Name: development and characterization of in vitro microvessel network and quantitative measurements of endothelial [ca2+]i and nitric oxide production
Uploaded: 2016-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo National Heart, Lung, and Blood Institute concede HL56237, Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais Instituto DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1227359 e EPS-1003907).

1. fabricação de dispositivos microfluídicos <ol><li> Fabrication fotolitografia padrão de um SU-8 molde 50 Mestre <ol><li> Limpe o wafer de silício antes de spin-coating. Lavar uma bolacha de silício de 2 polegadas nua com acetona durante 15 minutos, seguido de álcool isopropílico (IPA) durante 15 min. Desidratar a bolacha, colocando-o numa placa de aquecimento a 150 ° C durante 1 h. Após a desidratação, arrefecer a bolacha à temperatura ambiente. </li><li> Spin-coat a bolacha de silício com SU-8 fotorresiste. Adicionar 2 ml de SU-8 foto-resistente sobre a bolacha. Rampa, o wafer de 500 rpm a 100 rpm aceleração / s por 10 seg, seguido de 1000 rpm a 300 rpm aceleração / s durante 30 seg. (Veja Suplementar Video 1) </li><li> Pré-coze a bolacha sobre uma placa quente a 65 ° C durante 10 min, em seguida, coze suave a 95 ° C durante 30 min. </li><li> Use a exposição UV para transformar o padrão concebido a partir de uma máscara de filme para a foto-resistente revestida-spin. Imprimir o padrão em uma fina película transparente como uma máscara de filme. Coloque a máscara de filme no topo dagirar-revestido fotorresistente e expor a UV com uma dose de 300 mJ / cm 2. (Veja Suplementar Video 2) Nota: Neste protocolo, o padrão de rede de microcanais (159 mm de largura canais mãe ramificação em quatro canais de 100 mm de largura filha) é projetado com software CAD. O padrão sobre a película mostra como um campo claro e o resto da película é coberto por tinta preta. Porque SU-8 é uma foto-resistente negativa, a porção do material fotosensitivo que é exposta à radiação UV vai ser reticulado e tornam-se insolúveis à solvente durante o desenvolvimento do molde (passo 1.1.6). Após o desenvolvimento, esta porção insolúvel vai replicar o padrão de rede concebido e servir como um molde mestre. </li><li> Pós-coza a bolacha exposta numa placa quente a 65 ° C durante 1 min, em seguida 95 ° C durante 10 min. </li><li> Desenvolver o molde mestre. Use SU-8 desenvolvedor como solvente para remover o fotorresiste reticulado-un. Mergulhe o wafer em SU-8 developer por 3 min e enxaguar com IPAdurante 1 min. </li><li> Repetir este ciclo de desenvolvimento de 2-3 vezes até que não haja formação de camadas de branco (resíduo de material fotosensitivo não-curado), após a lavagem com IPA. Seque suavemente a bolacha com azoto gasoso e examinar as características pequenas do padrão sob um microscópio. Repita os ciclos de desenvolvimento adicionais, se necessário. </li><li> Disco cozer a bolacha sobre uma placa quente a 150 ° C durante 15 min. </li></ol></li><li> litografia macia <ol><li> misture manualmente as duas partes (base e agente de cura) de polidimetilsiloxano (PDMS) elastômero em um peso. proporção de 10: 1. </li><li> De gás-se a mistura de PDMS com um exsicador ligado a uma câmara de vácuo durante 15 min. Lançai a solução PDMS no molde mestre fotorresiste. A espessura do PDMS tem de ser superior a 3 mm, para proporcionar uma retenção estável da tubagem de entrada / saída. De gás-PDMS novamente durante 15 min, e remover as bolhas de ar remanescentes, com gás de azoto, se necessário. Curar o PDMS fundidas num forno a 65 ° C durante 3 h. </li><li> Limpe a superfície doa lamela de vidro com uma fita adesiva e um aspirador de plasma (30 seg tratamento de plasma). Spin-coat PDMS curado-un (0,5 ml) sobre a lamela de vidro por aumentando a 4.000 rpm a taxa de aceleração / seg 500 rpm durante 30 segundos. Curar a lamela revestida por rotação PDMS em uma estufa a 65 ° C durante pelo menos 30 min. </li><li> Corte e liberar os PDMS curado do molde mestre. Em seguida, crie uma entrada e uma saída com um furador de diâmetro de 1 mm na extremidade distal dos canais mãe. </li><li> Unir o dispositivo à lamela de vidro PDMS spin-revestido. Oxidar as superfícies dos PDMS e lamela com um produto de limpeza de plasma por 1 min. Após o tratamento por plasma de oxigénio, colocar uma gota de água desionizada (água Dl), a superfície de ligação, e colocar as duas partes em conjunto. Asse o dispositivo num forno a 65 ° C durante 30 min para conseguir uma ligação permanente. </li></ol></li></ol><img alt="Suplementar Video 1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">Suplementar Video 1 (clique com o botão direito para baixar).</a> <img alt="Suplementar Video 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">Suplementar Video 2 (clique com o botão direito para baixar).