Name: subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons at JoVE.com

Ringrazio il dottor Vincent Seutin per il costante appoggio, Christelle Gillissen e Laurent Massotte per un&#39;eccellente assistenza tecnica, i dottori Jean Defourny e Sandra Ormenese per consigli con il microscopio confocale, il dottor Jacques destinare per il dono del secondo amplificatore Axopatch 200B, il GIGA-Imaging piattaforma per condividere le microscopio confocale e software Imaris e il dottor Stephen Freeman per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal FRS belga - FNRS (U.N002.13 e T.N0015.13) e pubblicato con il sostegno della Fondazione belga Università (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

L&#39;autore dichiara che non ha interessi finanziari concorrenti.

Questo rapporto descrive un protocollo step-by-step per realizzare registrazioni cellule intere Somatodendritic doppi e registrazioni dendritiche locali. È utile per determinare l&#39;influenza dei canali ionici (cioè, i h) sul decorso temporale dei potenziali postsinaptici e la mappatura della distribuzione del canale ionico (I h) lungo il dominio Somatodendritic dei neuroni dopaminergici nigral rispettivamente. Risultanti misurazioni elettrofisiologiche sono combinati per pubblicare istochimica hoc per recuperare la morfologia cellulare. La procedura è stata impiegata per studiare i neuroni DA situati nella substantia nigra, ma può essere generalizzata per i neuroni vicini nigrali GABA, ventrale tegmentale neuroni dopaminergici o altri neuroni del mesencefalo. Tutte le fasi possono anche essere seguiti per esaminare altri canali ionici espressi in dendriti dei neuroni della sostanza nera, senza importanti modifiche. Post hoc visualizzazione è particolarmente pertinente per i neuroni con assone-cuscinettodendriti, come i neuroni dell&#39;ippocampo, nigrali 25,26 interneuroni Oriens-Alveus 21 o alcuni neuroni CA1 piramidale 67. È interessante notare che i neuroni che condividono questa caratteristica sembra essere più comune di quanto generalmente si pensa 67. L&#39;analisi morfologica rivela anche la posizione precisa degli elettrodi e assone. La rilevazione di questi ultimi può essere ottimizzato per l&#39;etichettatura delle proteine espresse nel segmento assone iniziale (canali Na + voltaggio-dipendenti o Ankyrin G) utilizzando immunoistochimica 68,69. L&#39;affidabilità dei dati raccolti con le registrazioni dendritiche e la successiva etichettatura neuronale dipende sempre dalla qualità fetta. Massimo sforzo deve quindi essere applicato per preservare la vitalità delle cellule all&#39;interno del tessuto. Questo risultato è ottenuto con un trattamento delicato di animali sani, utensili di alta qualità e reagenti, sufficiente ossigenazione dei tessuti e temperature ghiacciate durante la preparazione di fette. condizioni di registrazione stabili si basano sulla selezione di neuroni sani. Nella modalità cellula intera, resistenza serie dovrebbe inizialmente essere il più basso possibile e mantenuta costante durante l&#39;esperimento. La stabilità delle registrazioni continui a dipendere manipolatori di alta qualità prive di deriva e vibrazioni. Tali perturbazioni possono essere ridotti ottimizzando la stabilità pipetta: verifica della connessione al titolare pipetta e headstage, controllare che i cavi micromanipolatore allentate, evitando sbalzi di temperatura o movimento scenico e controllando il meccanismo del manipolatore. Per le registrazioni doppio, metilsolfato 13,15,21 è stato incluso nella soluzione intracellulare, ma gluconato 9,14,25 può alternativamente essere impiegato. Tuttavia, l&#39;anione principale può alterare il potenziale di membrana 70,71 e alcune correnti voltaggio-dipendenti 72. soluzione intracellulare può essere completata con l&#39;ATP, GTP e fosfocreatina per preservare la physiolofunzioni gici dei neuroni. Inoltre, l&#39;aggiunta di un colorante fluorescente nella soluzione pipetta (ad esempio, Alexa 594 o solforodamina 101 41) per visualizzare i dendriti durante una registrazione somatica può essere utile ad esempio per inserire un applicazione di pressione (figura 7 in rif. 41) o un stimolante elettrica pipetta. La soluzione pipetta per le registrazioni delle cellule-attached contiene un&#39;alta concentrazione di K + e nessun Na + per registrare grandi I h. Degno di nota il rapporto di concentrazione di Na + / K + influenza l&#39;ampiezza della corrente 10, il potenziale di inversione della corrente 11 e la gating di I h 73. In alternativa, i h possono essere registrati anche con fuori-out 10. In questa configurazione di registrazione tuttavia, l&#39;ambiente intracellulare in prossimità dei canali può essere perturbata. Di conseguenza, le differenze di attivazione dipendente dalla tensione di I &lt;sub&gt; h si osserva quando le correnti si confrontano ottenuti utilizzando le patch di cella-attached e fuori-out 10. Gonfiore dei neuroni è talvolta incontrato durante la