Name: development and characterization of in vitro microvessel network and quantitative measurements of endothelial [ca2+]i and nitric oxide production
Uploaded: 2016-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Heart, Lung, and Blood Institute concede HL56237, National Institute of Diabetes e Digestiva e Malattie renali Istituto DK97391-03, National Science Foundation (NSF-1.227.359 e EPS-1003907).

1. fabbricazione di dispositivi Microfluidic <ol><li> Fotolitografia di fabbricazione standard di un SU-8 50 Master Mold <ol><li> Pulire il wafer di silicio prima spin-coating. Risciacquare un wafer di silicio 2 pollici nudo con acetone per 15 min seguito da alcol isopropilico (IPA) per 15 min. Disidratare il wafer ponendolo su una piastra riscaldante a 150 ° C per 1 ora. Dopo la disidratazione, raffreddare il wafer a temperatura ambiente. </li><li> Spin-coat wafer di silicio con SU-8 fotosensibile. Aggiungere 2 ml di SU-8 photoresist sul wafer. Rampa wafer a 500 rpm a 100 rpm accelerazione / sec per 10 sec, seguita da 1,000 rpm a 300 rpm accelerazione / sec per 30 sec. (Vedi Supplemental Video 1) </li><li> Pre-cuocere il wafer su una piastra calda a 65 ° C per 10 minuti, quindi cuocere morbido a 95 ° C per 30 min. </li><li> Utilizzare l&#39;esposizione UV a trasformare il modello progettato da una maschera film al photoresist spin-rivestito. Stampa il modello su una sottile pellicola trasparente come maschera film. Posizionare la maschera pellicola sulla parte superiore dellaspin-rivestito photoresist ed esporre a UV con una dose di 300 mJ / cm 2. (Vedi Supplemental Video 2) Nota: In questo protocollo, il modello di rete di microcanali (159 micron canali madre ampie ramificazioni in quattro canali 100 micron figlia di larghezza) è stato progettato con il software CAD. Il modello sul film mostra come campo chiaro e il resto del film è coperta da inchiostro nero. Poiché SU-8 è un fotoresist negativo, la porzione del photoresist che è esposta al UV sarà reticolato e diventa insolubile al solvente durante lo sviluppo stampo (fase 1.1.6). Dopo lo sviluppo, questa porzione insolubile replicherà il pattern rete progettata e servire come stampo master. </li><li> Post-bake il wafer esposta su una piastra calda a 65 ° C per 1 min, quindi 95 ° C per 10 min. </li><li> Sviluppare lo stampo master. Utilizzare SU-8 sviluppatore come solvente per rimuovere il photoresist non-reticolato. Immergere il wafer di SU-8 sviluppatore per 3 minuti e risciacquare con IPAper 1 min. </li><li> Ripetere questo ciclo di sviluppo di 2-3 volte fino a quando non si ha formazione striscia bianca (residuo di fotoresist non curata) dopo il risciacquo IPA. asciugare delicatamente il wafer con azoto ed esaminare le caratteristiche minori del modello sotto un microscopio. Ripetere i cicli di sviluppo supplementari, se necessario. </li><li> Duro cuocere il wafer su una piastra calda a 150 ° C per 15 min. </li></ol></li><li> litografia soft <ol><li> mescolare manualmente le due parti (base e induritore) di polidimetilsilossano (PDMS) elastomero ad un peso. rapporto di 10: 1. </li><li> De-gas miscela PDMS con un essiccatore collegata con un vuoto casa per 15 min. Gettate la soluzione PDMS sullo stampo maestro fotosensibile. Lo spessore del PDMS deve essere superiore a 3 mm a fornire una tenuta stabile del tubo di ingresso / uscita. De-gas PDMS ancora per 15 min, e rimuovere le bolle d&#39;aria restanti con azoto gassoso, se necessario. Curare il PDMS fuse in un forno a 65 ° C per 3 ore. </li><li> Pulire la superficie diil vetrino di vetro con un nastro adesivo e un pulitore di plasma (trattamento al plasma 30 sec). Spin-coat PDMS ONU cured (0,5 ml) sul vetrino di vetro di rampa a 4.000 rpm a velocità di accelerazione / sec 500 rpm per 30 sec. Curare il PDMS spin-rivestite coprioggetto in stufa a 65 ° C per almeno 30 min. </li><li> Tagliare e rilasciare i PDMS curato dallo stampo master. Quindi creare un ingresso ed una uscita con ± 1 mm perforatrice di diametro in corrispondenza dell&#39;estremità distale dei canali madre. </li><li> Incollare il dispositivo al vetrino di vetro PDMS spin-rivestito. Ossidare le superfici delle PDMS e il vetrino coprioggetto con un pulitore plasma per 1 min. Dopo il trattamento al plasma di ossigeno, posizionare una goccia di acqua deionizzata (acqua deionizzata) sulla superficie di incollaggio, e posizionare le due parti insieme. Cuocere il dispositivo in un forno a 65 ° C per 30 minuti per ottenere un legame permanente. </li></ol></li></ol><img alt="Supplemental Video 1" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie1.jpg"/&gt; <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_1.mp4" target="_blank">Supplemental Video 1 (Tasto destro del mouse per scaricare).</a> <img alt="Supplemental Video 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014movie2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54014/Supplemental_video_2.mp4" target="_blank">Supplemental Video 2 (Tasto destro del mouse per scaricare).</a> 2. cellule endoteliali da semina e cultura <ol><li> Sterilizzazione dispositivi e fibronectina Coating <ol><li> Conservare la proprietà idrofoba della superficie PDMS intorno all&#39;ingresso / uscita dall&#39;ossidazione. Coprire la superficie PDMS intorno entrata e uscita con piccole strisce di nastro adesivo per prevenire l&#39;ossidazione. Questa procedura può impedire all&#39;acqua DI diffusione su tutta la superficie superiore del dispositivo durante la fase di riempimento (2.1.3). </li><li> Trattare il dispositivo PDMS con plasma di ossigeno for 5 min per cambiare la superficie da idrofila, quindi facilitare il flusso di fluido attraverso il microcanali e prevenire la bolla intrappolando nella procedura di riempimento (2.1.3). </li><li> Utilizzare una siringa con un ago inserito o una pipetta per riempire il dispositivo con acqua deionizzata dall&#39;ingresso. Continuare il riempimento fino a quando c&#39;è una goccia d&#39;acqua DI (30-50 ml) accumulato in uscita. Esaminare il dispositivo al microscopio per controllare se ci sono la formazione di bolle all&#39;interno del microcanali. Rimuovere la goccia d&#39;acqua eccessiva in ingresso ed uscita con un fazzoletto di carta. </li><li> Sterilizzare il dispositivo in una capsula di Petri con UV per un minimo di 3 ore in una cappa di biosicurezza laminare. Per evitare l&#39;evaporazione, coprire l&#39;ingresso / uscita con un sottile pezzo di PDMS, mettere un fazzoletto di carta umida all&#39;interno del piatto, e avvolgere il piatto con Parafilm. </li><li> Rivestire il dispositivo con fibronectina. Risciacquare il primo dispositivo con tampone fosfato salino (PBS), poi ricoprirlo con 100 ug / ml fibronectina notte in frigorifero (4 ° C). Mettere una goccia di soluzione in ingresso, e quindi creare una pressione negativa in uscita con un vuoto casa, una siringa con un ago o una pipetta. </li><li> Riempire il dispositivo con mezzi di coltura cellulare. Risciacquare il dispositivo con PBS manualmente per 3 volte prima di caricare i supporti di coltura cellulare. Riscaldare il dispositivo in un incubatore a 37 ° C. </li></ol></li><li> EC semina e la perfusione a lungo termine Nota: confronto con la cultura 2D CE statico convenzionale, il modello di rete microvasi in vitro con perfusione continua fatto nell&#39;ambiente di coltura cellulare più vicino alle condizioni in vivo. Il vitro di rete in microvasi dimostrato in questo protocollo può essere mantenuta fino a due settimane. La perfusione ben controllati continuamente riempire le sostanze nutrienti, rimuovere i rifiuti, e impedire un eccesso di confluenza