</a> 2. endotelial semeadura de células e Cultura <ol><li> Esterilização de dispositivos e Fibronectina Coating <ol><li> Preservar a propriedade hidrófoba da superfície do PDMS em torno da entrada / saída da oxidação. Cubra a superfície PDMS em torno da entrada e saída com pequenas tiras de fita adesiva para evitar a oxidação. Este processo pode impedir que a água DI se espalhe por toda a superfície superior do dispositivo durante o passo de enchimento (2.1.3). </li><li> Tratar o dispositivo de PDMS com plasma de oxigénio foR 5 minutos para alterar a superfície a ser hidrófila, assim facilitar o fluxo do fluido através do microcanal e evitar a bolha de aprisionamento no procedimento de enchimento (2.1.3). </li><li> Utilize uma seringa com uma agulha acoplada ou uma pipeta para encher o dispositivo com água Dl a partir da entrada. Continue o enchimento até que haja uma gotícula de água Dl (30-50 ul) acumulado na saída. Examine o dispositivo sob um microscópio para verificar se existem bolhas de ar no interior do microcanal. Remova a gota de água excessiva na entrada e na saída com um lenço de papel. </li><li> Esteriliza-se o dispositivo numa cápsula de Petri com UV durante um mínimo de 3 horas em uma capa biosegurança laminar. Para evitar a evaporação, cobrir a entrada / saída com uma parte fina de PDMS, coloque um lenço de papel molhado dentro do prato, e enrole o prato com Parafilm. </li><li> Cubra o dispositivo com fibronectina. Lavar o dispositivo pela primeira vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS), em seguida, revesti-la com 100 ug / ml de f ibronectina durante a noite num frigorífico (4 ° C). Coloque uma gotícula de solução na entrada, e, em seguida, criar uma pressão negativa na saída com uma câmara de vácuo, uma seringa com uma agulha ou uma pipeta. </li><li> Encher o dispositivo com meios de cultura de células. Lavar o dispositivo com PBS manualmente por 3 vezes antes de carregar o meio de cultura celular. Aquece-se o dispositivo numa incubadora a 37 ° C. </li></ol></li><li> ECs Sementeira e perfusão de longo prazo Nota: comparação com a cultura 2D CE estática convencional, o modelo de rede de microvasos in vitro com perfusão contínua fez o ambiente de cultura de células mais próximas das condições in vivo. A in vitro rede microvascular demonstrado neste protocolo pode ser mantida até duas semanas. A perfusão bem controlada continuamente repor os nutrientes, remova os resíduos e evitar o excesso de confluência da monocamada CE. Portanto, ele pode ser estendido para um estudo de longo prazo, imitando o ambiente celular e hemodinâmico sob Physiologica diferenteL e condições patológicas. <ol><li> Misture HUVECs primárias em meio de cultura de HUVEC (MCDB 131) com 8% dextrano (peso mol 70.000). O dextrano é usado para aumentar a viscosidade dos meios de carregamento e de conseguir um melhor resultado sementeira de células. A densidade celular recomendada é cerca de 2-4 x 10 6 culas / ml. </li><li> Semear as células dentro do dispositivo. Coloque uma gota de 10-20 ul de células sobre a entrada. Introduzir um fluxo suave, quer por inclinação do dispositivo, ou acção capilar utilizando uma pipeta de Pasteur de vidro na saída. A chave para uma carga bem sucedida de células é de controlar a velocidade de fluxo inferior a 1 mm / seg dentro dos canais mais pequenos. </li><li> Verifique a semeadura de células. Após a sementeira inicial, o dispositivo de incubar durante 15-20 min (atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C) antes de verificar o estado de semeadura sob o microscópio. Se for necessário, realizar o carregamento da célula adicional para conseguir uma densidade de células desejada. </li><li> Lave o dispositivo com meio de cultura celular (37° C) para remover o dextrano. Cultura o dispositivo na ausência de fluxo para o primeiro 6 h numa incubadora (5% de CO2 a 37 ° C). </li><li> Configurar a conexão do tubo de perfusão de longo prazo. Tape o aparelho numa placa de Petri para evitar o movimento. Criar pequenos orifícios na tampa da caixa de Petri para entrada de ar e tubo de saída inserções. Ligue o tubo de entrada para uma seringa com uma agulha de perfusão para o meio de cultura celular. Conecte o tubo de saída para um serviço de recolha. Nota: Colocar o dispositivo e o colector de resíduos em uma incubadora de cultura de células, enquanto que a colocação de uma bomba de perfusão fora da incubadora e ligá-la com o dispositivo pela tubagem de admissão de comprimento. A taxa de perfusão é determinada pelo projecto experimental. No presente dispositivo, utilizar uma taxa de perfusão de 0,35 uL / min, e uma variação de tensão de cisalhamento entre 1-2 dine / cm 2. Sob esta condição perfusão, as HUVECs atingir confluência em cerca de 3-4 dias. </li></ol></li></ol> 3. Immunofluorescent coloração <ol><li> Corrigir o ECs no dispositivo de perfusão de 2% de paraformaldeído durante 30 min a 4 ° C, seguido de enxaguamento 1x PBS à temperatura