registrazione patch-clamp, e spesso deriva da cause diverse, come la bassa qualità dell&#39;acqua, forte squilibrio osmolarità e pH tra soluzioni 39 o errori intra ed extracellulare nella composizione delle soluzioni. La qualità delle registrazioni elettrofisiologiche incide direttamente sulla qualità della morfologia dei neuroni recuperati. Alta resistenza pipette somatici sono utilizzati per le registrazioni doppi (6 - 10 MW, come in Refs 6,11.) E per singole registrazioni somatiche dopo registrazioni cella-attached per minimizzare la diluizione del ambiente intracellulare 14. La registrazione integrale delle cellule somatiche a seguito della contabilizzazione delle cellule-attached è quindi mantenuta breve (&lt;10 min). patch fuori-fuori sia dal somatiche e dendritiche pipette sono essenziali per una corretta chiusura del cell membrana e successivo recupero della morfologia cellulare. Oltre alla struttura della cella, il contenuto neurochimico può essere determinato per i neuroni registrati 59,74. Per esempio, il intracellulare della proteina tirosina idrossilasi può essere immunolabeled per l&#39;identificazione inequivocabile di neuroni DA 13. Neuroni DA sono concentrate principalmente nel SN pars compacta, con una densità molto più bassa presente nel SN pars reticulata, dove vengono mescolati con un maggior numero di neuroni GABA 75. Mentre il corpo cellulare dei neuroni dopaminergici è spesso maggiore di quella dei neuroni GABA, l&#39;identificazione visiva di queste cellule con IR-videomicroscopia è incerta e parzialmente ostacolato dall&#39;opacità della pars compacta. Per aggirare queste limitazioni, la preselezione dei neuroni dopaminergici può essere facilitata mediante l&#39;uso di topi transgenici che esprimono un marcatore fluorescente in una specifica popolazione di neuroni (TH 65 o DAT per neuroni dopaminergici, GADper i neuroni GABA) e l&#39;illuminazione epifluorescenza. In alternativa, un colorante fluorescente può essere incluso nella soluzione dell&#39;elettrodo somatica per facilitare la visualizzazione dei dendriti. Maggiore risoluzione della cella fluorescente viene portato da Nipkow filatura confocale disco 14,22,30 o microscopia a due fotoni 7 combinati per IR-DGC 6. Diversi vantaggi sono riportate DGC rispetto al DIC. In primo luogo, come prismi DIC non sono necessari, l&#39;immagine IR-DGC può essere sovrapposto con un 49,52,53,76 immagine di fluorescenza. In secondo luogo, DGC può essere combinato con fotostimolazione e optogenetics 77. Uno svantaggio di preparazione fetta è la preservazione dell&#39;integrità dei neuroni. Neuroni DA estendono loro dendriti nei tre piani spaziali 78,79 e quindi troncamento del compartimento dendritico non possono essere completamente evitato in fette 80. La scelta dell&#39;orientamento delle fette (coronale, orizzontale o parasagittale) è un trade-off. L&#39;origine della innervazione e il disegno sperimentale deve essere considerato selezionare il giusto orientamento delle fette. patch dendritica diretta è la tecnica utilizzata per mappare la distribuzione di canali ionici funzionali nei diversi comparti delle cellule. Inoltre, questa tecnica offre per determinare la variabilità nelle proprietà funzionali dei canali 20. Come complemento la posizione e la densità dei canali ionici possono essere accertate mediante immunoistochimica ai livelli di luce e microscopia elettronica 17,23. Questo approccio offre anche la possibilità di determinare la densità di canale in piccole strutture calibro inaccessibili alle pipette di patch. Tuttavia questi canali potrebbero essere in uno stato funzionale distinta 24 o addirittura inattiva rispetto a quelli registrati utilizzando tecniche di patch-clamp. Entrambe le tecniche sono quindi necessarie per ottenere un quadro completo della posizione e proprietàcanali ionici di una determinata regione cellulare 17. Con lo sviluppo di coloranti sensibili alla tensione, imaging tensione è stato utilizzato per esaminare la propagazione di AP e EPSPS nei neuroni in più posizioni 81. In alternativa registrazioni dual patch-clamp, questo approccio può anche essere implementato per dendriti sottili che non sono accessibili alle pipette di patch ma richiedono calibrazione accurata del segnale e media. Mentre neuroni dopaminergici della SN e l&#39;area ventrale tegmentale sono ampiamente indagate tramite registrazioni somatiche nel contesto fisiologico e fisiopatologico, le proprietà funzionali dei loro dendriti rimane in gran parte sconosciuto in entrambe le condizioni. Patching da dendriti è stato implementato per i neuroni dopaminergici della sostanza nera da diversi gruppi con successo 13,25,26 e rimane il metodo di scelta per sezionare proprietà eccitabili di pagine di queste strutture subcellulari 8. registrazioni dendritiche forniscono un ulteriore opportunità di controllare l&#39;efficienza e la plasticità della trasmissione sinaptica e la plasticità dell&#39;eccitabilità dendritiche 82,83.