del monostrato CE. Pertanto, può essere esteso ad un studi a lungo termine, mimando l&#39;ambiente cellulare ed emodinamica sotto diversi Physiological e condizioni patologiche. <ol><li> Mescolare HUVECs primarie in terreni di coltura HUVEC (MCDB 131) con l&#39;8% destrano (Peso Mol 70.000). Il destrano è usato per aumentare la viscosità dei mezzi di carico e ottenere un migliore risultato semina cellulare. La densità raccomandata è di circa 2-4 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Seme le cellule nel dispositivo. Mettere una goccia 10-20 ml di cellule oltre l&#39;ingresso. Introdurre una leggera corrente da uno inclinando il dispositivo o azione capillare usando una pipetta Pasteur di vetro in uscita. La chiave per un carico cella successo è quello di controllare la velocità di flusso inferiore a 1 mm / sec all&#39;interno dei canali più piccoli. </li><li> Controllare la semina delle cellule. Dopo la semina iniziale, incubare il dispositivo per 15-20 min (atmosfera umidificata al 5% di CO 2 a 37 ° C) prima di verificare lo stato di semina al microscopio. Se necessario, effettuare il caricamento delle cellule addizionali per ottenere una densità cellulare desiderato. </li><li> Lavare delicatamente il dispositivo con terreno di coltura cellulare (37° C) per rimuovere il destrano. Culture del dispositivo in assenza di flusso per la prima 6 ore in un incubatore (5% CO 2 a 37 ° C). </li><li> Impostare la connessione tubi per perfusione a lungo termine. Nastro il dispositivo in una capsula di Petri per impedire il movimento. Creare piccoli fori sul coperchio della scatola di Petri per inserimenti di aspirazione e tubo di uscita. Collegare il tubo di ingresso ad una siringa con un ago per la coltura cellulare mezzi di perfusione. Collegare il tubo di uscita ad un raccoglitore. Nota: posizionare il dispositivo e il collettore rifiuti in un incubatore di coltura cellulare, pur ponendo una pompa di perfusione di fuori dell&#39;incubatore e collegarlo al dispositivo dal lungo tubo di ingresso. Il tasso di perfusione è determinato dal disegno sperimentale. Nel presente dispositivo, utilizzare un tasso di perfusione di 0,35 microlitri / min e una gamma sollecitazione di taglio tra 1-2 dyne / cm 2. In questa condizione di perfusione, i HUVECs raggiungono confluenza in circa 3-4 giorni. </li></ol></li></ol> 3. Immunofluorescent colorazione <ol><li> Fissare la EC nel dispositivo mediante perfusione del 2% paraformaldeide per 30 minuti a 4 ° C, seguita da 1x PBS risciacquo a temperatura ambiente per 15 min e 1% BSA blocco per 30 min. Utilizzare una velocità di perfusione che è lo stesso di quello usato per la coltura cellulare. </li><li> Permeabilize l&#39;EC fissato per colorazione anticorpale con 0,1% Triton X-100. Profumato il dispositivo con Triton per 5-7 minuti per l&#39;etichetta VE-caderina, e 3 minuti per l&#39;etichetta F-actina. </li><li> Caricare gli anticorpi nel dispositivo. Profumato il dispositivo con 1x PBS per 15 minuti per lavare le soluzioni precedenti. caricare manualmente l&#39;anticorpo primario contro VE-caderina (anti-capra) nel dispositivo alla concentrazione di 2 mg / ml (volume totale è 20-50 microlitri). Conservare il dispositivo in frigorifero a 4 ° C durante la notte. Profumato l&#39;anticorpo secondario (asino anti-capra) da una pompa a siringa alla concentrazione di 7 mg / ml per 45-60 min. </li><li> Etichetta CE F-actina con falloidina. Profumato il dispositivo con fo PBS 1Xr 15 min prima di caricare manualmente phalloidin (10 ug / ml) per 7-10 min. </li><li> Label nuclei CE (v Lista dei materiali). </li><li> Risciacquare il dispositivo con PBS 1x e mantenerla a 4 ° C fino imaging. </li></ol> 4. imaging di fluorescenza del endoteliali [Ca 2+] i <ol><li> Profumato il dispositivo con albumina (10 mg / ml) di soluzione -Ringer per 15 min a 37 ° C. Utilizzare lo stesso tasso di perfusione di quello usato per la coltura cellulare. Le concentrazioni di tutti i componenti della soluzione di albumina-Ringer sono descritti nella Lista dei materiali. </li><li> Impostare sistema confocale per CE [Ca 2+] i di imaging con fluo-4 del mattino. Utilizzare un sistema microscopico confocale per Ca 2+ imaging. Utilizzare un laser ad argon (488 nm) per l&#39;eccitazione e impostare la banda di emissione come 510-530 nm. Raccogliere le immagini con un obiettivo 25X (immersione in acqua, NA: 0,95) a 512 x 512 formato di scansione. Utilizzare un z-passo di 2 micron e un intervallo di scansione per ogni pila di imaghi di 20 sec. </li><li> Profumato il dispositivo con fluo-4 AM (5 micron) per 40 min a 37 ° C, poi lavare il lume fluo-4:00 con la soluzione di albumina Ringer. </li><li> Acquisire le immagini di microvasi fluo-4 caricato. Raccogliere le immagini di base per 10 min. Profumato il dispositivo con ATP (10 pM) e registrare le variazioni di intensità di fluorescenza (FI) per 20 min. </li></ol> 5. imaging di fluorescenza di ossido nitrico Produzione <ol><li> Profumato il dispositivo con la soluzione di albumina Ringer per 15 min. Utilizzare una velocità di perfusione che è lo stesso di quello usato per la coltura cellulare. </li><li> Impostare il sistema di imaging di fluorescenza per misurare la produzione di ossido nitrico ATP-indotta. Utilizzare un microscopio dotato di una fotocamera CCD digitale a 12 bit ed un otturatore controllato da computer per la misurazione dell&#39;ossido nitrico. Utilizzare una lampada allo xeno 75 W come fonte di luce. Nota: selezionare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione e di emissione per il DAF-2 DA da un filtro di interferenza (480/40 nm) e uno specchio dicroico(505 nm) con una barriera passa-banda (535/50 nm). Utilizzare una lente obiettivo 20X (NA: 0,75) per raccogliere le immagini. Per minimizzare photobleaching, posizionare un filtro a densità neutra (0,5 N) di fronte al filtro di interferenza e limitare il tempo di esposizione a 0,12 sec. </li><li> Caricare le cellule con DAF-2 DA (5 micron). Profumato il dispositivo con DAF-2 DA per circa 35-40 minuti a 37 ° C. Registrare la linea di base del DAF-2 intensità di fluorescenza (FI DAF) dopo il caricamento iniziale. Nota: DAF-2 DA è continuamente presente nel perfusato tutto l&#39;esperimento 7. </li><li> Raccogliere DAF-2 immagini. Registrare la base di FI DAF per 5 min. Profumato il dispositivo con l&#39;ATP (10 micron) e raccogliere le immagini per 30 minuti con intervalli di 1 minuto. Raccogliere tutte le immagini dello stesso gruppo di celle nello stesso piano focale. </li></ol> Analisi 6. Dati <ol><li> Selezionare manualmente la regione di interesse (ROI) dalle immagini raccolte a livello di singola cellula. OgniROI copre l&#39;area di una cella singola che può essere indicata dal contorno fluorescenza. </li><li> Sottrarre fluorescenza di fondo e calcolare la media di ciascun FI ROI. </li><li> Misurare le variazioni ATP-indotti in CE [Ca 2+] i e la produzione di NO. Quantificare i cambiamenti ATP-indotti in CE [Ca 2 +] i calcolando le variazioni di Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, dove 0 è la FI FI media al basale durante albumina-Ringer perfusione prima di aggiungere ATP) meno la misura sfondo. Quantificare NO tasso di produzione conducendo la prima conversione differenziale del FI DAF nel corso del tempo. Nota: La durata di FI DAF rappresenta una produzione di NO cumulativo con il tempo. Pertanto, NO tasso di produzione è calcolato sulla base del profilo di FI DAF sotto basale e stimolata ATP condizioni. Dettagli di analisi dei dati e procedure sperimentali sono stati descritti in una precedente pubblicazione 7. </li></ol>