ambiente durante 15 min, e 1% de BSA de bloqueio durante 30 minutos. Usar uma taxa de perfusão que é o mesmo que o utilizado para a cultura de células. </li><li> Permeabilizar as ECs fixo para a coloração de anticorpo com 0,1% de Triton X-100. Perfundir o dispositivo com Triton para 5-7 min a etiqueta VE-caderina, e 3 min a etiqueta de F-actina. </li><li> Carregar os anticorpos para o dispositivo. Perfundir o dispositivo com 1x PBS durante 15 minutos para lavar as soluções anteriores. carregar manualmente o anticorpo primário contra VE-caderina (anti-cabra) para dentro do dispositivo, na concentração de 2 ug / ml (o volume total é de 20-50 uL). Manter o dispositivo no frigorífico a 4 ° C durante a noite. Perfundir o anticorpo secundário (de burro anti-cabra) por uma bomba de seringa a uma concentração de 7 ng / ml para 45-60 min. </li><li> Rotular CE F-actina com faloidina. Perfundir o dispositivo com fo 1x PBSR 15 min antes de carregar manualmente faloidina (10 ug / ml) durante 7-10 min. </li><li> Etiqueta núcleos da CE (ver Lista de Materiais). </li><li> Lavar o dispositivo com 1x PBS, e mantê-lo a 4 ° C até à imagiologia. </li></ol> 4. Fluorescência imagem das endotelial [Ca 2+] i <ol><li> Perfundir o dispositivo com albumina (10 mg / ml) solução de -Ringer durante 15 min a 37 ° C. Utilizar a mesma taxa de perfusão que o utilizado para a cultura de células. As concentrações de todos os componentes da solução de albumina-Ringer são descritos na Lista de Materiais. </li><li> Configure o sistema confocal para CE [Ca 2+] i imagem com fluo-04:00. Use um sistema microscópico confocal de imagem Ca 2+. Use um laser de argônio (488 nm) para a excitação e definir a banda de emissão de 510-530 nm. Recolher as imagens com um objetivo 25X (imersão em água, NA: 0,95) em 512 x 512 formato de digitalização. Use um z-passo de 2 mm e um intervalo de digitalização para cada pilha de imagos de 20 seg. </li><li> Perfundir o dispositivo com fluo-4 AM (5 mM) durante 40 min a 37 ° C, em seguida lavar o lúmen de fluo-4 AM com solução de albumina-Ringer. </li><li> Adquirir imagens de microvasos fluo-4 carregado. Recolher as imagens de linha de base durante 10 min. Perfundir o dispositivo com ATP (10 uM) e gravar as mudanças de intensidade de fluorescência (FI) durante 20 min. </li></ol> 5. Fluorescência de imagem de óxido nítrico Produção <ol><li> Perfundir o dispositivo com uma solução de albumina-Ringer durante 15 min. Usar uma taxa de perfusão que é o mesmo que o utilizado para a cultura de células. </li><li> Configure o sistema de imagens de fluorescência para medir a produção de óxido nítrico induzida por ATP. Usar um microscópio equipado com uma câmara CCD digital de 12-bit e um obturador controlado por computador para a medição do óxido nítrico. Use uma lâmpada de xenônio 75 W como fonte de luz. Nota: Selecione a excitação e emissão de comprimentos de onda para DAF-2 DA por um filtro de interferência (nm 480/40) e um espelho dicróico(505 nm) com uma barreira de passa-banda (535/50 nm). Use uma lente objetiva de 20X (NA: 0,75) para recolher as imagens. Para minimizar o fotobranqueamento, posicionar um filtro de densidade neutra (0,5 N) em frente do filtro de interferência e limitar o tempo de exposição a 0,12 seg. </li><li> Carregar as células com DAF-2 DA (5 M). Perfundir o dispositivo com DAF-2 DA para cerca de 35-40 min a 37 ° C. Grave a linha de base de DAF-2 intensidade de fluorescência (FI DAF) após a carga inicial. Nota: DAF-2 DA é continuamente presente no perfusato durante toda a experiência 7. </li><li> Recolha DAF-2 imagens. Grave a linha de base FI DAF por 5 min. Perfundir o dispositivo com ATP (10 uM) e recolher as imagens durante 30 min com intervalos de 1 min. Recolha todas as imagens a partir do mesmo grupo de células no mesmo plano focal. </li></ol> Análise 6. Os dados <ol><li> selecionar manualmente a região de interesse (ROI) das imagens recolhidas a nível da célula individual. CadaROI cobre a área de uma célula individual, que pode ser indicado pelo contorno de fluorescência. </li><li> Subtrair fluorescência de fundo e calcular o FI média de cada ROIs. </li><li> Medir as mudanças induzidas por ATP em CE [Ca 2+] i e produção de NO. Quantificar as alterações induzidas por ATP na CE [Ca 2+] i calculando as mudanças em Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, onde 0 é o FI FI da linha de base média durante a perfusão de albumina-Ringer antes de adicionar ATP) menos a medida fundo. Quantificar NO taxa de produção, realizando a primeira conversão diferencial do FI DAF ao longo do tempo. Nota: O curso de tempo de FI DAF representa uma produção de NO acumulado com o tempo. Portanto, nenhuma taxa de produção é calculado com base no perfil de FI DAF sob basal e estimulada ATP condições. Detalhes de análise de dados e procedimentos experimentais foram descritos na publicação anterior 7. </li></ol>

