Agradecemos o Dr. Alexandre Mourot por seus comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por concessões da Agence Nationale de la Recherche (ANR 2011 MALZ 003 01; ANR-15-CE16-0010 e ANR-17-CE37-0010-03), BLG é suportado pelo fellowship da Fondation pour la Recherche sur Alzheimer. Agradecemos a facilidade animal do IBPS (Paris, França).

Os autores não têm nada para divulgar.

Única célula multiplex RT-PCR após remendo-braçadeira pode sondar simultaneamente e de forma confiável a expressão de mais de 30 genes em células electrophysiologically identificadas5. Analisando a expressão do gene no nível da célula única requer iniciadores de PCR altamente eficientes. Um dos passos mais limitantes é a coleção de conteúdo da célula. Sua eficiência depende do diâmetro da ponta da pipeta de patch, que deve ser tão grande quanto possível enquanto o tamanho de pilha de correspondência. Pipetas com um diâmetro de ponta aberta 1-2 µm foram comprovadas para ser apropriado para tipos mais neuronais. Também é essencial para garantir que somente o conteúdo celular é coletado e não o tecido circundante. Isto é conseguido através do controle de electrophysiologically a preservação de um selo apertado durante a colheita. A formação de uma configuração de remendo do exterior-para fora durante a retirada da pipeta mais protege o citoplasma colhido de restos celulares. A taxa de sucesso da célula única QUE RT-PCR multiplex também depende da abundância de mRNAs do tipo célula investigadas. Por exemplo, o rendimento obtido com astrócitos, que expressam os mRNAs em quantidades relativamente baixas3, é geralmente mais baixo do que o obtido com os neurônios e, portanto, requer aumento de15,de tamanho de amostra16. A transcrição reversa, que tem uma baixa eficiência em tubos de48, é a reação limitante do single cell multiplex RT-PCR. Portanto, é fundamental usar reagentes de qualidade superior, para armazená-los como alíquotas a-80 ° C e usá-los apenas por um dia. Finalmente, a atividade da DNA polimerase da RTase é muitas vezes uma fonte negligenciada de formação do dímero da primeira demão. Para resolver esse problema, realizar um começo quente com primers é fundamental para aumentar a eficiência de amplificação. Além disso, isso reduzirá o efeito inibitório sobre a Taq DNA polimerase atividade49de RTase.
A técnica de RT-PCR multiplex única célula é altamente versátil. Tem sido extensivamente utilizado em roedores10,11,13,19,20,34,50,51,52 ,53,54 , mas pode ser adaptado para modelos virtualmente todos os animais e genes, assumindo que o tecido e gene sequências estão disponíveis. Várias soluções de remendo-braçadeira podem ser usadas, desde que não interfiram com o RT-PCR em ensaios de célula livre. Por exemplo, soluções internas baseadas em K+ ou cátions Cs+ , Cl– ou gluconato de tem sido usado com sucesso6,36,41,55.
Clássicos resultados falsos negativos decorrem de contaminação de RNase do filamento de pipeta de remendo e/ou solução de remendo-braçadeira interna. Cuidadosamente, desinfetando o filamento e validar a solução interna geralmente resolvem este problema. Resultados falsos negativos também podem ocorrer quando um gene é expresso em um nível baixo de célula única, uma vez que apenas uma parte do citoplasma é colhida. A qualidade da colheita pode ser aumentada usando pipetas maiores e/ou reduzindo o tempo de gravação a célula inteira. Colheita de qualidade pode ser avaliada, incluindo um gene conhecido a ser expressa em um nível baixo de células únicas20. Resultados falso-positivos podem ocorrer com a qualidade do tecido ruim, em que a quantidade de restos celulares de contaminantes é elevada. Testar a presença de detritos é feito inserindo uma pipeta de remendo a fatia sem executar qualquer selo e liberando a pressão positiva antes da remoção da pipeta. A presença de materiais ampliáveis então é sondada por multiplex RT-PCR42. Silanizar a pipeta de remendo também tem sido utilizado para reduzir a coleção de contaminantes extracelular56. Única célula PCR é uma técnica muito sensível que pode detectar tão pouco quanto uma única cópia do de DNA encalhado dobro57. No caso de genes intrão-menos, o gDNA contido no núcleo também pode produzir resultados falsos positivos. Evitando a coleção de gDNA colocando a pipeta longe do núcleo durante a colheita ajuda a resolver esta questão. A presença de gDNA pode confiantemente ser sondada amplificando uma sequência intrônicas25.
A detecção de moléculas de mRNA por RT-PCR torna-se confiável em 10 cópias44, presumivelmente por causa da baixa eficiência do RTase48e pode levar a uma sob a deteção de transcrições de baixa abundância26,42. Isso pode ser problemático no caso de genes intrão-menos. Com efeito, evitar colheita do núcleo reduz a quantidade de citoplasma que pode ser coletada e, portanto, a sensibilidade de detecção. A combinação de célula única RT-PCR após remendo-braçadeira com biocytin rotulagem exige que a forma da célula é mantida tanto quanto possível (Figura 3). Inevitavelmente, isso reduz a quantidade de material que pode ser recolhido, reduzindo assim a taxa de sucesso. Um compromisso entre o citoplasma coleta e preservação da morfologia celular é obrigatório.
Dados de RT-PCR multiplex unicelulares não são quantitativos, como só dão informação sobre se os cDNAs são presentes ou ausentes em material coletado. No entanto, por causa dos limites de deteção descritos acima, a ocorrência da deteção a nível de população pode refletir a abundância dos genes a nível de célula única. Abordagens alternativas permitem a geração de mais dados quantitativos, mas as limitações técnicas impostas pela maior parte por suas estratégias de amplificação específica (ou seja, quantificação relativa dos genes homólogos ou RT-qPCR) restringem o número de genes que podem ser simultaneamente analisaram41,53,55,58,59,60,61,62,63 ,64,,65,66. A combinação recente de gravações de remendo-braçadeira e única célula RNaseq, conhecido como Patch-seq30,31, permite análise quantitativa transcriptomic de células electrophysiologically-caracteriza-se. É uma abordagem nova e promissora, ainda requer acesso ao elevado-throughput sequenciadores e os dados gerados exigem análise demorada.