<ol>
	<li>Curry, F. R. E., Adamson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+modulation+at+the+cell,+microvessel,+or+whole+organ+level:+towards+closing+gaps+in+our+knowledge.">Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge.</a> Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).</li><li>Michel, C. C., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+permeability.">Microvascular permeability.</a> Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).</li><li>Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+soft+lithography.">Recent progress in soft lithography.</a> Mater Today. 8, 50-56 (2005).</li><li>Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+present+and+future+role+of+microfluidics+in+biomedical+research.">The present and future role of microfluidics in biomedical research.</a> Nature. 507, 181-189 (2014).</li><li>Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+recapitulation+of+functional+microvessels+for+the+study+of+endothelial+shear+response,+nitric+oxide+and+[Ca2+]I.">In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I.</a> PLoS One. 10, 0126797 (2015).</li><li>He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+cytoplasmic+calcium+in+single+microvessels+with+increased+permeability.">Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability.</a> Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).</li><li>Zhou, X., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+measurements+of+intracellular+nitric+oxide+in+intact+microvessels+using+4,5-diaminofluorescein+diacetate.">Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate.</a> Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).</li><li>Yuan, D., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+remodeling+alters+adhesion+protein+and+cytoskeleton+reactions+to+inflammatory+stimuli+resulting+in+enhanced+permeability+increases+in+rat+venules.">Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules.</a> Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).</li><li>He, P., Zhang, X., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++entry+through+conductive+pathway+modulates+receptor-mediated+increase+in+microvessel+permeability.">Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability.</a> Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).</li><li>Zhou, X., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+[Ca2+]i+and+caveolin-1+antagonistically+regulate+eNOS+activity+and+microvessel+permeability+in+rat+venules.">Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules.</a> Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).</li><li>Zhu, L., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-activating+factor+increases+endothelial+[Ca2+]+i+and+NO+production+in+individually+perfused+intact+microvessels.">Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels.</a> Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).</li><li>He, P., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depolarization+modulates+endothelial+cell+calcium+influx+and+microvessel+permeability.">Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability.</a> Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).</li><li>He, P., Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+hyperpolarization+increases+[Ca2+]i+and+venular+microvessel+permeability.">Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability.</a> J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).</li><li>Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caveolin-1+scaffolding+domain+promotes+leukocyte+adhesion+by+reduced+basal+endothelial+nitric+oxide-mediated+ICAM-1+phosphorylation+in+rat+mesenteric+venules.">Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).</li><li>Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-Mediated+Elevated+Intracellular+Calcium+and+Angiogenesis+in+Human+Microvascular+Endothelial+Cells+In+Vitro+are+Inhibited+by+Dominant+Negative+TRPC6.">VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6.</a> Microcirculation. 15, 605-614 (2008).</li><li>Tsai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+modeling+of+the+microvascular+occlusion+and+thrombosis+that+occur+in+hematologic+diseases+using+microfluidic+technology.">In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology.</a> The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).</li><li>Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+functional,+perfusable+3D+microvascular+networks+on+a+chip.">Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip.</a> Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).</li><li>D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+monitoring+of+ATP-stimulated,+endothelium-derived+nitric+oxide+production+in+channels+of+a+poly(dimethylsiloxane)-based+microfluidic+device.">Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device.</a> Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).</li><li>Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2O2-induced+endothelial+NO+production+contributes+to+vascular+cell+apoptosis+and+increased+permeability+in+rat+venules.">H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules.</a> Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).</li><li>Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+scale+microbioreactor+array+for+quantitative+cell+biology.">Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology.</a> Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).</li><li>Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angioadaptation:+Keeping+the+Vascular+System+in+Shape.">Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape.</a> Physiology. 17, 197-201 (2002).</li><li>Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+blood+rheological+parameters+in+the+microvasculature+of+cat+mesentery.">The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery.</a> Circulation Research. 43, 738-749 (1978).</li><li>Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+model+of+the+tumor-lymphatic+microenvironment+with+simultaneous+transendothelial+and+luminal+flows+reveals+mechanisms+of+flow+enhanced+invasion.">An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion.</a> Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).</li><li>McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-uniform+flow+behavior+in+a+parallel+plate+flow+chamber+:+alters+endothelial+cell+responses.">Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses.</a> Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).</li><li>Curry, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+venular+microvessel+permeability+by+calcium+influx+into+endothelial+cells.">Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells.</a> FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).</li><li>Kojima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+imaging+of+nitric+oxide+with+novel+fluorescent+indicators:+diaminofluoresceins.">Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins.</a> Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).</li><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins+and+the+future+of+microfluidics.">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li><li>Lamberti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinspired+microfluidic+assay+for+in+vitro+modeling+of+leukocyte-endothelium+interactions.">Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions.</a> Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).</li><li>Myers, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelialized+microfluidics+for+studying+microvascular+interactions+in+hematologic+diseases.">Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Shear+Adhesion+Map+Using+SynVivo+Synthetic+Microvascular+Networks.">Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks.</a> Jove-J Vis Exp. , e51025 (2014).</li><li>Booth, R., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+microfluidic+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+(iBBB).">Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB).</a> Lab on a Chip. 12, 5282-5282 (2012).</li><li>Shao, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+microfluidic+chip+for+endothelial+cells+culture+and+analysis+exposed+to+a+pulsatile+and+oscillatory+shear+stress.">Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress.</a> Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).</li><li>Yeon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+permeability+assay+system+in+a+microfluidic+device+mimicking+cerebral+vasculatures.">Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures.</a> Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).</li><li>Golden, A. P., Tien, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microfluidic+hydrogels+using+molded+gelatin+as+a+sacrificial+element.">Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element.</a> Lab Chip. 7, 720-725 (2007).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+microvessels+for+the+study+of+angiogenesis+and+thrombosis.">In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).</li><li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients.">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno interessi in competizione o conflitto di interessi da dichiarare.