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Os autores não têm interesses conflitantes ou interesses conflitantes para divulgar.

<html> Neste artigo, apresentamos protocolos detalhados para o desenvolvimento da rede microvascular culta, a caracterização das junções CE e citoesqueleto distribuição de F-actina, e as medições quantitativas da CE [Ca 2+] i e produção de NO utilizando um dispositivo microfluídico. O dispositivo microfluídico perfusão fornece um modelo in vitro que permite uma simulação perto dos in vivo geometrias microvasculares e condições de fluxo de cisalhamento. Uma vez que a rede de microvasos em cultura pode ser formada por ECs humana primária, esta abordagem pode servir como uma ferramenta útil para investigar como patologicamente componentes sangue alterado a partir de amostras de doentes afectar ECs humanos por perfusão directa de amostras de sangue dos pacientes para os microvasos cultivadas e fornecer informações sobre clínica problemas. Os CEs microvasos humanos desenvolvidos também podem ser utilizados para o rastreio de drogas para evitar os potenciais discrepâncias nas respostas de drogas entre os tecidos humanos e animais. ve_content &quot;&gt; O substrato dos dispositivos de microfluidos mostrados neste protocolo é uma lamela de vidro (150-180 mm) spin-revestido com uma fina camada de PDMS. Esta fina camada de PDMS é essencial para alta resolução e tecido vivo em tempo real imagem, porque os objectivos de abertura numérica maiores geralmente tem distância de trabalho curta. o fluxo laminar dentro do microcanal (intervalo submillimeter) tem um número muito baixo Reynolds, eo diferencial de pressão é linearmente relacionada com o fluxo, assim, a distribuição de tensões de cisalhamento depende apenas sobre a geometria do canal. por conseguinte, ele pode ser bem controlado por-alta precisão bomba de perfusão 20. no nosso estudo, a tensão de cisalhamento aplicada à rede de microvasos em cultura de HUVEC era entre 1 a 10 dines / cm2, que está dentro do gama de tensão de cisalhamento medida no sistema venoso 21,22. os sistemas de macro-fluídicos tais como câmara de fluxo paralelo carece de padrões complexos de fluxo. em câmaras de fluxo em maior escala (variação mm cm), ECS são normalmente apenas cresceu na superfície de fundo (monocamada 2D), sem as semelhanças geométricas de microvasos in vivo. Quando a largura da câmara de fluxo é superior a 2 mm, o fluxo homogéneo é confinado numa região que é geralmente de alguns milímetros afastado da saída / entrada, e algumas centenas de mícrons de distância da parede lateral 23. Quando a largura da câmara é aumentada para a gama de centímetros, o fluxo irá diferenciar em várias linhas de fluxo e as velocidades de fluxo irá mudar ao longo de toda a área 24. Além disso, a câmara de fluxo da escala maior consome pelo menos 100 vezes mais perfusato para atingir a mesma tensão de corte a que está em microcanais. A distribuição de tensões de corte no interior da rede de microcanais pode ser simulada usando uma ferramenta de simulação numérica, e as incompressíveis equações de Navier-Stokes estacionário pode ser resolvido pela maioria dos programas de elementos finitos. O dispositivo microfluidico pode ser feita com um singlprocesso de máscara de microfabricação e. O sucesso do desenvolvimento de microvasos culta, no entanto, requer atenção especial aos detalhes. Depois de carregar a solução para os microcanais, cada dispositivo precisa ser verificado para bolha trapping sob o microscópio antes da semeadura CE. Se ocorre uma bolha, é ainda possível a forçá-lo para fora, nesta fase, por aplicação de uma pressão hidráulica na entrada com uma saída fechada, como PDMS é um material permeável ao ar. Para manter uma taxa de perfusão desejado, ajuste apertado sem um vazamento é necessário para todas as conexões de agulha / tubulação. O furo-perfurador combinados e dimensão da mangueira são fundamentais para alcançar um encaixe apertado. Para assegurar uma entrega precisa da taxa de fluxo, a seringa sobre a bomba de infusão, e o dispositivo deve ser colocado ao mesmo nível. Para alterar o perfusato, o tubo deve ser inserido suavemente desligado do dispositivo, para evitar qualquer alongamento. Para aumentar a tensão de cisalhamento, aumentos (como 10 passos de aumento em 18 horas) são recoded para evitar alterações de fluxo súbita causada descamação CE. Estudos anteriores realizados em microvasos perfundidos intactas individualmente indicado que os aumentos induzidos por agonistas em CE [Ca2 +] i, e a subsequente óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) activação e a produção de NO são necessários para a sinalização permeabilidade microvascular aumentada em condições inflamatórias 6,7 , 9-13,25. Neste protocolo, seleccionamos ATP como o agonista representativo, uma vez que é geralmente liberada pelas células vermelhas do sangue, plaquetas agregadas e tecidos lesionados ou sob condições inflamatórias in vivo. Um indicador de cálcio fluorescente, Fluo-4 AM, foi usada para medir as alterações em [Ca2 + endotelial] i após a exposição ao ATP. A CE [Ca 2+] i em resposta microvasos cultivadas são semelhantes aos encontrados em microvasos intactas 7,9. Medir a produção CE NO tem sido um desafio técnico para os biólogos.Até à data, não houve nenhuma indicador fluorescente que permite a detecção de alterações dinâmicas na concentração de NO de uma maneira semelhante para os indicadores de cálcio. DAF-2 DA tem sido amplamente utilizada para avaliar a produção de NO. No entanto, o uso adequado, a interpretação de dados e análise de dados precisa para chamar a atenção dos usuários. Desde a transformação química do DAF-2 para DAF-2T na presença de NO é irreversível (conversão só ida) 26, a DAF perfil de intensidade de fluorescência detectado não representa as mudanças na concentração de NO. Em vez disso, ele indica a produção DAF-2T acumulada com o tempo. Com base nesta acumulado DAF-2 fluorescência curva (FI DAF), o (df / dt) taxa de produção de NO pode ser obtido por conversão do primeiro diferencial da FI DAF 7,11. Designadamente, a inclinação da curva de FI indica a taxa de produção de NO e a fase planalto indica aumento não mais a produção de NO. Depois da conversão, os dados gerados a partir deste protocolo PResented tanto o basal NO taxa de produção e as mudanças na produção de NO em resposta a ATP com resolução temporal e espacial nos níveis CE individuais dentro da rede microvascular. Actualmente o PDMS tem sido amplamente utilizado para aplicações de microfluidos, uma vez que é um elastómero macio permeável opticamente transparente, não tóxico, e de gás 27-30. No entanto, desde PDMS não é permeável à água, não foi possível medir diretamente a permeabilidade da monocamada CE. Para superar esta limitação, algumas aplicações modificou as estruturas de parede de canal, tais como integração de uma membrana permeável para dentro do canal 31, ou criando um &quot;permeáveis ​​aberturas de janelas&quot; com micro-pilares ou micro-orifícios 32,33, enquanto outros têm sido focados na modificação de materiais para dispositivos como o uso de dispositivos de hidrogel ou hidrogel / PDMS dispositivos híbridos 17,34-36. As desvantagens de tais dispositivos são sua natureza vulneráveis ​​à desidratação e à sua relativamente fraca mPropriedades echanical ficar estresse ou pressão. desenvolvimento futuro de material permeável com resistência mecânica vai melhorar ainda mais o dispositivo e seu potencial para aplicações biológicas mais amplas.

