Name: determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings at JoVE.com

Agradecemos ao final de Rudy Limburg para fabricar as perímetro de braço cardan, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, e Raju Metherate para nos emprestar equipamentos e Almut Kelber e Kentaro Arikawa, para o incentivo. Este trabalho foi apoiado por uma National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship para KJM e concessão NSF IOS-1257627 para ADB

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

gravação intracelular pode ser uma técnica difícil de dominar, devido aos muitos passos técnicos envolvidos. Para experiências com sucesso vários pontos importantes devem ser considerados. Em primeiro lugar, é importante ter uma tabela adequadamente vibratoriamente-isolado no qual é realizada a experiência. Muitos pesquisadores usam tabelas de ar, que separam completamente a mesa a partir da base, dando isolamento de vibração superior. Nossa configuração envolve uma mesa de mármore de espessura com uma caixa de areia no topo, na qual é colocado o aparelho estágio micromanipulador / suporte do eletrodo / espécime. Esta é uma alternativa eficaz e mais acessível a uma tabela de ar, especialmente se o acesso ao gás em casa ou ar comprimido é uma limitação. Podem ser tomadas como medidas adicionais de absorção de vibrações como suspensão a ar passivo, ou a adição de elementos de amortecimento para os pés da tabela (por exemplo, abriu bolas de tênis, tubos de bicicleta, almofadas de gel de espessura). Além disso, é essencial que a configuração experimental estar dentro de umgaiola de Faraday com tudo devidamente aterrada. A gaiola de Faraday deve ter uma tela de malha de metal na frente que pode ser removido quando se trabalha dentro da gaiola e substituído facilmente quando a gravação. Mesmo uma pequena quantidade de ruído eléctrico ambiente (especialmente 50 Hz ruído da principal fonte de alimentação AC) pode fazer uma gravação de outra forma boa inutilizável. Ao preparar a amostra, hemolinfa e pigmentos camadas em torno da ommatidia pode impedir gravações bem sucedidas. Se o furo na córnea é cortado muito grande, de bombeamento normal da hemolinfa no corpo faz com que a superfície do líquido para cima e para baixo no local do corte, resultando em uma gravação instável. Uma vez que o furo é cortado, hemolinfa e camadas de pigmento de superfície irá coagular rapidamente num sarna impenetrável mesmo quando seladas com geleia de petróleo, por isso é importante para obter o eléctrodo para dentro do olho, o mais rapidamente possível. solução de Ringer, também pode ser usado em vez de vaselina. O eléctrodo de terra pode ser introduzido nobucais ou no tronco de uma antena de corte. Além disso, muitas vezes é útil para manter o animal tão escuro-adaptado quanto possível. Para este método, os passos incluem manter sala de gravação muito escuro, bloqueando a luz difusa da lâmpada Xenon de entrar na gaiola de Faraday, curta duração do estímulo flashes (30-50 ms), e uma baixa frequência suficiente entre flashes (0.5 ou superior). Quando um pigmento visual absorve um fotão, o cromóforo em rodopsina muda de 11- cis-3-hydroxyretinal para todos - trans-retinal, induzindo a alteração conformacional da proteína opsina, e activar todo o complexo como metarodopsina, que inicia a proteína G cascata. Photo-branqueamento ocorre quando luz de alta intensidade faz com que o cromóforo para separar fisicamente a partir da proteína opsina. O tempo é um fator limitante nesta experiência porque o eletrodo irá gravar apenas estavelmente respostas de dentro da célula por um determinado período de tempo antes que ele cai foraou a membrana é danificado. Por esta razão, não quebram para permitir que a célula a se recuperar, mas o fazemos usar uma duração do flash e frequência que encontramos não degrada a resposta da célula ao longo do tempo. É importante para diminuir a frequência e intensidade da luz se foto-branqueamento ocorre. Durante a gravação, um grande ponta do eletrodo ou grande