O córtex cerebral é composto por numerosos tipos de células envolvidos em vários processos fisiológicos. Sua identificação e caracterização, um pré-requisito para a compreensão de suas funções específicas, podem ser muito desafiadoras dada a grande diversidade morfológica, fisiológica e molecular que caracteriza tipos de célula cortical1 ,2,3,4.
Célula única multiplex RT-PCR baseia-se na combinação da remendo-braçadeira e técnicas de RT-PCR. Ele pode sondar simultaneamente a expressão de mais de 30 genes predefinidos em células electrophysiologically identificadas5. A inclusão de um marcador neuronal em gravação pipeta mais permite a caracterização morfológica das células gravadas após a revelação histochemical6,7,8,9, 10. é uma técnica muito útil para a classificação dos tipos neuronais com base na análise multivariada de suas características fenotípicas5,9,10,11,12 ,13,14. Única célula multiplex RT-PCR é também adequado para a caracterização de células não-neuronais como astrócitos15,16,17e pode ser aplicado virtualmente a cada cérebro estrutura18, 19,20,21,22,23 e célula tipo, supondo que eles podem ser gravados em configuração de células inteiras.
Esta técnica é muito conveniente para a identificação das fontes de celulares e/ou alvos de transmissão sistemas7,8,15,16,20,21, 24,25,26,,27,28, especialmente quando os anticorpos específicos são escassos. Ele se baseia em gravações de remendo-braçadeira de células visualmente identificados29e assim também permite a segmentação de células em um ambiente celular específico8,15,16. Além disso desde a cytoarchitecture do tecido cerebral é preservada em fatias do cérebro, essa abordagem também permite que o estudo das relações anatômicas das células caracterizadas com elementos neuronais e não-neuronal7,8 , 18.
Uma vez que esta técnica é limitada pela quantidade de citoplasma colhida e pela eficiência do RT, a detecção de mRNA, expressado em número de cópia baixa pode ser difícil. Embora outras abordagens baseadas na tecnologia RNaseq permitem analisar a transcriptoma inteira de células únicas3,4,30,31, não necessariamente precisam de sequenciadores caros elevado-throughput disponível para todos os laboratórios. Desde que a técnica de RT-PCR multiplex única célula usa pontos de extremidade do PCR, exige somente thermocyclers amplamente disponível. Ele pode ser facilmente desenvolvido em laboratórios equipados com instalações eletrofisiológicas e não requer equipamento caro. Ele pode fornecer, dentro de um dia, uma análise qualitativa da expressão de um conjunto predefinido de genes. Assim, esta abordagem oferece um fácil acesso para a caracterização molecular das células individuais de forma rápida.