As células endoteliais (ECS) que revestem as paredes dos vasos sanguíneos in vivo estão constantemente expostos a fluir, mas ECs cultivadas são cultivadas em condições estáticas e exibem um fenótipo pró-inflamatório 1,2. A tecnologia de microfluidos permite que um fluido controlado com precisão através de uma microescala geometricamente limitado (sub-milímetros) canais 3, o que proporciona a oportunidade para células de cultura, especialmente para células endoteliais vasculares, a crescer sob condições de fluxo desejadas. Estas características tornam as condições de cultura de célula mais perto in vivo do que as culturas de células, 2D estáticos convencionais. Eles são extremamente importantes quando os dispositivos microfluidicos são utilizados para modelar diferentes tipos de vasculaturas e para estudar as respostas a estímulos mecânicos CE e / ou químicos. Apesar das vantagens demonstradas pela rede de microcanais através de uma cultura de células estática, a adaptação e a aplicação de microfluidos na f biomédicaield permanecem limitados. Relatado por uma revisão recente, a maioria das publicações neste domínio (85%) ainda estão em revistas de engenharia 4. O desempenho de dispositivos de microfluidos não tem sido suficientemente convincente para a maioria dos biólogos para alternar a partir de técnicas correntes, tais como o ensaio Transwell e a corrediça cultura prato / vidro macro-escala para este dispositivo miniaturizado. A microfluídica é um campo multidisciplinar, que requer colaborações interdisciplinares para mover esse campo para a frente. O objetivo deste artigo técnico é reduzir as lacunas de conhecimento entre as disciplinas e fazer os procedimentos de fabricação compreensível por biólogos, ao fornecer aplicação biológica e validação funcional dos microvasos microfluídicos. Os protocolos experimentais visualizadas incluem fabricação de ambos os dispositivos microfluídicos e suas utilidades biológicos, o que representa uma estreita colaboração entre engenheiros e biólogos. Nós recentemente relataram algumaplicações biológicas usando a rede microvascular in vitro com o dispositivo microfluídico 5. A fim de conceber apropriadamente as dimensões da rede de microcanais e aplicar a tensão de corte desejado, um modelo numérico foi construído com o software de dinâmica de fluido computacional para estimar de perto o perfil do fluxo. Da veia umbilical células endoteliais humanas primárias (HUVECs) foram semeadas em que os microcanais atingiram a confluência, isto é, cobriam a totalidade das superfícies internas do microcanal, em 3-4 dias, com perfusão contínua. A formação da barreira adequada foi demonstrada por coloração com VE-caderina e em comparação com os que são formados sob condições de cultura de células estáticas e em microvasos intactas. Ao aplicar os protocolos experimentais desenvolvidos em microvasos perfundidos intactas individualmente 6-8, que medida quantitativamente as mudanças na CE [Ca2 +] i e óxido nítrico (NO) em resposta a adenosina-trifosfato (ATP) com fluorescente emcadores e confocal e microscopia de fluorescência convencional. Os aumentos induzidos por agonistas em CE [Ca 2+] i ea produção têm sido relatados como sinais intracelulares necessárias para os aumentos inflamatórias induzida pelo mediador na microvasos permeabilidade 6-15. Apesar de alguns estudos anteriores mostrou imagens de dispositivos microfluídicos DAF-2 DA carregados 16,17, análise adequada resolução e dados ainda não tinha alcançado 18. Para nosso conhecimento, este estudo demonstra os primeiros resultados quantitativos de mudança dinâmica induzida por agonista em endotelial [Ca 2+] i e produção de NO utilizando microfluídico sistema baseado. Técnicas de microfabricação tem a flexibilidade para fabricar microcanais para baixo a alguns microns e permitir o desenvolvimento de padrões complexos para imitar as geometrias de microcirculação in vivo. Aqui nós apresentamos uma rede de microcanais típico com três níveis de ramificação. esterede é fabricada pela combinação de fotolitografia, que é realizado em uma sala limpa microfabricação e litografia macia.