movimento pelo eletrodo pode danificar o celular ao penetrar a membrana. Somente finas pontas (pelo menos ~ 100 mohms) e pequenos movimentos devem ser usados ​​quando se aproxima de uma célula para a gravação. Se a gravação intracelular é aplicada para outras aplicações, tais como gravações cerebrais, extremamente finas, resistentes eléctrodos pode ser puxado através de vidro de quartzo, mas um puxador especializado deve ser utilizado para estes eléctrodos. Quando pela primeira vez fazendo um eletrodo puxando programa, verificamos resistência de ponta de aterro eletrodo, fixando-o porta-eletrodo em uma configuração simulada, e colocando a ponta e eletrodo terra em solução salina. Next aplicamos uma corrente para medir a mudança na tensão no osciloscópio. Para mover a ponta do eletrodo usamos um micromanipulador manual que se move ao longo de dois eixos. Existem outros manipuladores incluindo os digitais que permitem o movimento ao longo de todos os três eixos, e estes podem ser utilizados para este ou mais complexos aplicações. Há muitas maneiras de construir um palco para gravação, e há muitos tipos diferentes de hardware e software utilizados na gravação e análise dos dados observados. Nossa configuração representa uma configuração simples, fácil e acessível da plataforma de gravação. Na construção da curva VlogI, as funções desenvolvidas por Naka e Rushton 33 e outros 34,35 contas para as porções não-lineares das respostas traçados. Vários métodos são usados ​​para ajustar esta curva para os dados, e representada graficamente os resultados de um tal método que não requeira o software de ajuste de curva, embora outros métodos também são adequados 36,37 ( <strong&gt; Figura 7). Também pode ser útil para comparar a sensibilidade espectral para modelos de absorvância rodopsina a um dado comprimento de onda de pico. Vários modelos publicados como objectivo reproduzir rodopsina absorvância espectros 38,39. Uma ideia mais precisa do espectro de absorção do pigmento visual expresso em uma célula de fotorreceptores de insectos pode ser modelado tendo em conta as propriedades ommatidial tais como pigmentos de filtragem, mas isso requer a medição de parâmetros fisiológicos e anatómicos adicional 11,40. Uma limitação deste método é que, se o organismo estudo expressa mais do que uma opsina geneticamente semelhantes no olho, pode ser difícil identificar qual opsina ARNm corresponde provavelmente a que classe espectral de células fotorreceptoras. Para superar este problema, este método tem sido combinada com o corante-injecções e hibridação in situ ou imuno-histoquímica para identificar com sucesso as opsinas expresso em células gravadas 10. Nosso método é simples e acessível para os pesquisadores não familiarizados com eletrofisiologia visual. Esta técnica é comum em neuroscience, mas específica e métodos claros estão ausentes na literatura, tornando este método de difícil reprodução. Embora existam muitas variações desta técnica, oferecemos uma maneira simples para medir a sensibilidade espectral do olho composto. Os dados fisiológico é uma peça importante de provas em histórias de ecologia visual e evolução 41. variação de sequência de opsina está ligado intimamente com a sensibilidade de uma célula foto-receptor, tornando este método ideal para estudos que examinam a base genética para a mudança fenotípica. A medição da sensibilidade das células fotorreceptoras também pode ser emparelhado com ensaios de discriminação de cor comportamentais, mostrando a base fisiológica para importantes limiares de discriminação na visão de cores 42-46. Em manipulações genéticas ou terapêuticos em Drosophila por exemplo, este technique pode ser uma boa maneira de medir a função fisiológica adequada do olho ou cérebro, bem 47,48. Embora o nosso não é o primeiro ou o método mais complexo de gravação intracelular no olho, a nossa esperança é que podemos tornar este método mais facilmente disponíveis para a reprodução e integração em programas de investigação fora da neurociência formal.