I neuroni ricevono informazioni sinaptica prevalentemente sulle loro dendriti. Excitatory e segnali sinaptici inibitori sviluppa dal loro sito di generazione al sito di integrazione in cui potenziali d&#39;azione (AP) vengono evocati come segnale di uscita. Sulla loro strada, potenziali sinaptici sono influenzati sia dalla struttura del dendriti e l&#39;interazione tra le proprietà della membrana passivi e attivi. La combinazione di questi parametri altamente variabili allarga la potenza computazionale di neuroni 1,2. Tuttavia, il piccolo diametro dendriti ostacola tuttavia lo studio delle loro proprietà elettriche. Il continuo sviluppo della tecnica patch-clamp 3, le ottiche 4 e perfezionamento di metodi per la preparazione fetta 5 nel corso degli ultimi decenni hanno permesso registrazioni da molto sottile (0,7-3 micron Ø) dendriti 6,7. Questi metodi erano, e sono, ancora in gran parte utilizzati per esaminare l&#39;eccitabilità dei dendriti in una varietà of neuroni 8. Registrazioni dendritiche diretti sono essenziali per determinare la distribuzione 9-19 e le differenze nelle proprietà funzionali 20-22 dei canali ionici in compartimenti neuronali distinti. Questi dati sono il necessario complemento delle distribuzioni canali ionici rilevate con immunoistochimica combinato alla luce e microscopia elettronica 23,24. Registrazioni Somatodendritic doppi sono stati implementati per esplorare la propagazione dei potenziali d&#39;azione 9,13-15,21,22,25-27 e la diffusione di potenziali sinaptici 13,16,18 lungo il dominio Somatodendritic dei neuroni, ottenere modelli dettagliati di cavi passivi 28- 30 e indagare la risoluzione temporale di integrazione neuronale 31. La sostanza nera (SN) è una regione situata nel mesencefalo coinvolto in numerose funzioni come il controllo del movimento, la codifica di ricompensa e comportamenti abituali. La diminuzione della dopamina causa della specificaperdita di dopaminergici (DA) neuroni della SN è associato con i disturbi motori osservati nei pazienti affetti da morbo di Parkinson 32. Il circuito nigrale è composto da due principali tipi di cellule: dopaminergici e GABAergici neuroni. È interessante notare che questi neuroni hanno diverse caratteristiche specifiche che li distinguono dagli altri neuroni. L&#39;assone di una gran parte dei neuroni dopaminergici e alcuni neuroni GABA proviene da un sito dendritica che indica che il pergolato dendritiche è eterogenea (assone-cuscinetto e dendriti assone-carente) 25,26,33. La morfologia di questi neuroni contrasta quindi con la tipica organizzazione dei neuroni in cui il trasferimento di informazioni segue la legge della polarizzazione dinamica emessa da Cajal: partendo da dendriti, al soma e infine Axon 34. Neuroni DA sono anche noti per il rilascio di dopamina dai loro dendriti 35, generare attività scoppio 36 e la plasticità 37 NMDA-recettore. la dissezionezione di questi fenomeni è sfuggente, senza registrazioni dirette dal sito in cui sono iniziati. Per ottenere intuizioni sul rapporto tra la posizione precisa e le proprietà funzionali dei canali ionici e il loro ruolo nella dell&#39;eccitabilità e informazioni trasferimento dendritiche nei neuroni nigrali, registrazioni dendritiche diretti sono il metodo di scelta. Questo rapporto descrive una procedura dettagliata che può essere utilizzato per ottenere registrazioni di singolo e doppio patch-clamp da dendriti dei neuroni della sostanza nera e il corrispondente post hoc biocitina etichettatura. I principi di base per l&#39;applicazione di patch somatico e la membrana dendritiche sono molto simili. In pratica però, registrazioni da siti dendritiche richiedono l&#39;ottimizzazione specifica rispetto alle registrazioni somatiche. registrazioni dendritiche successo affidano alla qualità delle fette, regolazione ottimale delle ottiche, approccio dolce della pipetta cerotto e la stabilità delle registrazioni.

<table><tbody><tr><td>Double-distillated water</td><td>Millipore</td><td>Super Q</td><td>Resistivity &gt;14 M&amp;Omega; cm, ideal 18.2 M&amp;Omega; cm at 25&amp;nbsp;&amp;deg;C, filtered (0.22 &amp;micro;m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>Microfilter candles</td><td>Robu</td><td>Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter</td><td></td></tr><tr><td>Tissue slicer with vibroprobe</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40</td></tr><tr><td>Tissue slicer</td><td>Dosaka</td><td>DTK-1000</td><td>cutting parameters: speed 4, frequency 7</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Gilette</td><td>Super Silver</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reserve chamber</td><td></td><td></td><td>Custom-made</td></tr><tr><td>PP beckers</td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0.22 &amp;micro;m</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue&amp;nbsp;</td><td>UHU</td><td>&quot;Sekunden Kleber&quot;</td><td>liquid glue</td></tr><tr><td>Recording chamber&amp;nbsp;</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>Slice mini chamber</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed</td></tr><tr><td>Dental wax</td><td>Colt&amp;egrave;ne/Whaledent</td><td></td><td>orthodontic tray wax strips</td></tr><tr><td>Platinum grid</td><td></td><td></td><td>to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>to fire-polish pipette tips</td></tr><tr><td>Potassium methyl sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Molecular probes</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>Manometer</td><td>GREISINGER electronic</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt Gradient Contrast</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulators</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>Frame grabber</td><td>The Imaging Source</td><td>DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>Condenser</td><td>Zeiss</td><td></td><td>high numerical aperture condenser working with oil</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective</td></tr><tr><td>Fourfold-changer</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td></td><td>between the camera and the microscope</td></tr><tr><td>Black &amp;amp; white video monitor</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>16-inch, 850 TV lines, analog</td></tr><tr><td>Sample Bottles, Amber Glass, with Cap</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>to transfer slices from the setup to histology room</td></tr><tr><td>The Axon Guide</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Book</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>Analysis of electrophysiological data</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td></tr><tr><td>Well cell culture plate</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td><td>for the staining of fixed slices</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td></tr><tr><td>mouse anti-TH monoclonal primary</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>working concentration: 1/1,000</td></tr><tr><td>goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>working concentration: 1/500</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade</td><td>Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Avidin DCS</td><td>Vector Lab</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td><td>plugin for ImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>Reconstruction of biocytin filled neurons</td></tr><tr><td>Neuromantic</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td><td>Reconstruction of biocytin filled neurons</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>Analysis of electrophysiological data</td></tr></tbody></table>

subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons

Dendriti dei neuroni dopaminergici ricevono e trasmettono ingresso sinaptico, sostegno potenziale d&#39;azione back-propagazione e il rilascio dei neurotrasmettitori. La comprensione di queste funzioni fondamentali farà luce sul trasferimento di informazioni in questi neuroni. patch-clamp dendritiche offrono la possibilità di esaminare direttamente le proprietà elettriche dei dendriti e canali ionici voltaggio-dipendenti sottostanti. Tuttavia, queste altre strutture non sono facilmente accessibili per pipette di patch a causa del loro piccolo diametro. Questo rapporto descrive una procedura passo-passo per raccogliere registrazioni stabili e affidabili dai dendriti dei neuroni dopaminergici a fette acuta. Misurazioni elettrofisiologiche sono combinati con il recupero post-hoc di morfologia cellulare. esperimenti di successo basano su una migliore preparazione delle fette, soluzioni e pipette, un&#39;adeguata regolazione delle ottiche e la stabilità della pipetta in contatto con la struttura registrata. principi standard di somatic registrazione patch-clamp sono applicati ai dendriti ma con un approccio più dolce della pipetta. Queste tecniche versatili possono essere implementate per affrontare varie questioni riguardanti le proprietà eccitabili di dendriti.

Il protocollo sopra descritta si propone di facilitare la raccolta di dati mediante patch-clamp dendritiche. Questa tecnica, combinata con istochimica post hoc, permette di acquisire conoscenze sui meccanismi di molti segnali elettrici provenienti o diffondendo in dendriti. Accesso diretto alle dendriti con pipette di patch è difficile, ma una particolare attenzione a diversi aspetti metodologici migliorerà il tasso di successo delle registrazioni. Uno sperimentatore sufficientemente sperimentato nella registrazione somatica stabile può aspettarsi di ottenere un&#39;elevata resistenza guarnizioni (GΩ) ed esperimenti complete sulla maggior parte dei tentativi. Da uno a due registrazioni dendritiche di alta qualità possono essere raccolti per la dissezione. La disponibilità di fettine di cervello di alta qualità contenenti somata sano e dendriti è un prerequisito per l&#39;accesso a pagine di queste strutture (Figura 1). i criteriuna per la selezione di questi neuroni sono una superficie liscia ed omogenea in tutto il cellulare e un soma e dendriti con basso contrasto quando osservata con ottimali regolato ottica (Figura 1A e 1B). Neuroni Selezione troppo forte contrasto in genere porta a registrazioni instabili (Figura 1C e 1C). Pertanto tali neuroni dovrebbero essere evitati. In confronto ad altri neuroni, i neuroni DA nigrali presentano caratteristiche morfologiche ed elettrofisiologiche specifiche. Queste caratteristiche generalmente valutati con una singola pipetta somatica possono essere osservati in dual somatiche (Figura 2) e le registrazioni Somatodendritic (Figura 3). Lunghe iniezioni di corrente iperpolarizzanti indurre un potenziale di rettifica membrana chiamata &#39;sag&#39; (Figure 2B e 5D). L&#39;assone origine, nella maggioranza dei casi, in un sito dendritico come identificatoutilizzando criteri complementari 13,25,26, indicando che il compartimento dendritico in questi neuroni è eterogenea (Figura 3A - 3B). Di conseguenza, il compartimento in cui l&#39;AP è osservato prima corrisponde al compartimento in cui l&#39;assone emerge (Figura 3C - 3D) 13,25,26. L&#39;assone è generalmente risolto da un vescichetta assonale causato da un taglio dell&#39;assone durante affettatura 64, ma questa struttura non viene rilevata sistematicamente. L&#39;abbassamento pronunciato osservato nei neuroni DA nigrali consecutivi all&#39;attivazione di I h suggerisce una elevata espressione di subunità HCN. Per determinare l&#39;influenza di I h sull&#39;integrazione dei segnali sinaptici, correnti (EPSC) forme d&#39;onda sinaptici come sono stati generati e iniettati tramite l&#39;elettrodo di registrazione dendritiche durante dual registrazioni Somatodendritic 55 (&lt;strong&gt; Figura 4). La cinetica di questi EPSCs simulati sono stati basati in aumento e il tempo di decadimento costanti reali EPSCs spontanee. Il aEPSP risultante è stato registrato con l&#39;elettrodo somatica. Applicazione Bagno della I h bloccante ZD 7288 aumentato la durata del aEPSP, indicando il contributo di I h per l&#39;andamento temporale dei segnali sinaptici (Figura 4B). ZD 7288 ha abolito anche il potenziale di membrana di rettifica confermando che i risultati sag da attivazione del I h (Figura 4C). I risultati ottenuti con EPSPS simulati possono essere correlati a esperimenti usando EPSPS evocati elettricamente 65. Per mappare la precisa distribuzione del canale nel dominio Somatodendritic di neuroni dopaminergici, le registrazioni delle cellule-attached sono stati attuati (Figura 5). Un sigillo ad alta resistenza (&gt;&gt; 1 G) è una necessità assoluta per le registrazioni delle cellule-attached (Figura 5B </strong&gt;). In dendriti dei neuroni dopaminergici, che h si attiva lentamente con gradini di tensione iperpolarizzanti lunghi e lo stato stazionario corrente viene raggiunto dopo che centinaia di ms (Figura 5C), come precedentemente indicato 66. Questa osservazione indica che i canali HCN espressi in dendriti dei neuroni DA hanno differenti subunità rispetto a quelli in neuroni piramidali o altri tipi di cellule 10,16,66. Poiché la distribuzione del canale potrebbe essere non omogenea nel compartimento dendritico e come il vano dendritica è essa stessa eterogenea, l&#39;identità del dendrite (assone fruttifero o dendrite nonaxon-cuscinetto) è