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy punch</td><td>Miltex</td><td>33-31 AA</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Albumin</td><td>MP Biomedicals</td><td>810014</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Brain Extract (BBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>Cover-slip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542C</td><td></td></tr><tr><td>DAF-2 DA</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (nuclei staining)&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4084</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-078</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548B</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pippette</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffered Saline Solution</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol (IPA)</td><td>VWR</td><td>89125</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Mammalian Ringer Solution Ingredient</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (132 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl (4.6 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (2.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (1.2 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Glucose (5.5 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (5.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Salt (9.1 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6007H</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Acid (10.9 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6003H</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Culture Medium</td><td>Life technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin (F-actin staining)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Exel Int</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>3M</td><td>34-8711-3070-3</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2050 Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>tissue culture flasks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Chemical Book</td><td>T6878</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Neutralizer solution</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution (TE)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>PTFE microbore tubing, 0.012&quot; ID x 0.030&quot; OD</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-6458</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Equipment&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Biosafety Laminar hood</td><td>NuAire</td><td>NU-425 Class II, Type A2</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art</td><td>F42022</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Wenesco</td><td>HP-1212</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp oven</td><td>Barnstead</td><td>3608-5</td><td></td></tr><tr><td>Lithography bench</td><td>Karl Suss</td><td>MA6 Contact Lithography</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Nikon</td><td>L200 ND &amp;amp; Diaphod 300</td><td></td></tr><tr><td>Shutter for the CCD camera</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>PVA TePla/Harrick plasma</td><td>M4L/PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Brewer Science</td><td>Cee 200X</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump system</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Software&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2015</td><td></td></tr><tr><td>CFD simulation software</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multiphysics 4.0.0.982</td><td></td></tr><tr><td>Images acquire and analyse for NO production&amp;nbsp;</td><td>Universal Imaging</td><td>Metafluor</td><td></td></tr></tbody></table>

development and characterization of in vitro microvessel network and quantitative measurements of endothelial [ca2+]i and nitric oxide production

As células endoteliais (ECS) que revestem as paredes dos vasos sanguíneos in vivo estão constantemente expostos a fluir, mas ECs cultivadas são cultivadas em condições estáticas e exibem um fenótipo pró-inflamatória. Embora o desenvolvimento de dispositivos microfluídicos foi abraçado pelos engenheiros mais de duas décadas, as suas aplicações biológicas permanecem limitados. Um modelo in vitro de microvasos mais fisiologicamente relevante validada por aplicações biológicas é importante para avançar no campo e colmatar as lacunas entre in vivo e in vitro. Aqui, apresentamos os procedimentos detalhados para o desenvolvimento da rede microvascular cultivadas utilizando um dispositivo microfluídico com uma capacidade de perfusão de longo prazo. Nós também demonstrar as suas aplicações para medições quantitativas de mudanças induzidas pelo agonista na CE i e óxido nítrico (NO) [2 + Ca] em tempo real usando confocal e microscopia de fluorescência convencional. A rede microvascular formadotrabalho com perfusão contínua mostrou cruzamentos bem desenvolvidos entre ECs. distribuição VE-caderina estava mais perto do que a observada em microvasos intactas do que monocamadas CE estaticamente cultivadas. ATP induzida por aumentos transitórios na CE [Ca 2+] i e produção de NO foram quantitativamente medido a níveis de células individuais, que validaram a funcionalidade dos microvasos cultivadas. Este dispositivo de microfluidos permite ECs a crescer sob um fluxo fisiologicamente relevante bem controlado, o que faz com que o ambiente de cultura celular mais perto in vivo do que os que, em culturas 2D estáticos convencionais. O projeto de rede de microcanais é altamente versátil, e o processo de fabricação é simples e repetível. O dispositivo pode ser facilmente integrado ao sistema microscópico confocal ou convencional que permite imagens de alta resolução. Mais importante ainda, porque a rede de microvasos em cultura pode ser formada por CEPs primárias humanas, esta abordagem irá servir como uma ferramenta útil para investigar comopatologicamente componentes do sangue alterados a partir de amostras de pacientes afetam ECs humanos e fornecer informações sobre questões clínicas. Ele também pode ser desenvolvido como uma plataforma para o rastreio de drogas.

