note-se a inativação dependente do tempo da corrente. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma maior</a>versão desta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substância </td><td> g / mol </td><td> Concentração </td><td> para 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 125 mM </td><td> 7.305 g </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2.100 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,551 </td><td> 2,5 mm </td><td> 0,186 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,172 g </td></tr><tr><td> glicose </td><td> 198,17 </td><td> 25 mM </td><td> 4,95 g </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 1 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 2 mM </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridade: ~ 310 mOsmol / L (intervalo ideal: 314-325 mOsmol / L), pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: fluido cerebrospinal artificial (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substância </td><td> g / mol </td><td> Concentração </td><td> para 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 87 mM </td><td> 5.084 g </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2,1001 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 7,551 </td><td> 2,5 mm </td><td> 0,18637 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,17248 g </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 7 mM </td><td> 7 mL </td></tr><tr><td> glicose </td><td> 198,17 </td><td> 10 mM </td><td> 1,9817 g &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> sacarose </td><td> 342,29 </td><td> 75 mM </td><td> 25,672 g </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridade: ~ 326 mOsmol / l, pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabela 2: sacarose-ACSF para preparar fatias. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substância </td><td> g / mol </td><td> Concentração </td><td> para 100 ml </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150,2 </td><td> 120 mM </td><td> 1,8024 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 20 mM </td><td> 0,14912 g </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td> 551,1 </td><td> 2 mM </td><td> 0,1102 g </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td> 523,2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,02661 g </td></tr><tr><td> Na 2 -Phosphocreatine </td><td> 255,1 </td><td> 5 mM </td><td> 0,1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380,4 </td><td> 0,1 mM </td><td> 3.803 mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 g </td></tr><tr><td> biocitina </td><td> 1 mg / mL </td><td></td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridade: ~ 302 mOsmol / l, pH = 7,2 ajustado com KOH </td></tr></tbody></table> Tabela 3: solução intracelular para gravações dupla. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Substância </td><td> g / mol </td><td> Concentração </td><td> para 100mL </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,56 </td><td> 120 mM </td><td> 0,8947 g </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 2 mM </td><td> 200 ul </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 M (solução) </td><td> 1 mM </td><td> 100 ul </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 </td></tr><tr><td> TEA-Cl </td><td> 165,7 </td><td> 20 mM </td><td> 0,3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94,11 </td><td> 5 mM </td><td> 0,04705 g </td></tr><tr><td> BaCl2 </td><td> 244,26 </td><td> 1 mM </td><td> 0,02443 g </td></tr><tr><td> CdCl2 </td><td> 183,32 </td><td> 0,02 mm </td><td> 0.3666 mg </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 mM </td><td> 200 nM </td><td> 20 ul </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridade: ~ 290 mOsmol / L, ajustado com D-glicose (Ref. 16); pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabela 4: Solução de eletrodo para gravações ligado por células.

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Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcelulares Gravações patch-clamp do domínio somatodendrítico da substância negra dopamina Neurônios

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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University
of Liege. Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro. 

Vídeo: Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of recordings are conducted on dissociated DRG neurons, which is a standard preparation for most laboratories. Neuronal properties, however, can be altered by axonal injury resulting from enzyme digestion used in acquiring dissociated neurons. Further, dissociated neuron preparations cannot fully represent the microenvironment of the DRG since loss of contact with satellite glial cells that surround the primary sensory neurons is an unavoidable consequence of this method. To overcome the limitations in using conventional dissociated DRG neurons for patch clamp recordings, in this report we describe a method to prepare intact DRGs and conduct patch clamp recordings on individual primary sensory neurons ex vivo. This approach permits the fast and straightforward preparation of intact DRGs, mimicking in vivo conditions by keeping DRG neurons associated with their surrounding satellite glial cells and basement membrane. Furthermore, the method avoids axonal injury from manipulation and enzyme digestion such as when dissociating DRGs. This ex vivo preparation can additionally be used to study the interaction between primary sensory neurons and satellite glial cells.

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

Remendo Recordings Grampo na Intact gânglios das raízes dorsais de ratos adultos

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Bioquímica

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

Aplicação de uma condutância do receptor NMDA em neurônios dopaminérgicos Rat Midbrain Usando a Técnica Clamp dinâmico

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Neurociência

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, difficult to separate and also not easily identified by their morphology. Thus, it is often difficult to analyze gene expression in a specific neuron type. Here we document a procedure that combines whole-cell patch clamp recording techniques with single-cell reverse transcription polymerase chain reaction (scRT-PCR) to profile mRNA expression in different types of neurons in the substantial nigra. Electrophysiological techniques are first used to record the neurophysiological and functional properties of individual neurons. Then, the cytoplasm of single electrophysiologically characterized nigral neurons is aspirated and subjected to scRT-PCR analysis to obtain mRNA expression profiles for neurotransmitter synthesis enzymes, receptors, and ion channels. The high selectivity and sensitivity make this method particularly useful when immunohistochemistry can not be used due to a lack of suitable antibody or low expression level of the protein. This method is also applicable to neurons in other brain areas.

Neurons are first characterized electrophysiologically. Then the cytoplasm from the recorded neuron is aspirated and subjected to reverse transcription-PCR analysis to detect the expression of mRNAs for neurotransmitter synthesis enzymes, ion channels, and receptors.