rivelata confrontando l&#39;immagine IR-DGC con l&#39;immagine confocale dopo la colorazione biocitina (Figura 3A e B). Il recupero della morfologia delle cellule è quindi necessario per entrambe le registrazioni Somatodendritic dual e per le registrazioni delle cellule-attached tramite successive registrazioni integrali di cellule somatiche. Figura 1. Visualizzare il Soma e prossimale dendriti dei neuroni dopaminergici della sostanza nera Uso degli infrarossi Videomicroscopy. (A) IR-DGC immagine di un nigrale neurone DA mostra la soma e dendriti prossimale ed entrambe le pipette somatiche e dendritiche. Una registrazione Somatodendritic duale è stata eseguita con successo su questo neurone sano. Osservare il basso contrasto e la superficie liscia tutto il dominio Somatodendritic della cellula. (B) Un altro esempio di un neurone DA sano. (C) DA neurone con una superficie ruvida e irregolare e un contrasto più forte. Mentre una doppia registrazione è stata ottenuta, la stabilità è stata ottimale e la durata della registrazione era corto (~ 15 min) a causa di un aumento graduale della resistenza di accesso ad entrambe le pipette. (D) Secondo esempio di un neurone DA mostra un forte contrastata soma e dendriti prossimale. In questo caso, un forte aumento della resistenza di accesso è stata osservata poco dopo la pausa in modalità whole-cell. Un tentativo di diminuire la resistenza di accesso da pressione negativa non ha avuto successo. I neuroni nel pannello C e D potrebbero essere stati danneggiati durante la procedura di taglio e deve essere evitato per gli esperimenti. (E) simultanea doppia registrazione somatica in un ambiente sano neurone DA all&#39;inizio della registrazione. (F) stesso neurone come nel pannello E con un corpo cellulare gonfio dopo ~ 17 min. Si noti la completa assenza di contrasto, l&#39;aspetto palla-come del soma e la presenza del grande nucleo che non è evidente nei neuroni sani. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> Figura 2. </sTrong&gt; simultanea doppia registrazione somatica da un DA Neuron. (A) immagine IR-DGC durante la registrazione doppia somatica da un neurone DA. (B) iperpolarizzante e depolarizzante 1 s lunghi iniezioni correnti (-160 a 80 Pa, incrementare 80 pA) e variazioni di tensione corrispondenti registrati simultaneamente con entrambe le pipette di patch. Da notare la presenza del abbassamento nella traccia di tensione con il lungo passo corrente iperpolarizzante e la grande dopo-iperpolarizzazione dopo l&#39;AP durante l&#39;impulso di corrente depolarizzante. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> Figura 3. Dual S Registrazione omatodendritic in un DA Neuron. (A) immagine IR-DGC di un neurone DA. La distanza tra il dendritiche e somapipetta tic è 29 immagine micron. (B) confocale Z-proiezione del neurone nel pannello A marcato con avidina coniugata con isotiocianato di fluoresceina (FITC). Il neurone è stato riempito con biocitina durante la registrazione. L&#39;assone origine da un dendrite prossimale vicino al soma come indicato dalla freccia. (C) Registrazione simultanea dual Somatodendritic tensione whole-cell dal neurone nel pannello A. AP registrata nel soma (tracce tensione nero) e dendrite (rosso tensione tracce) in risposta a un 1 s fase di iniezione di corrente lungo la via somatica (sinistra, nero traccia corrente) e pipetta in alternativa dendritiche (a destra; rosso traccia corrente) (D) somatica e AP dendritiche mostrato a scala temporale espansa.. Con entrambi somatici o iniezione di corrente dendritica, somatica AP (nero) preceduto il dendritica AP (rosso). Il ritardo tra i punti di accesso in questo neurone era di 120 ms e 210 ms rispettivamente con somatica e iniezione di corrente dendritiche,. ritardisono stati misurati a AP ampiezza metà-massimale durante la fase di salita della AP. L&#39;AP è osservato prima nel vano vicino alla quale l&#39;assone emerge, confermando le osservazioni precedenti 25,26. In questo caso, la registrazione dendritica è fatto da una dendriti assone-carente. Un esempio di una registrazione da un assone dendriti-cuscinetto è in Rif. 13 (nella loro Fig. 1). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> Figura 4. Propagazione della EPSPS artificiali Lungo la Somatodendritic Asse di DA neuroni. (A) immagine IR-DGC di un neurone DA. La distanza tra il dendritiche e pipetta somatica è di 45 micron. Entrambe le pipette di patch sono in modalità di cellula intera registrazione corrente-clamp. (B) Correnteregistrato con la pipetta dendritiche in current-clamp e utilizzato per generare la EPSP artificiale (in alto). La corrente è ottenuta mediante l&#39;iniezione di una forma d&#39;onda EPSC-like (t aumento = 0,6 ms; T si decadimento = 3 ms; ampiezza = 100 pA) tramite la registrazione pipetta dendritica 55. In fondo, aEPSPs registrati alla soma in condizioni di controllo (nero) propagate e dopo l&#39;applicazione il bagno del ZD7288 I h bloccante (30 micron; traccia rossa). Ogni traccia tensione è la media di 40 singole scansioni. Osservare il grande aumento della durata EPSP in presenza di ZD7288 indicante il contributo di I h per la durata d&#39;EPSPS. (C) Tensione tracce registrate dal soma in condizioni di controllo (nero) e dopo l&#39;applicazione di 30 pM ZD 7288 ( rosso) in risposta ad una lunga (30 pA; 1 s) passaggio corrente iperpolarizzante. Si noti l&#39;assenza del potenziale di membrana rettificazione (abbassamento) dopo il blocco di I &lt;sub&gt; h. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> Figura 5. Presenza di I h in dendriti di DA Neuron. (A) IR-DGC immagine di un neurone DA e pipetta sul dendrite prossimale. (B) capacitivi e perdite correnti durante un comando di tensione 5 mV in configurazione cell-attached. La resistenza sigillo era 5 GΩ in questo esempio passo (C) Tensione iperpolarizzanti. (90 mV; superiore) da un potenziale di membrana di 0 mV indotto a Ho attivando lentamente h. La traccia corrente è stato invertito e dotato di una singola funzione esponenziale dando una costante di tempo T si = 632 ms. (D) Tensionerisposte del soma registrato cellula intera (pannello A) a 1 s iper e depolarizzanti impulsi di corrente (-160 a 120 pA, 40 pA incremento). La registrazione intero-cellula somatica è stata eseguita dopo la registrazione cella-attached. Si noti l&#39;assenza di AP dovuto all&#39;applicazione extracellulare TTX e Cd 2+ sopprimere scarica spontanea durante la registrazione cell-attached. Questi voltaggio-dipendenti Na + e Ca 2+ sono stati aggiunti bloccanti attuali per sopprimere le correnti d&#39;azione. Pannelli A - D sono dallo stesso neurone (E) Immagine IR-DIC di un altro neurone DA e una pipetta dendritiche correnti (F) voltaggio-dipendenti attivati da un impulso di prova a 0 mV da un prepulse 50 ms a -120 mV.. in una patch fuori-out asportato dal dendrite prossimale del neurone nel pannello di E. Tenere potenziale -80 mV. Si noti l&#39;inattivazione dipendente dal tempo della corrente. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare un più grande</a>versione di questa figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sostanza </td><td> g / mol </td><td> Concentrazione </td><td> per 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 125 mm </td><td> 7.305 g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2.100 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74,551 </td><td> 2,5 mm </td><td> 0,186 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1,25 mm </td><td> 0.172 g </td></tr><tr><td> glucosio </td><td> 198,17 </td><td> 25 mM </td><td> 4,95 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (soluzione) </td><td> 1 mM </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (soluzione) </td><td> 2 mm </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarità: ~ 310 mOsmol / L (range ottimale: 314-325 mOsmol / L), pH = 7.4 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: liquido cerebrospinale artificiale (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sostanza </td><td> g / mol </td><td> Concentrazione </td><td> per 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58,443 </td><td> 87 mm </td><td> 5.084 g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 84,007 </td><td> 25 mM </td><td> 2,1001 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 7.551 </td><td> 2,5 mm </td><td> 0,18,637 mila g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1,25 mm </td><td> 0,17,248 mila g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (soluzione) </td><td> 7 mm </td><td> 7 mL </td></tr><tr><td> glucosio </td><td> 198,17 </td><td> 10 mM </td><td> 1,9817 g &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> saccarosio </td><td> 342,29 </td><td> 75 mm </td><td> 25,672 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (soluzione) </td><td> 0,5 mm </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarità: ~ 326 mOsmol / L, pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabella 2: saccarosio-ACSF per preparare fette. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sostanza </td><td> g / mol </td><td> Concentrazione </td><td> per 100 ml </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150.2 </td><td> 120 mm </td><td> 1,8024 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.56 </td><td> 20 mm </td><td> 0,14,912 mila g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (soluzione) </td><td> 2 mm </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td> 551,1 </td><td> 2 mm </td><td> 0,1102 g </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td> 523,2 </td><td> 0,5 mm </td><td> 0,02,661 mila g </td></tr><tr><td> Na 2 -Phosphocreatine </td><td> 255,1 </td><td> 5 mM </td><td> 0,1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380,4 </td><td> 0,1 mm </td><td> 3.803 mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23,831 mila g </td></tr><tr><td> biocitina </td><td> 1 mg / mL </td><td></td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarità: ~ 302 mOsmol / L, pH = 7,2 regolato con KOH </td></tr></tbody></table> Tabella 3: soluzione intracellulare per le registrazioni doppio. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sostanza </td><td> g / mol </td><td> Concentrazione </td><td> per 100mL </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.56 </td><td> 120 mm </td><td> 0,8947 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (soluzione) </td><td> 2 mm </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (soluzione) </td><td> 1 mM </td><td> 100 pl </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23,831 mila </td></tr><tr><td> TEA-Cl </td><td> 165.7 </td><td> 20 mm </td><td> 0,3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94.11 </td><td> 5 mM </td><td> 0,04,705 mila g </td></tr><tr><td> BaCl 2 </td><td> 244,26 </td><td> 1 mM </td><td> 0,02,443 mila g </td></tr><tr><td> CdCl 2 </td><td> 183.32 </td><td> 0,02 mm </td><td> 0.3666 mg </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 mM </td><td> 200 nm </td><td> 20 microlitri </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolarità: ~ 290 mOsmol / L, regolato con D-glucosio (Rif. 16); pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: soluzione elettrodi per le registrazioni delle cellule-attached.