<table><tbody><tr><td>MACAW v.2.0.5</td><td>NCBI</td><td></td><td>Multiple alignement for primer design</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>VWR</td><td>443852A</td><td>RT</td></tr><tr><td>Random primers</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>11034731001</td><td>RT</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4065-52</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>RNasin Ribonuclease Inhibitors</td><td>Promega</td><td>N2511</td><td>RT</td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td>RT</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Qiagen</td><td>201205</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M5904-5ML</td><td>PCR</td></tr><tr><td>PCR primers</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>PCR / desalted and diluted at 200 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>Tubes, 0.5 mL, flat cap</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AB0350</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT10 Series - 10 &amp;micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT10</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT20 Series - 20 &amp;micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT20</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT200 Series - 200 &amp;micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT200</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>BT1000 Series - 1000 &amp;micro;L Filter Tip</td><td>Neptune Scientific</td><td>BT1000.96</td><td>RT and PCR</td></tr><tr><td>DNA Thermal Cylcer</td><td>Perkin Elmer Cetus</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E1510-10ML</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA buffer</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>T4415-1L</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>&amp;Phi;X174 DNA-Hae III Digest</td><td>NEB (New England BioLabs)</td><td>N3026S</td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>EDA 290</td><td>Kodak</td><td></td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Electrophoresis Power supply EPS 3500</td><td>Pharmacia Biotech</td><td></td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Midi Horizontal Elecrophoresis Unit Model SHU13</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td></td><td>Agarose gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Smooth paper with satin appearance</td><td>Fisherbrand</td><td>1748B</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Potassium Hydroxyde</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60377</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;-tetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>E3889</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H4034</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Potassium D-gluconate</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G4500</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Magnesium chloride solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>M1028</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>5500 Vapor Pressure Osmometer</td><td>Wescor</td><td></td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>B4261</td><td>Patch clamp internal solution</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5016</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>49159</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S6191</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>60128</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>31437-M</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S5011</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Magnesium chloride solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>63069</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Calcium chloride solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>21115</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Kynurenic acid</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>K3375</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Healthcare UK</td><td></td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>VT 1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235613</td><td>Slice preparation</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>H1009</td><td>Patch Clamp set-up cleaning</td></tr><tr><td>Thin Wall Glass Capillaries with filament</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>PP-83</td><td>Narishige</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Eppendorf Microloader</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>BX51WI Upright microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>XC-ST70/CE CCD B/W VIDEO CAMERA</td><td>Sony</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Axopatch 200B Amplifier</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>Digidata 1440</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>pCLAMP 10 software suite</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Patch Clamp</td></tr><tr><td>10 mL syringe</td><td>Terumo</td><td>SS-10ES</td><td>Expelling</td></tr><tr><td>E Series with Straight Body (Holder)</td><td>Phymep</td><td>64-0997</td><td>Expelling</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S7907</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>S8282</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>P6148</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>X100</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Gelatin from cold water fish skin</td><td>Sigma-Aldrich (Merck)</td><td>G7041</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S11223</td><td>Histochemical revelation</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>Histochemical revelation</td></tr></tbody></table>