<html> In questo articolo, presentiamo protocolli dettagliati per lo sviluppo della rete dei microvasi colta, la caratterizzazione di giunzioni CE e citoscheletro distribuzione F-actina, e le misurazioni quantitative della CE [Ca 2+] i e la produzione di NO utilizzando un dispositivo di microfluidica. Il dispositivo microfluidico perfuso fornisce un modello in vitro che consente uno stretto simulazione delle geometrie microvascolari in vivo e condizioni di flusso shear. Dal momento che la rete dei microvasi colta può essere formata da primari EC umana, questo approccio può servire come un utile strumento per indagare come patologicamente emocomponenti alterati da campioni di pazienti influiscono EC umani da parte di perfusione diretta dei campioni di sangue di pazienti per i microvasi coltivate e forniscono informazioni in clinica problemi. ECS umani microvasi sviluppati possono essere utilizzati anche per lo screening di droga al fine di evitare i potenziali discrepanze nella risposta ai farmaci tra i tessuti umani e animali. ve_content &quot;&gt; Il substrato dei dispositivi microfluidici mostrate in questo protocollo è un vetro di copertura antiscivolo (150-180 micron) spin-rivestito con uno strato sottile di PDMS. Questo strato sottile di PDMS è essenziale per alta risoluzione e tessuto vivo tempo reale Imaging, perché gli obiettivi apertura numerica maggiore di solito ha una distanza minima. il flusso laminare nel microcanale (range submillimetrica) presenta un bassissimo numero di Reynolds, e il differenziale di pressione è linearmente correlata al flusso, così la distribuzione delle sollecitazioni di taglio è dipendente unicamente dalla sulla geometria del canale. Pertanto, può essere ben controllata da alta precisione pompa di perfusione 20. Nel presente studio, la sollecitazione di taglio applicati alla rete microrecipiente colta HUVEC stato fra 1 a 10 dyne / cm 2, che è all&#39;interno della gamma di sforzo di taglio misurata nel sistema venoso 21,22. I sistemi di macro-fluido, come camera di flusso parallelo manca modelli di flusso complessi. in camere a flusso più grande scala (range mm cm), EC sono tipicamente coltivata solo in superficie inferiore (monolayer 2D), priva delle similitudini geometriche microvasi in vivo. Quando la larghezza della camera di flusso è superiore a 2 mm, il flusso omogeneo è confinata in una regione che è solitamente parecchi millimetri dalla uscita / ingresso, ed una coppia cento distanza dalla parete laterale 23 micron. Quando la larghezza della camera è aumentata alla gamma di centimetri, il flusso si differenziarsi in varie linee di corrente e le velocità di flusso cambierà tutta l&#39;area 24. Inoltre, la camera di flusso più grande scala consuma almeno 100 volte più perfusato per ottenere lo stesso sforzo di taglio come quello in microcanali. La distribuzione sollecitazione di taglio all&#39;interno della rete microcanali può essere simulato utilizzando uno strumento di modellazione numerica, e incomprimibili equazioni di Navier-Stokes stazionarie può essere risolto dai software elementi finiti. Il dispositivo microfluidico può essere fatta con un singlprocesso maschera microfabbricazione e. Il successo dello sviluppo dei microvasi colta, tuttavia, richiede attenzioni speciali ai dettagli. Dopo aver caricato la soluzione nei microcanali, ogni dispositivo deve essere controllato per la bolla di cattura al microscopio prima della semina CE. Se si verifica una bolla, è ancora possibile forzare in questa fase applicando una pressione idraulica in ingresso con una presa chiusa, come PDMS è un materiale permeabile all&#39;aria. Per mantenere un tasso di perfusione desiderato, aderente, senza una perdita è necessaria per tutte le connessioni ago / tubo. Il foro-puncher abbinato e le dimensioni tubi sono fondamentali per ottenere un raccordo stretto. Per garantire una consegna precisa della portata, la siringa sulla pompa di perfusione e il dispositivo deve essere posizionato allo stesso livello. Per modificare il perfusato, il tubo inserito deve essere staccato delicatamente dal dispositivo per evitare qualsiasi allungamento. Per aumentare la sollecitazione di taglio, aumenta step (come ad esempio 10 passi di incremento a 18 ore) sono raccoDED per evitare improvvisi cambi flusso causato peeling CE. Precedenti studi condotti su microvasi intatte irrorati singolarmente hanno indicato che gli aumenti agonisti indotte CE [Ca 2 +] i, e la successiva ossido nitrico sintasi endoteliale (eNOS) attivazione e la produzione di NO sono segnali necessari per una maggiore permeabilità microvascolare in condizioni infiammatorie 6,7 , 9-13,25. In questo protocollo, selezioniamo ATP come agonista rappresentante, in quanto è comunemente rilasciato da globuli rossi, piastrine aggregate, e tessuti danneggiati o in condizioni infiammatorie in vivo. Un indicatore di calcio di fluorescenza, Fluo-4 del mattino, è stato utilizzato per misurare i cambiamenti nel endoteliale [Ca 2+] i dopo l&#39;esposizione al ATP. La CE [Ca 2 +] i microvasi risposte in coltura sono simili a quelli trovati in microvasi intatti 7,9. Misurare la produzione CE NO è stato tecnicamente impegnativo per i biologi.Ad oggi, non vi è stato alcun indicatore fluorescente che permette di rilevare cambiamenti dinamici nella concentrazione di NO in modo simile agli indicatori di calcio. DAF-2 DA è stato ampiamente utilizzato per valutare la produzione di NO. Tuttavia, l&#39;utilizzo corretto, l&#39;interpretazione dei dati e l&#39;analisi dei dati ha bisogno di attirare l&#39;attenzione degli utenti. Poiché la trasformazione chimica di DAF-2 per DAF-2T in presenza di NO è irreversibile (conversione solo andata) 26, il DAF profilo di intensità di fluorescenza rilevato non rappresenta le variazioni di concentrazione di NO. Invece, indica la produzione DAF-2T accumulato nel tempo. Sulla base di questa cumulato DAF-2 fluorescenza (FI DAF) della curva, il NO tasso di produzione (df / dt) può essere derivata dalla prima conversione differenziale del FI DAF 7,11. Vale a dire, la pendenza della curva FI indica il tasso di produzione di NO e la fase di plateau indica aumentato ulteriore produzione di NO. Dopo la conversione, i dati generati da questa pr protocolloesented sia il basale NO tasso di produzione e le variazioni di produzione di NO in risposta a ATP con risoluzione temporale e spaziale a livello individuale CE all&#39;interno della rete dei microvasi. Attualmente PDMS è stato ampiamente utilizzato per applicazioni di microfluidica, in quanto è un permeabile elastomero morbido otticamente trasparente, non tossico, e gas 27-30. Tuttavia, dal momento che PDMS non è permeabile all&#39;acqua, non siamo riusciti a misurare direttamente la permeabilità del monostrato CE. Per ovviare a questa limitazione, alcune applicazioni hanno modificato le strutture murarie del canale come ad esempio l&#39;integrazione di una membrana permeabile nel canale 31, o la creazione di un permeabili &quot;aperture delle finestre&quot; con micro-pilastri o micro-fori 32,33, mentre altri sono stati concentrati sul modifica dei materiali del dispositivo come l&#39;utilizzo di dispositivi di idrogel o idrogel / dispositivi ibridi PDMS 17,34-36. Gli inconvenienti di tali dispositivi sono loro natura vulnerabili a disidratazione e la loro relativamente debole mproprietà echanical di stare stress o pressione. Il futuro sviluppo di materiale permeabile con resistenza meccanica migliorerà ulteriormente il dispositivo e il suo potenziale per le applicazioni biologiche più ampie.