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons at JoVE.com

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

subcellular-patch-clamp-recordings-from-somatodendritic-domain-nigral

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.9K Views.  Quartier Hôpital, 














University
of Liege. Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro. 

Video: Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of recordings are conducted on dissociated DRG neurons, which is a standard preparation for most laboratories. Neuronal properties, however, can be altered by axonal injury resulting from enzyme digestion used in acquiring dissociated neurons. Further, dissociated neuron preparations cannot fully represent the microenvironment of the DRG since loss of contact with satellite glial cells that surround the primary sensory neurons is an unavoidable consequence of this method. To overcome the limitations in using conventional dissociated DRG neurons for patch clamp recordings, in this report we describe a method to prepare intact DRGs and conduct patch clamp recordings on individual primary sensory neurons ex vivo. This approach permits the fast and straightforward preparation of intact DRGs, mimicking in vivo conditions by keeping DRG neurons associated with their surrounding satellite glial cells and basement membrane. Furthermore, the method avoids axonal injury from manipulation and enzyme digestion such as when dissociating DRGs. This ex vivo preparation can additionally be used to study the interaction between primary sensory neurons and satellite glial cells.

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

Bloccare Registrazioni patch intatta dei gangli dorsali da ratti adulti

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Ricerca

Biochimica

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

L&#39;applicazione di una conduttanza recettore NMDA nei neuroni dopaminergici mesencefalo Rat Utilizzando la tecnica dinamica morsetto

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Neuroscienze

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, difficult to separate and also not easily identified by their morphology. Thus, it is often difficult to analyze gene expression in a specific neuron type. Here we document a procedure that combines whole-cell patch clamp recording techniques with single-cell reverse transcription polymerase chain reaction (scRT-PCR) to profile mRNA expression in different types of neurons in the substantial nigra. Electrophysiological techniques are first used to record the neurophysiological and functional properties of individual neurons. Then, the cytoplasm of single electrophysiologically characterized nigral neurons is aspirated and subjected to scRT-PCR analysis to obtain mRNA expression profiles for neurotransmitter synthesis enzymes, receptors, and ion channels. The high selectivity and sensitivity make this method particularly useful when immunohistochemistry can not be used due to a lack of suitable antibody or low expression level of the protein. This method is also applicable to neurons in other brain areas.

Neurons are first characterized electrophysiologically. Then the cytoplasm from the recorded neuron is aspirated and subjected to reverse transcription-PCR analysis to detect the expression of mRNAs for neurotransmitter synthesis enzymes, ion channels, and receptors.