single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp

O córtex cerebral é composto de numerosos tipos de células exibindo várias características morfológicas, fisiológicas e moleculares. Esta diversidade dificulta a fácil identificação e caracterização destes tipos de células, os pré-requisitos para estudar suas funções específicas. Este artigo descreve o multiplex única célula transcrição reversa do polymerase reação em cadeia (RT-PCR) protocolo, que permite, depois da gravação em fatias, remendo-braçadeira para detectar, simultaneamente, a expressão de dezenas de genes em uma única célula. Este método simples pode ser implementado com caracterização morfológica e é amplamente aplicável para determinar as características fenotípicas de vários tipos de células e seu ambiente celular particular, como na proximidade de vasos sanguíneos. O princípio do presente protocolo é gravar uma célula com a técnica patch-clamp, colheita e inverter transcreva seu conteúdo citoplasmático, e para detectar qualitativamente a expressão de um conjunto predefinido de genes por multiplex PCR. Requer um design cuidadoso dos iniciadores de PCR e intracelular remendo-braçadeira solução compatível com RT-PCR. Para garantir uma transcrição seletiva e confiável detecção, esta técnica também exige controles apropriados do citoplasma colheita às etapas de amplificação. Embora discutido aqui deve ser rigorosamente as precauções, praticamente qualquer laboratório eletrofisiológico pode usar célula única técnica de RT-PCR multiplex.