Le cellule endoteliali (ECS) che ricoprono le pareti dei vasi sanguigni in vivo sono costantemente esposti a scorrere, ma EC coltivate sono spesso coltivati ​​in condizioni statiche e mostrano un fenotipo pro-infiammatorio 1,2. La tecnologia microfluidica consente un fluido controllato con precisione attraverso un microscala geometricamente vincolata (sub-millimetrica) canali 3, che prevede la possibilità per le cellule in coltura, in particolare per ECS vascolare, di crescere in condizioni di flusso desiderate. Queste caratteristiche rendono le condizioni di coltura cellulare più vicino a in vivo rispetto alle tradizionali, colture cellulari statiche 2D. Sono estremamente importante quando i dispositivi microfluidici sono utilizzati per modellare diversi tipi di vasculatures e studiare risposte CE verso stimoli meccanici e / o chimici. Nonostante i vantaggi dimostrati dalla rete microcanali su una coltura cellulare statica, l&#39;adattamento e l&#39;applicazione di microfluidica in f biomedicoield rimangono limitati. Segnalato da una recente revisione, la maggior parte delle pubblicazioni del settore (85%) sono ancora in riviste di ingegneria 4. Le prestazioni di dispositivi microfluidici non è stato abbastanza convincente per la maggior parte dei biologi di passare dalle tecniche attuali, come il test Transwell e la cultura piatto / vetro macro-scala scorrevole a questo dispositivo miniaturizzato. Microfluidica è un campo multidisciplinare, che richiede collaborazioni interdisciplinari per spostare questo campo in avanti. L&#39;obiettivo di questo articolo tecnico è quello di ridurre il divario di conoscenze tra le discipline e rendere le procedure di fabbricazione comprensibili da biologi, fornendo applicazioni biologiche e validazione funzionale dei microvasi microfluidica. I protocolli sperimentali visualizzati includono la fabbricazione di entrambi i dispositivi microfluidici e la loro utilità biologici, che rappresenta una stretta collaborazione tra gli ingegneri e biologi. Recentemente abbiamo riportato alcuniapplicazioni biologiche che utilizzano la rete dei microvasi in vitro con dispositivo di microfluidica 5. Per progettare opportunamente le dimensioni della rete microcanali e applicare la sollecitazione di taglio desiderata, un modello numerico è stato costruito con software fluidodinamica computazionale per stimare vicino il profilo di flusso. Primarie vena ombelicale cellule endoteliali umane (HUVEC) che sono state seminate nei microcanali raggiunti confluenza, cioè copriva l&#39;intera superficie interna del microcanale, in 3-4 giorni con perfusione continua. La formazione barriera corretta è stata dimostrata da VE-caderina colorazione e confrontati con quelli formati in condizioni di coltura cellulare statiche e in microvasi intatti. Applicando i protocolli sperimentali sviluppati in microvasi intatti perfuse singolarmente 6-8, abbiamo misurato quantitativamente le variazioni CE [Ca 2+] i e ossido nitrico (NO) in risposta ad adenosina trifosfato (ATP) con fluorescentedicatori e confocale e microscopia a fluorescenza convenzionale. L&#39;agonista-indotta aumenti CE [Ca 2+] i e la produzione di NO sono stati segnalati come necessari segnali intracellulari per infiammatorie aumenta mediatore indotte permeabilità microvascolare 6-15. Anche se alcuni studi precedenti hanno mostrato immagini di dispositivi microfluidici DAF-2 DA caricati 16,17, la risoluzione e dati appropriati analisi non aveva ancora raggiunto 18. A nostra conoscenza, questo studio dimostra le prime misurazioni quantitative di cambiamento dinamico agonisti indotta endoteliale I e produzione di NO che utilizza microfluidica sistema [2+ Ca] based. Tecniche di microfabbricazione hanno la flessibilità per fabbricare microcanali fino a pochi micron e consentire lo sviluppo di modelli complessi per simulare le geometrie del microcircolo in vivo. Qui abbiamo presentato una tipica rete a microcanali con tre livelli di ramificazione. Questorete è fabbricato dalla combinazione di fotolitografia che viene eseguita in una camera sterile microfabbricazione e litografia soft.