Profiling di potassio voltaggio-dipendenti espressione di mRNA nei neuroni Canale nigral con singola cella di RT-PCR Tecniche

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is terminated by diffusion2-3, extracellular enzymes4, and membrane transporters5. The dopamine transporter, located in the peri-synaptic cleft of dopamine neurons clears the released amines through an inward dopamine flux (uptake). The dopamine transporter can also work in reverse direction to release amines from inside to outside in a process called outward transport or efflux of dopamine5. More than 20 years ago Sulzer et al. reported the dopamine transporter can operate in two modes of activity: forward (uptake) and reverse (efflux)5. The neurotransmitter released via efflux through the transporter can move a large amount of dopamine to the extracellular space, and has been shown to play a major regulatory role in extracellular dopamine homeostasis6. Here we describe how simultaneous patch clamp and amperometry recording can be used to measure released dopamine via the efflux mechanism with millisecond time resolution when the membrane potential is controlled. For this, whole-cell current and oxidative (amperometric) signals are measured simultaneously using an Axopatch 200B amplifier (Molecular Devices, with a low-pass Bessel filter set at 1,000 Hz for whole-cell current recording). For amperometry recording a carbon fiber electrode is connected to a second amplifier (Axopatch 200B) and is placed adjacent to the plasma membrane and held at +700 mV. The whole-cell and oxidative (amperometric) currents can be recorded and the current-voltage relationship can be generated using a voltage step protocol. Unlike the usual amperometric calibration, which requires conversion to concentration, the current is reported directly without considering the effective volume7. Thus, the resulting data represent a lower limit to dopamine efflux because some transmitter is lost to the bulk solution.

The amperometric technique measures dopamine release from a single cell by detecting the oxidative current produced by spontaneous dopamine oxidization. Simultaneous voltage clamp and amperometry methodology reveal the mechanistic relationship between the overall "activity" of dopamine transporter and the regulatory role of this activity on the reverse transport of dopamine.

Cella di misura singola di rilascio di dopamina con simultanea di tensione-clamp e Amperometria

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers easy identification and characterization of these cell types, prerequisites to study their specific functions. This article describes the multiplex single cell reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) protocol, which allows, after patch-clamp recording in slices, to detect simultaneously the expression of tens of genes in a single cell. This simple method can be implemented with morphological characterization and is widely applicable to determine the phenotypic traits of various cell types and their particular cellular environment, such as in the vicinity of blood vessels. The principle of this protocol is to record a cell with the patch-clamp technique, to harvest and reverse transcribe its cytoplasmic content, and to detect qualitatively the expression of a predefined set of genes by multiplex PCR. It requires a careful design of PCR primers and intracellular patch-clamp solution compatible with RT-PCR. To ensure a selective and reliable transcript detection, this technique also requires appropriate controls from cytoplasm harvesting to amplification steps. Although precautions discussed here must be strictly followed, virtually any electrophysiological laboratory can use the multiplex single cell RT-PCR technique.

This protocol describes the critical steps and precautions required to perform single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. This technique is a simple and effective method to analyze the expression profile of a predetermined set of genes from a single cell characterized by patch-clamp recordings.

Singola cella multisala trascrizione inversa Polymerase Chain Reaction dopo Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Biologia

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter receptors that contribute to cell diversity across this population. This protocol outlines the steps necessary for successful dissecting, dissociating, and short-term culturing of the somata of inner ear bipolar neurons for the purpose of patch-clamp recordings. Detailed instructions for preparing vestibular ganglion neurons are provided with the necessary modifications needed for plating spiral ganglion neurons. The protocol includes instructions for performing whole-cell patch-clamp recordings in the perforated-patch configuration. Example results characterizing the voltage-clamp recordings of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN)-mediated currents highlight the stability of perforated-patch recording configuration in comparison to the more standard ruptured-patch configuration. The combination of these methods, isolated somata plus perforated-patch-clamp recordings, can be used to study cellular processes that require long, stable recordings and the preservation of intracellular milieu, such as signaling through G-protein coupled receptors.

Presented here are methods providing detailed instructions for dissecting, dissociating, culturing, and patch-clamp recording from vestibular ganglion and spiral ganglion neurons of the inner ear.

Isolare e coltivare i somata gangliari vestibolari e spirali da roditori neonatali per registrazioni con patch-clamp

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

Source: Engel, D. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54601">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a technique for patch-clamp recording from the dendritic membrane surface. This helps to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels in dopaminergic neurons.

Registrazioni Patch-Clamp dal dendrite di un neurone dopaminergico in una fetta di cervello

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Perforated Patch-Clamp Recordings of Inner Ear Sensory Neuron Cell Bodies

Source: Iyer, M. R., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/64908">Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2023).
This video demonstrates the patch-clamp technique for measuring ionic currents in inner ear sensory neuron cell bodies. It details the preparation and use of a polished patch-clamp pipette filled with an internal solution containing amphotericin B, which perforates the membrane to allow ion movement while preserving intracellular conditions. Voltage pulses are applied to trigger and record ion channel activity, providing insights into their properties and behavior.

Registrazioni perforate Patch-Clamp dei corpi cellulari dei neuroni sensoriali dell'orecchio interno

1. Recording
NOTE: In this procedure, patch-clamp recordings from the isolated ganglion are typically performed 12-24 h after the plating. Other labs have ...

Imaging and Optical Techniques

Whole-Cell Patch Clamp Recording in a Substantia Gelatinosa Neuron of a Spinal Cord Slice

Source: Zhu, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58479">Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for performing electrophysiological recordings in substantia gelatinosa (SG) neurons of spinal cord slices, using whole-cell patch-clamp techniques to analyze neuron firing patterns. This method allows the study of neural responses to stimuli in SG neurons of the spinal cord.

Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video