Uma validação representante de RT-PCR multiplex é mostrada na Figura 3. O protocolo foi concebido para sondar, simultaneamente, a expressão de 12 diferentes genes. O vGluT1 de transporte vesicular glutamato foi tomada como um controle positivo para glutamatérgico neurônios42. O GABA sintetizando enzimas (GAD65 e 67 GAD), neuropeptídeo Y (NPY) e somatostatina (SOM) foram utilizados como marcadores de gabaérgica interneurônios3,5,11. A enzima ciclo-oxigenase-2 (COX-2) foi usada como um marcador do célula piramidal subpopulação3,16.
As subunidades de ATP1α1-3 do at+/k+ ATPase e as subunidades KIR 6.2 e SUR1 dos canais de K sensíveis ao ATP+ foram escolhidas para avaliar a relação entre a atividade neuronal e Estados metabólicos43. Desde que KIR 6.2 é um gene intrão-menos, o intrão SOM foi incluída como um controle de genômico. O protocolo foi testado em 1 ng de reverso transcrito o RNA total extraído todo cérebro de rato, que corresponde aproximadamente às transcrições de 20 células de44. O PCR multiplex produzidos 12 amplicons do tamanho esperado (Figura 3 e tabela 1) demonstrando a sensibilidade e a eficiência do protocolo. O controlo negativo realizado sem RNA produzido sem amplicon (dados não mostrados).
Um neurônio piramidal camada V visualmente foi identificado por sua grande soma e um dendrito apical proeminente (Figura 5A, inserir). Gravação de celular revelou Propriedades eletrofisiológicas típicas de camada V regular spiking neurônios5,,45,46 com, nomeadamente, uma baixa resistência de entrada, potenciais de ação de longa duração e pico pronunciado adaptação de frequência (Figura 5A). A análise molecular deste neurônio revelou a expressão de vGluT1 (Figura 5B), confirmando sua glutamatérgico fenótipo42,46. Este neurônio também expresso SOM, ATP1α1 e 3 subunidades do at+/k+ ATPase. Biocytin rotulagem dos neurônios gravados confirmou uma morfologia piramidal (Figura 5).
Como esperado de neurônios glutamatérgico, a análise molecular de 26 células piramidais de camada V revelou expressão de VGluT1, mas nenhum dos dois GADs (Figura 5). Marcadores de interneurônios raramente foram observados5,42,46. COX-2, expressado principalmente pela camada II-III células piramidais3,16, não foi detectado em células piramidais de camada V. O ATP1α1 e 3 subunidades foram mais frequentemente observadas do que a subunidade de ATP1α23. As subunidades KIR 6.2 e SUR1 raramente foram detectadas nos neurônios piramidais camada V, que é consistente com sua expressão preferencial nas camadas superiores3,43. Cuidado foi tomado para não colher os núcleos, resultando em uma rara detecção de intrões SOM (3 dos 26 células, ou seja, 12%).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57627/57627fig1.jpg"> Figura 1: caixa dedicada para única célula RT-PCR. Lista de materiais reservados para RT-PCR após remendo-braçadeira. (1) capilares de vidro de borosilicato, (2) 20 µ l longo, fina, flexíveis dicas, (3) 20 micropipeta µ l, expulsor (4) feito em casa, tubos PCR (5) 500 µ l, (6) 10 µ l aerossol resistente filtro dicas e marcadores (7) permanentes. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57627/57627fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57627/57627fig2.jpg"> Figura 2: estratégia de design da primeira demão do PCR. (A) representação esquemática da sequência de codificação do cDNA de COX 2 alinhado para a sequência do cromossoma 2 rato contendo o gene COX-2. Exões são representadas por caixas-pretas e os intrões na gDNA por caixas brancas. Observe as lacunas do cDNA correspondente as sequências intrônicas em gDNA. Exemplos representativos dos oligonucleotides ruins e boas representados como setas vermelhas e verdes, respectivamente. Setas direita e esquerda denotam cartilhas para diante e reversos. (B) sequências e estruturas secundárias dos oligonucleotides mostradas em (A). Painéis esquerdos e direito indicam a formação de autocomplementaridade e autodímero do grampo de cabelo, respectivamente. O oligonucleotide B1 exibe ambos um forte gancho de cabelo autocomplementaridade e dímero formação enquanto o oligonucleotide B2 mostra apenas a formação do dímero. Oligonucleotídeos tanto B3 e B4 tem nenhum gancho autocomplementaridade e sem formação de dímero; Eles são intrão overspanning (A) e foram selecionados como iniciadores de PCR potenciais (ver tabela 1). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57627/57627fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57627/57627fig3.jpg"> Figura 3: validação de PCR multiplex. 1 ng do RNA total do cérebro do rato foi submetida a uma transcrição reversa seguida de duas rodadas de amplificação por PCR. Os 12 produtos PCR foram resolvidos em corredores separados por eletroforese em gel de agarose em paralelo com Φx174 digerida pelo HaeIII. Os produtos PCR segundo tinham tamanhos (em PA) previstos por sequências: 153 (vGluT1), 248 (GAD65), 255 (GAD67), 181 (COX 2), 220 (NPY), 146 (SOM), 183 (ATP1a1), 213 (ATP1a2), 128 (ATP1a3), 342 (KIR 6.2), 211 (SUR1) e 182 (SOMint). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57627/57627fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57627/57627fig4.jpg"> Figura 4: Patch-clamp colheita em fatias de cérebro. Uma vez que uma célula é identificada visualmente, a pipeta de gravação é abordada com uma pressão positiva para evitar a contaminação de restos celulares na ponta da pipeta. Observe a covinha na membrana deste neurônio. Pressão positiva é então interrompido a fim de formar uma configuração de conexão celular com um selo apertado Gigaohm. Sucções breves são aplicadas para alternar para a configuração de células inteiras. No final da gravação, o citoplasma é colhido, aplicando uma ligeira pressão negativa dentro da pipeta, mantendo o selo apertado. Observe o encolhimento do corpo celular durante o procedimento de colheita. A pipeta de gravação então é retirada delicadamente para formar um patch de fora-fora, o que favorece o fechamento da membrana celular para revelação posterior biocytin e preservação do material colhido em pipeta remendo. Reproduzido de cozida e Lambolez47 com permissão da Real Sociedade de química. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57627/57627fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57627/57627fig5.jpg"> Figura 5: caracterização das células piramidais neocortical de camada V. (A) membrana resposta potencial de uma célula piramidal camada V induzida por pulsos de corrente de -100, -40, -10, 60, 120 e +500 pA (vestígios de fundo). O neurônio exibe um desvio potencial fraco após a resposta inicial de relação (traços superiores). Em resposta a uma despolarização super-iluminado, o neurônio alta potenciais de ação de longa duração com desenvolvendo lentamente após-hiperpolarização (traço superior). Perto de saturação, o neurônio alta com pouca frequência e exibiu uma adaptação pronunciada (traço cinza superior). Inset: fotos infravermelho do neurônio piramidal gravado camada V. A superfície pial é para cima. Barra de escala: 20 µm. (B) análise de RT-PCR Multiplex revelando expressão de vGluT1, SOM, ATP1α1 e ATP1α3. (C) perfil de expressão de Gene em uma amostra de 26 camada V células piramidais. vGluT1 foi expressa em todos os neurônios enquanto GAD65, GAD67 e COX2 nunca foram detectados. NPY, SOM, KIR 6.2, SUR1 e SOMint foram raramente observados. Células piramidais expressaram ATP1α3, 1 subunit do at+/k+ ATPase e ATP1α2 em menor grau. (D) máxima projeção de intensidade de imagens confocal mostrando biocytin rotulagem do neurônio gravado em (A). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57627/57627fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Gene / número do GenBank</td>
			<td colspan="2">Fixadores externos</td>
			<td>Tamanho (bp)</td>
			<td colspan="2">Fixadores internos</td>
			<td>Tamanho (bp)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">vGlut1 NM_182993</td>
			<td colspan="2">Sentido,-113</td>
			<td rowspan="4">259</td>
			<td colspan="2">Sentido, -54</td>
			<td rowspan="4">153</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GGCTCCTTTTTCTGGGGCTAC</td>
			<td colspan="2">ATTCGCAGCCAACAGGGTCT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antisenso, 126</td>
			<td colspan="2">Antisenso, 79</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCAGCCGACTCCGTTCTAAG</td>
			<td colspan="2">TGGCAAGCAGGGTATGTGAC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">GAD65 NM_008078</td>
			<td colspan="2">Sentido, 99</td>
			<td rowspan="4">375</td>
			<td colspan="2">Sentido, 219</td>
			<td rowspan="4">248</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCAAAAGTTCACGGGCGG</td>
			<td colspan="2">CACCTGCGACCAAAAACCCT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antisenso, 454</td>
			<td colspan="2">Antisenso, 447</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TCCTCCAGATTTTGCGGTTG</td>
			<td colspan="2">GATTTTGCGGTTGGTCTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">GAD67 NM_008077</td>
			<td colspan="2">Sentido, 529</td>
			<td rowspan="4">598</td>
			<td colspan="2">Sentido, 801</td>
			<td rowspan="4">255</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TACGGGGTTCGCACAGGTC</td>
			<td colspan="2">CCCAGAAGTGAAGACAAAAGGC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antisenso, 1109</td>
			<td colspan="2">Antisenso, 1034</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCCAGGCAGCATCCACAT</td>
			<td colspan="2">AATGCTCCGTAAACAGTCGTGC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">COX 2 NM_011198</td>
			<td colspan="2">Sentido, 199</td>
			<td rowspan="4">268</td>
			<td colspan="2">Sentido, 265</td>
			<td rowspan="4">181</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CTGAAGCCCACCCCAAACAC</td>