Esta seção mostra alguns dos resultados obtidos com a rede microvascular cultura desenvolvida com este protocolo. O padrão de microcanais é uma rede ramificada de três níveis (Figura 1A). Neste design, a 159 m de largura ramos canal mãe em duas 126 mm canais de largura, e ramos de novo em quatro 100 mm canais filha de largura. Uma simulação numérica 3D foi realizada para estimar as distribuições de tensões de cisalhamento sob a taxa de fluxo de 0,35 mL / min (Figura 1B), o que indica três níveis diferentes de tensão de corte dentro desta rede de microcanais. O fluxo laminar dentro dos microcanais é predito para ser hidrodinamicamente estável sem a presença de fluxo perturbado ou secundária. Depois de um molde mestre SU-8 foi fabricado com um processo de fotolitografia padrão (Figura 1C), um dispositivo de PDMS foi fabricada por meio de litografia suave para replicar o ne de microcanaisprojeto Twork em um, ar andaime permeável transparente (Figura 1D - E). Após sementeira CE (Figura 1F - G) e 3-4 dias de perfusão contínua, ECs atingiram a confluência e coberto com êxito as superfícies internas dos microcanais. CE F-actina e os núcleos foram marcado por fluorescência dentro da rede e ilustrado com imagens confocais. Sob a tensão de corte de 1,0 dine / cm2, cerca de 30% do HUVECs alongada ao longo da direcção do fluxo com o aumento das fibras de stress centrais, enquanto o restante 70% mantiveram a sua padrão de calçada com dominada periférica F-actina 5. A alteração da forma da célula induzida por cisalhamento parece menos proeminente do que a normalmente observada em culturas de células estática 2D. Na verdade, sob condições in vivo, o ECS possuem formas diferentes de células em diferentes tipos de navios, mas não alterar facilmente a forma da célula em resposta ao fluxo de chaNGES. São necessários mais estudos para determinar se esta diferença foi os resultados da geometria do canal e ambiente de perfusão que estão mais perto de condições in vivo. Também medido com sucesso as mudanças induzidas pelo ATP na CE [Ca 2+] i e nenhuma produção (Figuras 4 e 5). ATP induzidos aumentos transitórios da CE [Ca 2+] i e produção de NO. A média de pico FI fluo-4 foi de 187 ± 22% da linha de base, que ocorreu a 35 ± 10 segundos após o início da perfusão de ATP. A taxa de produção de NO foi aumentada a partir de um nível basal de 0,15 ± 0,05 UA por min para 1,18 ± 0,37 UA por min durante os primeiros cinco minutos de exposição ao ATP. Todos os resultados foram relatados como a média ± erro padrão (SE). Eles são comparáveis ​​aos resultados derivados de vênulas intactas perfundidos individualmente 6,9,14,19. Figura 1: Fabricação Dispositivo de microfluidos e CE de carregamento (A) A vista esquemática da rede de microcanais.. O ângulo de largura e bifurcação dos microcanais são indicados em cada nível de ramificação. (B) A simulação numérica da distribuição de tensões de cisalhamento. A taxa de fluxo é 0,35 l / min. A altura do microcanal após desenvolvimento é de 80 uM. Estas duas figuras foram modificados a partir da publicação anterior com detalhes adicionais 5. (C) O desenvolvimento do molde mestre. O molde mestre da rede de microcanais é fabricado com SU-8 fotorresiste em bolacha de silício. (D) O processo de litografia macia. mistura PDMS é fundido para o molde mestre e curadas num forno. (E) Bonding PDMS canal para o substrato. O substrato utilizado para este dispositivo é um SPI lamelan revestida com uma fina camada de PDMS. A entrada e saída são criados com um furo-perfurador. De carga (F e G), CE. Cerca de 10 ul de solução da célula é colocada na entrada. Um fluxo suave é então induzida pela colocação de uma pipeta Pasteur na saída via fluxo capilar. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54014/54014fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014fig2.jpg" /> Figura 2: As imagens confocais de CE F-actina em rede de microcanais cultivadas (A) uma vista esquemática do desenho da rede.. As regiões seleccionadas mostradas em B - D estão indicadas no gráfico. (B - D) imagens Confocal de CE F-actina (vermelho) e núcleos (azul) da rede microvascular in vitro B 1. </strong&gt;, C e D 1 1 são as imagens projectadas a partir de metade superior das pilhas de imagens de microcanais, e B 2, C 2, 2 e D são as projecções de imagem a partir da metade inferior das pilhas de imagens. E. A vista em corte transversal como indicado 01/01 &#39;, 02/02&#39;, e 03/03 &#39;em B 1 - D 1, barra de escala = 100 pm. Estas imagens são adaptados a partir da publicação anterior 5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54014/54014fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54014/54014fig3.jpg" /> Figura 3: Comparações de VE-caderina distribuição na rede microvascular cultivadas com monocamada CE estaticamente cultivadas e intacto venule mesentérica de rato (. <strong&gt; A) A visão esquemática do projeto de rede com regiões selecionadas mostrados na B - D. (B - D) VE-caderina (verde) e núcleos de células (azul) coloração do in vitro microvasos rede D 1 e D 2 são parte superior e inferior das imagens projectadas recolhidos da mesma região de bifurcação, respectivamente.. (E) VE-caderina coloração das ECs estaticamente cultivadas. (F) VE-caderina coloração de venule rato intacta perfusão individualmente. Este valor publicado anteriormente 5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54014/54014fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54014/54014fig4.jpg" /> Figura 4: ATP induzida por aumentos na CE [Ca 2+ </sup&gt;] i. Os experimentos foram conduzidos a partir de 4 dispositivos e 7 a 12 ROIs (individuais CEs) por dispositivo foram selecionados para análise de dados. (A) O curso de tempo de ATP (10 uM) induzida por alterações no CE [Ca 2+] i (Fluo 4 FI / FI 0 × 100% ± EP) a partir de uma experiência representativa. (B) As imagens da experiência representativa (dados é mostrado em A). Esta é uma figura publicado anteriormente 5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54014/54014fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54014/54014fig5.jpg" /> Figura 5: ATP induzida a produção de NO As experiências foram realizadas em 3 e dispositivos 11 a 12 (ROIs indivíduo ECs) por dispositivo foram selecionados para análise de dados.. (A </strong&gt;) Tempo mudanças dependentes de intensidade DAF-2 fluorescência (FI DAF ± SE, deixou eixo Y) em ECs em condições basais e após exposição a ATP. A taxa de produção de NO (df / dt, linha pontilhada), foi obtido a partir do primeiro diferencial da conversão FI DAF acumulada (eixo dos Y direito). (B) Imagens representativas de uma experiência. O DAF FI aumentou ainda mais depois de um dador de NO, nitroprussiato de sódio (SNP), foi adicionado ao perfusado, indicando uma quantidade suficiente de intracelular DAF-2 para reagir com NO. Esta é uma figura publicado anteriormente 5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54014/54014fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Desenvolvimento e Caracterização de<em&gt; In Vitro</em&gt; Rede de microvasos e medições quantitativas de endotelial [ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E óxido nítrico Produção