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929</td><td></td></tr><tr><td>Biopsy punch</td><td>Miltex</td><td>33-31 AA</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Albumin</td><td>MP Biomedicals</td><td>810014</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Brain Extract (BBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-4098</td><td></td></tr><tr><td>Cover-slip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542C</td><td></td></tr><tr><td>DAF-2 DA</td><td>Calbiochem</td><td>251505</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody</td><td>Life technologies</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5 (nuclei staining)&amp;nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4084</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2759-15MG</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Gibco</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-078</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548B</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pasteur pippette</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffered Saline Solution</td><td>Lonza</td><td>CC-5024</td><td></td></tr><tr><td>Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs)</td><td>Lonza</td><td>CC-2517</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol (IPA)</td><td>VWR</td><td>89125</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Mammalian Ringer Solution Ingredient</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl (132 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl (4.6 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (2.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (1.2 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Glucose (5.5 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (5.0 mM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Salt (9.1 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6007H</td><td></td></tr><tr><td>Hepes Acid (10.9 mM)</td><td>Research Organics</td><td>6003H</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 131 Culture Medium</td><td>Life technologies</td><td>10372-019</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin (F-actin staining)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Exel Int</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>Scotch tape</td><td>3M</td><td>34-8711-3070-3</td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>VWR</td><td>14672</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>MicroChem</td><td>SU-8 2050 Y111072</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>tissue culture flasks</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z707503-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Chemical Book</td><td>T6878</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin Neutralizer solution</td><td>Gibco</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution (TE)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Cole-Parmer</td><td>PTFE microbore tubing, 0.012&quot; ID x 0.030&quot; OD</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-6458</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Equipment&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Biosafety Laminar hood</td><td>NuAire</td><td>NU-425 Class II, Type A2</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica</td><td>TCS SL</td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Bel-Art</td><td>F42022</td><td></td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Wenesco</td><td>HP-1212</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp oven</td><td>Barnstead</td><td>3608-5</td><td></td></tr><tr><td>Lithography bench</td><td>Karl Suss</td><td>MA6 Contact Lithography</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Nikon</td><td>L200 ND &amp;amp; Diaphod 300</td><td></td></tr><tr><td>Shutter for the CCD camera</td><td>Sutter Instrument</td><td>Lambda 10-2</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>PVA TePla/Harrick plasma</td><td>M4L/PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>Brewer Science</td><td>Cee 200X</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump system</td><td>Harvard Apparatus</td><td>703005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Software&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments/Description&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>CAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD 2015</td><td></td></tr><tr><td>CFD simulation software</td><td>COMSOL</td><td>COMSOL Multiphysics 4.0.0.982</td><td></td></tr><tr><td>Images acquire and analyse for NO production&amp;nbsp;</td><td>Universal Imaging</td><td>Metafluor</td><td></td></tr></tbody></table>

development and characterization of in vitro microvessel network and quantitative measurements of endothelial [ca2+]i and nitric oxide production

Le cellule endoteliali (ECS) che ricoprono le pareti dei vasi sanguigni in vivo sono costantemente esposti a scorrere, ma EC coltivate sono spesso coltivati ​​in condizioni statiche e mostrano un fenotipo pro-infiammatorio. Sebbene lo sviluppo di dispositivi microfluidici è stato abbracciato dagli ingegneri più di due decenni, le loro applicazioni biologiche rimangono limitati. Un modello in vitro microvasi più fisiologicamente rilevanti convalidato da applicazioni biologiche è importante per far avanzare il campo e colmare il divario tra in vivo e in vitro. Qui, presentiamo procedure dettagliate per lo sviluppo della rete microrecipiente coltivate utilizzando un dispositivo microfluidico con una capacità di perfusione a lungo termine. Abbiamo anche dimostrare le sue applicazioni per misurazioni quantitative dei cambiamenti agonisti indotte CE [Ca 2 +] i e l&#39;ossido nitrico (NO) la produzione in tempo reale utilizzando confocale e microscopia a fluorescenza convenzionale. La rete dei microvasi formatolavoro con perfusione continua mostrato giunzioni ben sviluppati tra EC. Distribuzione VE-caderina era più vicino a quello osservato nei microvasi intatti di monostrati CE staticamente in coltura. ATP-indotta aumenti transitori in CE [Ca 2+] i e la produzione di NO sono stati quantitativamente misurata a livello individuale cellulari, che ha convalidato la funzionalità dei microvasi in coltura. Questo dispositivo microfluidico consente EC di crescere sotto una ben controllata, flusso fisiologicamente rilevanti, il che rende l&#39;ambiente di coltura cellulare più vicino in vivo rispetto che nelle culture 2D convenzionali, statiche. Il disegno di rete microcanali è altamente versatile, e il processo di fabbricazione è semplice e ripetibile. Il dispositivo può essere facilmente integrato nel sistema microscopica confocale o convenzionale consentendo imaging ad alta risoluzione. Più importante, perché la rete microrecipiente coltura può essere formata da ECS umani primari, questo approccio servirà come strumento utile per studiare comepatologicamente emocomponenti alterati da campioni di pazienti influenzano EC umane e forniscono informazioni sulle problematiche cliniche. Anche può essere sviluppato come piattaforma per lo screening di droga.