			<td colspan="2">AACAACATCCCCTTCCTGCG</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antisenso, 445</td>
			<td colspan="2">Antisenso, 426</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCTTATTTCCCTTCACACCCAT</td>
			<td colspan="2">TGGGAGTTGGGCAGTCATCT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">NPY NM_023456</td>
			<td colspan="2">Sentido, 16</td>
			<td rowspan="4">294</td>
			<td colspan="2">Sentido, 38</td>
			<td rowspan="4">220</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CGAATGGGGCTGTGTGGA</td>
			<td colspan="2">CCCTCGCTCTATCTCTGCTCGT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antisenso, 286</td>
			<td colspan="2">Antisenso, 236</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">AAGTTTCATTTCCCATCACCACAT</td>
			<td colspan="2">GCGTTTTCTGTGCTTTCCTTCA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">SOM NM_009215</td>
			<td colspan="2">Sentido, 43</td>
			<td rowspan="4">208</td>
			<td colspan="2">Sentido, 75</td>
			<td rowspan="4">146</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ATCGTCCTGGCTTTGGGC</td>
			<td colspan="2">GCCCTCGGACCCCAGACT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antisenso, 231</td>
			<td colspan="2">Antisenso, 203</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GCCTCATCTCGTCCTGCTCA</td>
			<td colspan="2">GCAAATCCTCGGGCTCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">
ATP1Α1 NM_144900
</td>
			<td colspan="2">Sentido, 1287</td>
			<td rowspan="4">288</td>
			<td colspan="2">Sentido, 1329</td>
			<td rowspan="4">183</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CAGGGCAGTGTTTCAGGCTAA</td>
			<td colspan="2">TAAGCGGGCAGTAGCGGG</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antisenso, 1556</td>
			<td colspan="2">Antisenso, 1492</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCGTGGAGAAGGATGGAGC</td>
			<td colspan="2">AGGTGTTTGGGCTCAGATGC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">ATP1Α2 NM_178405</td>
			<td colspan="2">Sentido, 1392</td>
			<td rowspan="4">268</td>
			<td colspan="2">Sentido, 1430</td>
			<td rowspan="4">213</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">AGTGAGGAAGATGAGGGACAGG</td>
			<td colspan="2">AAATCCCCTTCAACTCCACCA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antisenso, 1640</td>
			<td colspan="2">Antisenso, 1623</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ACAGAAGCCCAGCACTCGTT</td>
			<td colspan="2">GTTCCCCAAGTCCTCCCAGC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">ATP1Α3 NM_144921</td>
			<td colspan="2">Sentido, 127</td>
			<td rowspan="4">216</td>
			<td colspan="2">Sentido, 158</td>
			<td rowspan="4">128</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CGGAAATACAATACTGACTGCGTG</td>
			<td colspan="2">TGACACACAGTAAAGCCCAGGA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antisenso, 324</td>
			<td colspan="2">Antisenso, 264</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GTCATCCTCCGTCCCTGCC</td>
			<td colspan="2">CCACAGCAGGATAGAGAAGCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">Kir 6.2 NM_010602</td>
			<td colspan="2">Sentido, 306</td>
			<td rowspan="4">431</td>
			<td colspan="2">Sentido, 339</td>
			<td rowspan="4">342</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CGGAGAGGGCACCAATGT</td>
			<td colspan="2">CATCCACTCCTTTTCATCTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antisenso, 719</td>
			<td colspan="2">Antisenso, 663</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CACCCACGCCATTCTCCA</td>
			<td colspan="2">TCGGGGCTGGTGGTCTTG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">SUR1 NM_011510</td>
			<td colspan="2">Sentido, 1867</td>
			<td rowspan="4">385</td>
			<td colspan="2">Sentido, 2041</td>
			<td rowspan="4">211</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CAGTGTGCCCCCCGAGAG</td>
			<td colspan="2">ATCATCGGAGGCTTCTTCACC</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antisenso, 2231</td>
			<td colspan="2">Antisenso, 2231</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG</td>
			<td colspan="2">GGTCTTCTCCCTCGCTGTCTG</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">SOMint X51468</td>
			<td colspan="2">Sentido, 8</td>
			<td rowspan="4">240</td>
			<td colspan="2">Sentido, 16</td>
			<td rowspan="4">182</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CTGTCCCCCTTACGAATCCC</td>
			<td colspan="2">CTTACGAATCCCCCAGCCTT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Antisenso, 228</td>
			<td colspan="2">Antisenso, 178</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CCAGCACCAGGGATAGAGCC</td>
			<td colspan="2">TTGAAAGCCAGGGAGGAACT</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1. Sequências de primers PCR de primeiro e segundo. A posição de cada primer PCR e suas sequências são dadas de 5' para 3'. Exceto o intrão somatostatina, posição 1 corresponde a primeira base do códon de início de cada gene.