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

development-characterization-vitro-microvessel-network-quantitative

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

8.6K visualizações.  College of Medicine, Penn State University. Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

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An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

A<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Método for Imaging Time-Lapse of cultivadas Rato Mesentéricas microvasculares Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Biologia do Desenvolvimento

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

Procedimento para o Desenvolvimento da Multi-profundidade Circular transversal reendotelizados microcanais-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Bioengenharia

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of vasculogenesis has become a central readout of endothelial progenitor cell functionality, and therefore, several attempts have been made to improve both in vitro and in vivo vasculogenesis models. However, standard methods are limited in scope, with static measurements failing to capture many aspects of this highly dynamic process. Therefore, the goal of developing this novel protocol was to assess the kinetics of in vitro vasculogenesis in order to quantitate rates of network formation and stabilization, as well as provide insight into potential mechanisms underlying vascular dysfunction. Application of this protocol is demonstrated using fetal endothelial colony forming cells (ECFCs) exposed to maternal diabetes mellitus. Fetal ECFCs were derived from umbilical cord blood following birth, cultured, and plated in slides containing basement membrane matrix, where they underwent vasculogenesis. Images of the entire slide wells were acquired using time-lapse phase contrast microscopy over 15 hours. Images were analyzed for derivation of quantitative data using an analysis software called Kinetic Analysis of Vasculogenesis (KAV). KAV uses image segmentation followed by skeletonization to analyze network components from stacks of multi-time point phase contrast images to derive ten parameters (9 measured, 1 calculated) of network structure including: closed networks, network areas, nodes, branches, total branch length, average branch length, triple-branched nodes, quad-branched nodes, network structures, and the branch to node ratio. Application of this protocol identified altered rates of vasculogenesis in ECFCs obtained from pregnancies complicated by diabetes mellitus. However, this technique has broad implications beyond the scope reported here. Implementation of this approach will enhance mechanistic assessment and improve functional readouts of vasculogenesis and other biologically important branching processes in numerous cell types or disease states.

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Here, we present a protocol for time-lapse imaging and analysis of vasculogenesis in vitro using phase contrast microscopy coupled with the open source software, Kinetic Analysis of Vasculogenesis. This protocol can be applied to quantitatively assess the vasculogenic potential of numerous cell types or experimental conditions that model vascular disease.

Análise cinética de Vasculogenesis quantifica a dinâmica de Vasculogenesis e angiogênese In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

Modelo in vitro 3D e pipeline computacional para quantificar o potencial Vasculogênico de progenitores endoteliais derivados de iPSC

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Sistema tridimensional do ensaio da angiogênese usando spheroids da co-cultura dados forma pela colônia endothelial que dá forma a pilhas e às pilhas de haste mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Diferenciação e estimulação mecânica de células endoteliais derivadas de hiPSC

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

Autor em destaque: Estudando células endoteliais derivadas de hiPSC cultivadas sob estimulação mecânica mediada por fluidos 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

In vitro Modelo de Embarcação Humana Fetal On-chip para Estudo da Mecanobiologia do Desenvolvimento

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endotelial Tubo celular Formação ensaio para a<em&gt; In Vitro</em&gt; Estudo da angiogênese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Desenvolvimento e Caracterização de

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Procedimento para o Desenvolvimento da Multi-profundidade Circular transversal reendotelizados microcanais-on-a-chip

Análise cinética de Vasculogenesis quantifica a dinâmica de Vasculogenesis e angiogênese In Vitro

Modelo in vitro 3D e pipeline computacional para quantificar o potencial Vasculogênico de progenitores endoteliais derivados de iPSC

Sistema tridimensional do ensaio da angiogênese usando spheroids da co-cultura dados forma pela colônia endothelial que dá forma a pilhas e às pilhas de haste mesenchymal

Micropatterning e Montagem de microvasos 3D

In vitro Modelo de Embarcação Humana Fetal On-chip para Estudo da Mecanobiologia do Desenvolvimento

In vitro Modelo de Embarcação Humana Fetal On-chip para Estudo da Mecanobiologia do Desenvolvimento

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Endotelial Tubo celular Formação ensaio para a