Perfil de tensão-gated Expressão mRNA canais de potássio em neurônios da substância negra usando uma única célula RT-PCR Técnicas

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is terminated by diffusion2-3, extracellular enzymes4, and membrane transporters5. The dopamine transporter, located in the peri-synaptic cleft of dopamine neurons clears the released amines through an inward dopamine flux (uptake). The dopamine transporter can also work in reverse direction to release amines from inside to outside in a process called outward transport or efflux of dopamine5. More than 20 years ago Sulzer et al. reported the dopamine transporter can operate in two modes of activity: forward (uptake) and reverse (efflux)5. The neurotransmitter released via efflux through the transporter can move a large amount of dopamine to the extracellular space, and has been shown to play a major regulatory role in extracellular dopamine homeostasis6. Here we describe how simultaneous patch clamp and amperometry recording can be used to measure released dopamine via the efflux mechanism with millisecond time resolution when the membrane potential is controlled. For this, whole-cell current and oxidative (amperometric) signals are measured simultaneously using an Axopatch 200B amplifier (Molecular Devices, with a low-pass Bessel filter set at 1,000 Hz for whole-cell current recording). For amperometry recording a carbon fiber electrode is connected to a second amplifier (Axopatch 200B) and is placed adjacent to the plasma membrane and held at +700 mV. The whole-cell and oxidative (amperometric) currents can be recorded and the current-voltage relationship can be generated using a voltage step protocol. Unlike the usual amperometric calibration, which requires conversion to concentration, the current is reported directly without considering the effective volume7. Thus, the resulting data represent a lower limit to dopamine efflux because some transmitter is lost to the bulk solution.

The amperometric technique measures dopamine release from a single cell by detecting the oxidative current produced by spontaneous dopamine oxidization. Simultaneous voltage clamp and amperometry methodology reveal the mechanistic relationship between the overall "activity" of dopamine transporter and the regulatory role of this activity on the reverse transport of dopamine.

Medição única célula de liberação de dopamina com simultânea de tensão-clamp e amperometria

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers easy identification and characterization of these cell types, prerequisites to study their specific functions. This article describes the multiplex single cell reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) protocol, which allows, after patch-clamp recording in slices, to detect simultaneously the expression of tens of genes in a single cell. This simple method can be implemented with morphological characterization and is widely applicable to determine the phenotypic traits of various cell types and their particular cellular environment, such as in the vicinity of blood vessels. The principle of this protocol is to record a cell with the patch-clamp technique, to harvest and reverse transcribe its cytoplasmic content, and to detect qualitatively the expression of a predefined set of genes by multiplex PCR. It requires a careful design of PCR primers and intracellular patch-clamp solution compatible with RT-PCR. To ensure a selective and reliable transcript detection, this technique also requires appropriate controls from cytoplasm harvesting to amplification steps. Although precautions discussed here must be strictly followed, virtually any electrophysiological laboratory can use the multiplex single cell RT-PCR technique.

This protocol describes the critical steps and precautions required to perform single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. This technique is a simple and effective method to analyze the expression profile of a predetermined set of genes from a single cell characterized by patch-clamp recordings.

Única célula transcrição reversa Multiplex cadeia da polimerase após Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Biologia

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter receptors that contribute to cell diversity across this population. This protocol outlines the steps necessary for successful dissecting, dissociating, and short-term culturing of the somata of inner ear bipolar neurons for the purpose of patch-clamp recordings. Detailed instructions for preparing vestibular ganglion neurons are provided with the necessary modifications needed for plating spiral ganglion neurons. The protocol includes instructions for performing whole-cell patch-clamp recordings in the perforated-patch configuration. Example results characterizing the voltage-clamp recordings of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN)-mediated currents highlight the stability of perforated-patch recording configuration in comparison to the more standard ruptured-patch configuration. The combination of these methods, isolated somata plus perforated-patch-clamp recordings, can be used to study cellular processes that require long, stable recordings and the preservation of intracellular milieu, such as signaling through G-protein coupled receptors.

Presented here are methods providing detailed instructions for dissecting, dissociating, culturing, and patch-clamp recording from vestibular ganglion and spiral ganglion neurons of the inner ear.

Isolamento e Cultivo de Somatas Vestibulares e Gangliões Espirais de Roedores Neonatais para Gravações de Patch-Clamp

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

Source: Engel, D. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54601">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a technique for patch-clamp recording from the dendritic membrane surface. This helps to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels in dopaminergic neurons.

Gravações de Patch-Clamp do Dendrito de um Neurônio Dopaminérgico em uma Fatia de Cérebro

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Perforated Patch-Clamp Recordings of Inner Ear Sensory Neuron Cell Bodies

Source: Iyer, M. R., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/64908">Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2023).
This video demonstrates the patch-clamp technique for measuring ionic currents in inner ear sensory neuron cell bodies. It details the preparation and use of a polished patch-clamp pipette filled with an internal solution containing amphotericin B, which perforates the membrane to allow ion movement while preserving intracellular conditions. Voltage pulses are applied to trigger and record ion channel activity, providing insights into their properties and behavior.

Gravações perfuradas de patch-clamp de corpos celulares de neurônios sensoriais do ouvido interno

1. Recording
NOTE: In this procedure, patch-clamp recordings from the isolated ganglion are typically performed 12-24 h after the plating. Other labs have ...

Imaging and Optical Techniques

Whole-Cell Patch Clamp Recording in a Substantia Gelatinosa Neuron of a Spinal Cord Slice

Source: Zhu, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58479">Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for performing electrophysiological recordings in substantia gelatinosa (SG) neurons of spinal cord slices, using whole-cell patch-clamp techniques to analyze neuron firing patterns. This method allows the study of neural responses to stimuli in SG neurons of the spinal cord.