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Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

Única célula transcrição reversa Multiplex cadeia da polimerase após Patch-clamp

Este protocolo descreve os passos críticos e as precauções necessárias para executar a única célula multiplex transcrição reversa reação em cadeia da polimerase após remendo-braçadeira. Esta técnica é um método simples e eficaz para analisar o perfil de expressão de um conjunto predeterminado de genes de uma única célula caracterizada por gravações de remendo-braçadeira.

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

single-cell-multiplex-reverse-transcription-polymerase-chain-reaction

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.7K visualizações.  Sorbonne Université. Este protocolo descreve os passos críticos e as precauções necessárias para executar a única célula multiplex transcrição reversa reação em cadeia da polimerase após remendo-braçadeira. Esta técnica é um método simples e eficaz para analisar o perfil de expressão de um conjunto predeterminado de genes de uma única célula caracterizada por gravações de remendo-braçadeira.

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Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, difficult to separate and also not easily identified by their morphology. Thus, it is often difficult to analyze gene expression in a specific neuron type. Here we document a procedure that combines whole-cell patch clamp recording techniques with single-cell reverse transcription polymerase chain reaction (scRT-PCR) to profile mRNA expression in different types of neurons in the substantial nigra. Electrophysiological techniques are first used to record the neurophysiological and functional properties of individual neurons. Then, the cytoplasm of single electrophysiologically characterized nigral neurons is aspirated and subjected to scRT-PCR analysis to obtain mRNA expression profiles for neurotransmitter synthesis enzymes, receptors, and ion channels. The high selectivity and sensitivity make this method particularly useful when immunohistochemistry can not be used due to a lack of suitable antibody or low expression level of the protein. This method is also applicable to neurons in other brain areas.

Neurons are first characterized electrophysiologically. Then the cytoplasm from the recorded neuron is aspirated and subjected to reverse transcription-PCR analysis to detect the expression of mRNAs for neurotransmitter synthesis enzymes, ion channels, and receptors.

Perfil de tensão-gated Expressão mRNA canais de potássio em neurônios da substância negra usando uma única célula RT-PCR Técnicas

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Neurociência

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most well-established method for recording electrical activity from individual neurons or their subcellular compartments. Nevertheless, achieving stable recordings, even from individual cells, remains a time-consuming procedure of considerable complexity. Automation of many steps in conjunction with efficient information display can greatly assist experimentalists in performing a larger number of recordings with greater reliability and in less time. In order to achieve large-scale recordings we concluded the most efficient approach is not to fully automatize the process but to simplify the experimental steps and reduce the chances of human error while efficiently incorporating the experimenter's experience and visual feedback. With these goals in mind we developed a computer-assisted system which centralizes all the controls necessary for a multi-electrode patch-clamp experiment in a single interface, a commercially available wireless gamepad, while displaying experiment related information and guidance cues on the computer screen. Here we describe the different components of the system which allowed us to reduce the time required for achieving the recording configuration and substantially increase the chances of successfully recording large numbers of neurons simultaneously.

Multi-electrode patch-clamp recordings constitute a complex task. Here we show how, by automating of many of the experimental steps, it is possible to accelerate the process leading to qualitative improvement in performance and number of recordings.

A Multi-eletrodo Sistema patch-clamp assistida por computador

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagênese e Análise Funcional de canais iônicos Heterologously Expresso em células de mamíferos

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Biologia

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Full-cell Patch-clamp Gravações para determinação eletrofisiológica de Ion Selectivity em Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

Profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

Um canal de gravação de patch-clamp anexado-Cell

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety assessment models is a critical step during drug development. Currently, cardiac safety assessment is still highly dependent on animal studies. However, animal models are plagued by poor translational specificity to humans due to species-specific differences, particularly in terms of cardiac electrophysiological characteristics. Thus, there is an urgent need to develop a reliable, efficient, and human-based model for preclinical cardiac safety assessment. Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have emerged as an invaluable in vitro model for drug-induced cardiotoxicity screening and disease modeling. hiPSC-CMs can be obtained from individuals with diverse genetic backgrounds and various diseased conditions, making them an ideal surrogate to assess drug-induced cardiotoxicity individually. Therefore, methodologies to comprehensively investigate the functional characteristics of hiPSC-CMs need to be established. In this protocol, we detail various functional assays that can be assessed on hiPSC-CMs, including the measurement of contractility, field potential, action potential, and calcium handling. Overall, the incorporation of hiPSC-CMs into preclinical cardiac safety assessment has the potential to revolutionize drug development.

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have emerged as a promising in vitro model for drug-induced cardiotoxicity screening and disease modeling. Here, we detail a protocol for measuring the contractility and electrophysiology of hiPSC-CMs.

Aplicações Técnicas de Gravação de Matriz de Microeletrodos e Braçadeiras de Adesivos em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

Medicina

Establishing a Whole-Cell Configuration through the Patch Clamp Method

Source: Segev, A. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54024">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video demonstrates the whole-cell patch clamp technique in a mouse brain slice. This technique establishes a stable connection between micropipette and neuron membrane, which is further disrupted to establish a whole-cell configuration to study the neuron&#39;s health and physiological responses.

Estabelecendo uma configuração de célula inteira por meio do método Patch Clamp

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
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