Questa sezione mostra alcuni dei risultati ottenuti con la rete microrecipiente coltura sviluppata con questo protocollo. Il modello microcanali è una ramificazione rete a tre livelli (Figura 1A). In questo disegno, a 159 micron di larghezza rami del canale madre in due 126 micron canali di larghezza, e rami di nuovo in quattro canali 100 micron figlia di larghezza. Una simulazione numerica 3D è stato eseguito per stimare le distribuzioni di sollecitazione di taglio sotto la portata di 0,35 microlitri / min (Figura 1B), che indica tre diversi livelli di sforzo di taglio all&#39;interno di questa rete microcanali. Il flusso laminare all&#39;interno dei microcanali è previsto per essere idrodinamico stabile senza la presenza di flusso disturbato o secondaria. Dopo uno stampo maestro SU-8 è stato fabbricato con un processo di fotolitografia standard (Figura 1C), un dispositivo PDMS è stato fabbricato mediante litografia soft replicare la ne microcanalidisegno Twork in un trasparente, l&#39;aria impalcatura permeabile (Figura 1D - E). Dopo CE semina (Figura 1F - G) e 3-4 giorni di perfusione continua, EC raggiunto confluenza e coperto con successo le superfici interne dei microcanali. CE F-actina e nuclei sono stati fluorescente all&#39;interno della rete e illustrati con immagini confocale. Sotto la sollecitazione di taglio di 1,0 dyne / cm 2, circa il 30% del HUVECs allungata lungo la direzione del flusso con l&#39;aumento fibre di stress centrali, mentre il resto 70% ha mantenuto il suo modello di ciottoli con dominata periferica F-actina 5. Il cambiamento di forma delle cellule taglio indotta appare meno evidente rispetto a quello comunemente osservati in colture cellulari 2D statico. In realtà in condizioni in vivo, l&#39;EC hanno diverse forme cellulari in diversi tipi di imbarcazioni, ma non facilmente cambiare la forma delle cellule in risposta al flusso chaNGES. Ulteriori studi sono necessari per determinare se questa differenza è il risultato della geometria del canale e ambiente perfusione che sono più vicini alle condizioni in vivo. Abbiamo anche misurato con successo cambiamenti ATP-indotte CE [Ca 2+] i e NO produzione (figure 4 e 5). ATP indotta aumenti transitori CE [Ca 2+] i e NO produzione. La media di picco FI fluo-4 era 187 ± 22% della linea di base, che si è verificato a 35 ± 10 secondi dopo l&#39;inizio della perfusione ATP. Il tasso di produzione di NO è stata aumentata da un livello basale di 0,15 ± 0,05 AU per min a 1,18 ± 0,37 AU per min entro i primi cinque minuti di esposizione ATP. Tutti i risultati sono stati riportati come l&#39;errore standard ± media (SE). Sono paragonabili ai risultati derivati ​​da venule intatte perfusi individualmente 6,9,14,19. Figura 1: Microfluidic Fabrication dispositivi e CE carico (A) La vista schematica della rete microcanali.. L&#39;angolo di larghezza e biforcazione dei microcanali sono indicati in ogni livello di ramificazione. (B) La simulazione numerica della distribuzione delle sollecitazioni di taglio. La portata è di 0.35 ml / min. L&#39;altezza del microcanale dopo lo sviluppo è di 80 micron. Queste due figure sono state modificate dalla pubblicazione precedente con ulteriori dettagli 5. (C) lo sviluppo dello stampo maestro. Lo stampo master della rete microcanali è fabbricato con SU-8 photoresist sul wafer di silicio. (D) Il processo di litografia soft. miscela PDMS è colato sullo stampo master e curato in un forno. (E) Bonding PDMS canale al substrato. Il substrato usato per questo dispositivo è un spi coprioggetton rivestito con uno strato sottile di PDMS. L&#39;ingresso e l&#39;uscita sono creati con un foro-perforatore. (F e G), CE loading. Circa 10 ml di soluzione di cellule è posto in ingresso. Una leggera corrente viene indotta mettendo una pipetta Pasteur in uscita tramite flusso capillare. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54014/54014fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54014/54014fig2.jpg" /> Figura 2: immagini confocali di EC F-actina in rete microchannel coltivate (A) Una vista schematica della progettazione di rete.. Le regioni selezionate mostrate in B - D sono indicati nel grafico. (B - D) immagini confocale di EC F-actina (rosso) e nuclei (blu) della rete microvasi in vitro B 1. </strong&gt;, C 1 e D 1 sono le immagini proiettate dalla metà superiore delle pile di immagini microcanale e B 2, C 2 e D 2 sono le proiezioni di immagine da metà inferiore delle pile di immagini. E. La vista in sezione indicata come 1-1 &#39;, 2-2&#39; e 3-3 &#39;in B 1 - D 1, Barra di scala = 100 micron. Queste immagini sono adattate dal precedente pubblicazione 5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54014/54014fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54014/54014fig3.jpg" /> Figura 3: Confronti di VE-caderina distribuzione in rete dei microvasi coltura con staticamente colta monostrato CE e intatto venule ratto mesenterica (. <strong&gt; A) La vista schematica del disegno di rete con regioni selezionate mostrato in B - D. (B - D) VE-caderina (verde) e nuclei cellulari (blu) della presenza in vitro microrecipiente rete D 1 e D 2 sono la parte superiore e inferiore delle immagini proiettate raccolte dalla stessa regione di biforcazione, rispettivamente.. (E) VE-caderina colorazione dei staticamente colta EC. (F) VE-caderina colorazione dei perfuso individualmente venule ratto intatto. Questa cifra ha pubblicato in precedenza 5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54014/54014fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54014/54014fig4.jpg" /> Figura 4: ATP indotta aumenti CE [Ca 2+ </sup&gt;] i. Gli esperimenti sono stati condotti da 4 dispositivi e da 7 a 12 ROI (individuale ECS) al dispositivo sono stati selezionati per l&#39;analisi dei dati. (A) La durata di ATP (10 micron) cambiamenti indotta in CE [Ca 2 +] i (Fluo 4 FI / FI 0 × 100% ± SE) da un esperimento rappresentativo. (B) Le immagini di questo esperimento rappresentativo (i dati vengono visualizzati in una). Si tratta di una cifra precedentemente pubblicato 5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54014/54014fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54014/54014fig5.jpg" /> Figura 5: ATP-indotta la produzione di NO Gli esperimenti sono stati condotti in 3 dispositivi e da 11 a 12 (ROI individuale ECS) al dispositivo sono stati selezionati per l&#39;analisi dei dati.. (A </strong&gt;) Tempo cambiamenti a carico di intensità DAF-2 fluorescenza (FI DAF ± SE, a sinistra l&#39;asse Y) in cellule endoteliali in condizioni basali e dopo l&#39;esposizione al ATP. Il NO tasso di produzione (df / dt, linea tratteggiata), è stata derivata dalla prima conversione differenziale del accumulato FI DAF (asse Y a destra). (B) Immagini rappresentative da un esperimento. Il FI DAF ulteriormente aumentato dopo un donatore di NO, sodio nitroprussiato (SNP), è stato aggiunto al perfusato, che indica una quantità sufficiente di intracellulare DAF-2 a reagire con NO. Si tratta di una cifra precedentemente pubblicato 5. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/54014/54014fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production at JoVE.com

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Sviluppo e caratterizzazione di<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvasi Rete e misurazioni quantitative di endoteliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; E ossido nitrico Produzione

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...

development-characterization-vitro-microvessel-network-quantitative

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

8.6K Views.  College of Medicine, Penn State University. Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Video: Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Metodo per Time-Lapse Imaging di coltura Rat mesenteriche microvascolari Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

Procedura per lo sviluppo di multi-profondità circolare a sezione trasversale Endothelialized microcanali-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

Bioingegneria

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of vasculogenesis has become a central readout of endothelial progenitor cell functionality, and therefore, several attempts have been made to improve both in vitro and in vivo vasculogenesis models. However, standard methods are limited in scope, with static measurements failing to capture many aspects of this highly dynamic process. Therefore, the goal of developing this novel protocol was to assess the kinetics of in vitro vasculogenesis in order to quantitate rates of network formation and stabilization, as well as provide insight into potential mechanisms underlying vascular dysfunction. Application of this protocol is demonstrated using fetal endothelial colony forming cells (ECFCs) exposed to maternal diabetes mellitus. Fetal ECFCs were derived from umbilical cord blood following birth, cultured, and plated in slides containing basement membrane matrix, where they underwent vasculogenesis. Images of the entire slide wells were acquired using time-lapse phase contrast microscopy over 15 hours. Images were analyzed for derivation of quantitative data using an analysis software called Kinetic Analysis of Vasculogenesis (KAV). KAV uses image segmentation followed by skeletonization to analyze network components from stacks of multi-time point phase contrast images to derive ten parameters (9 measured, 1 calculated) of network structure including: closed networks, network areas, nodes, branches, total branch length, average branch length, triple-branched nodes, quad-branched nodes, network structures, and the branch to node ratio. Application of this protocol identified altered rates of vasculogenesis in ECFCs obtained from pregnancies complicated by diabetes mellitus. However, this technique has broad implications beyond the scope reported here. Implementation of this approach will enhance mechanistic assessment and improve functional readouts of vasculogenesis and other biologically important branching processes in numerous cell types or disease states.

Kinetic Analysis of Vasculogenesis Quantifies Dynamics of Vasculogenesis and Angiogenesis In Vitro

Here, we present a protocol for time-lapse imaging and analysis of vasculogenesis in vitro using phase contrast microscopy coupled with the open source software, Kinetic Analysis of Vasculogenesis. This protocol can be applied to quantitatively assess the vasculogenic potential of numerous cell types or experimental conditions that model vascular disease.

Analisi cinetica di vasculogenesi quantifica dinamiche della vasculogenesi e dell'angiogenesi In Vitro

Vasculogenesis is a complex process by which endothelial stem and progenitor cells undergo de novo vessel formation. Quantitative assessment of ...

An In Vitro 3D Model and Computational Pipeline to Quantify the Vasculogenic Potential of iPSC-Derived Endothelial Progenitors

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent endothelial progenitors (EPs), which can differentiate into the cell types necessary to assemble mature, functional vasculature, have been derived from both embryonic and induced pluripotent stem cells. However, these cells have not been rigorously evaluated in three-dimensional environments, and a quantitative measure of their vasculogenic potential remains elusive. Here, the generation and isolation of iPSC-EPs via fluorescent-activated cell sorting are first outlined, followed by a description of the encapsulation and culture of iPSC-EPs in collagen hydrogels. This extracellular matrix (ECM)-mimicking microenvironment encourages a robust vasculogenic response; vascular networks form after a week of culture. The creation of a computational pipeline that utilizes open-source software to quantify this vasculogenic response is delineated. This pipeline is specifically designed to preserve the 3D architecture of the capillary plexus to robustly identify the number of branches, branching points, and the total network length with minimal user input.

Endothelial progenitors derived from induced pluripotent stem cells (iPSC-EPs) have the potential to revolutionize cardiovascular disease treatments and to enable the creation of more faithful cardiovascular disease models. Herein, the encapsulation of iPSC-EPs in three-dimensional (3D) collagen microenvironments and a quantitative analysis of these cells&#8217; vasculogenic potential are described.

Un modello 3D in vitro e una pipeline computazionale per quantificare il potenziale vasculogenico dei progenitori endoteliali derivati da iPSC

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a patient-specific, proliferative cell source that can differentiate into any somatic cell type. Bipotent ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

Sistema di analisi dell'angiogenesi tridimensionale utilizzando Gli spheroidi co-culturali formati da cellule formanti colonia endoteliale e cellule staminali mesenchiche

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Differenziazione e stimolazione meccanica di cellule endoteliali derivate da hiPSC

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

Autore in primo piano: Studio di cellule endoteliali derivate da hiPSC coltivate sotto stimolazione meccanica mediata da fluidi 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

In vitro Modello di vaso umano fetale su chip per studiare la meccanobiologia dello sviluppo

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endoteliali Tubo cellulare saggio Formazione per la<em&gt; In Vitro</em&gt; Studio di Angiogenesi

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Sviluppo e caratterizzazione di

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Un

Procedura per lo sviluppo di multi-profondità circolare a sezione trasversale Endothelialized microcanali-on-a-chip

Analisi cinetica di vasculogenesi quantifica dinamiche della vasculogenesi e dell'angiogenesi In Vitro

Un modello 3D in vitro e una pipeline computazionale per quantificare il potenziale vasculogenico dei progenitori endoteliali derivati da iPSC

Sistema di analisi dell'angiogenesi tridimensionale utilizzando Gli spheroidi co-culturali formati da cellule formanti colonia endoteliale e cellule staminali mesenchiche

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

In vitro Modello di vaso umano fetale su chip per studiare la meccanobiologia dello sviluppo

In vitro Modello di vaso umano fetale su chip per studiare la meccanobiologia dello sviluppo

In vitro Modello di vaso umano fetale su chip per studiare la meccanobiologia dello sviluppo

Endoteliali Tubo cellulare saggio Formazione per la