As propriedades eléctricas de células tais como neurónios são observadas através da medição do fluxo de iões através das membranas celulares, como uma mudança na tensão ou corrente. Uma variedade de técnicas electrofisiológicas foram desenvolvidos para medir bioeléctico eventos em células. Os neurónios encontrados nos olhos dos animais são acessíveis e os seus circuitos muitas vezes é menos complexa do que no cérebro, fazendo com que estas células bons candidatos para estudo electrofisiológico. As aplicações comuns de eletrofisiologia no olho incluem eletrorretinografia (ERG) 1,2 e microeletrodos de gravação intracelular. ERG envolve a colocação de um eléctrodo dentro ou sobre o olho de um animal, aplicando-se um estímulo de luz e medindo a variação de tensão como a soma de todas as respostas de células vizinhas 3-6. Se alguém está interessado especificamente na caracterização sensibilidades espectrais de células fotorreceptoras individuais, muitas vezes vários tipos de células respondem simultaneamente em diferentes pontos fortes para um dado estímulo; assimpode ser difícil determinar a sensibilidade de tipos específicos de células a partir de dados do ERG especialmente se houver vários tipos diferentes de células fotorreceptoras espectralmente semelhantes no olho. Uma possível solução é criar transgênicos Drosophila com o gene fotorreceptor (opsina) de interesse expressa nas células maioria R1-6 no olho e depois executar ERGs 7. Desvantagens potenciais deste método incluem não a baixa expressão da proteína fotorreceptor 8, eo período de tempo longo para a geração e triagem de animais transgênicos. Para os olhos, com menor número de tipos de fotorreceptores espectralmente distintos, a adaptação do olho com filtros coloridos podem ajudar com a redução da contribuição de alguns tipos de células para o ERG, permitindo assim a estimativa da sensibilidade espectral máximos 9. gravação intracelular é uma outra técnica em que uma multa eletrodo espeta uma célula e um estímulo é aplicado. Os registros de eletrodos só isso indivA resposta de células idual para que a gravar e analisar várias células individuais podem produzir sensibilidades específicas de fisiologicamente diferentes tipos de células 10-14. Embora o nosso protocolo centra-se na análise de sensibilidade espectral, os princípios básicos da intracelular de gravação com eletrodos pontiagudos são modificáveis ​​para outras aplicações. Usando uma preparação diferente de uma amostra, por exemplo, e usando eléctrodos de quartzo afiadas, um pode gravar a partir de mais profundo no lobo óptica ou outras regiões do cérebro, de acordo com a questão que se coloca. Por exemplo, os tempos de resposta de células fotorreceptoras individuais 15, a actividade de células na óptica lóbulos 16 (lâmina, medula ou lobula 17), cérebro 18 ou outros gânglios 19 também podem ser gravadas com técnicas semelhantes, ou estímulos de cor pode ser substituído com polarização 20 -22 ou movimento estímulos 23,24. Fototransdução, o processo pelo qual a luzenergia é absorvida e transformada em um sinal eletroquímico, é uma característica antiga comum a quase todos os dias atuais filos animais 25. O pigmento visual encontrado em células fotorreceptoras e responsável por iniciar fototransdução visual é rodopsina. Rodopsinas em todos os animais são constituídos por uma proteína opsina, um membro da família G transmembranar sete do receptor acoplado à proteína, e um cromóforo associado que é derivada de uma molécula de retina ou semelhantes 26,27. Opsina sequência de aminoácidos e estrutura cromóforo afectar a absorvência da rodopsina para diferentes comprimentos de onda de luz. Quando um fotão é absorvido pelo cromóforo a rodopsina torna-se activa, iniciando uma cascata de proteína G na célula que, em última análise conduz à abertura de canais iónicos ligados à membrana 28. Diferentemente da maioria dos neurônios, células fotorreceptoras sofrer alterações potenciais graduados que podem ser medidos como uma mudança relativa na amplitude da resposta com a mudança de estímulo luminoso. Tipicamente, uma dadaTipo de fotorreceptores expressa apenas um gene da opsina (embora existam exceções 8,10,29-31). visão de cores sofisticada, do tipo encontrado em muitos vertebrados e artrópodes, é conseguido com um olho complexo de centenas ou milhares de células fotorreceptoras cada expressando mais uma ou ocasionalmente tipos rodopsina. A informação visual é capturado por comparação das respostas sobre o mosaico de fotorreceptores via de sinalização a jusante neural complexo no olho e no cérebro, resultando na percepção de uma imagem completa a cores e com movimento. Depois de medir as respostas de matérias de uma das células fotorreceptoras para diferentes comprimentos de onda da luz de gravação via intracelular, é possível calcular a sensibilidade espectral. Este cálculo baseia-se no princípio de Univariance, o que indica que a resposta de uma célula de fotorreceptores é dependente do número de fotões que absorve, mas não sobre as propriedades particulares dos fotões que absorve 32. Qualquer fotões que é absorbed por rodopsina irão induzir o mesmo tipo de resposta. Na prática, isto significa que a amplitude de resposta em bruto de uma célula irá aumentar devido a um aumento na intensidade da luz (mais fotões de absorver), ou a uma mudança no comprimento de onda para a sua sensibilidade de pico (maior probabilidade de rodopsina absorvendo esse comprimento de onda). Nós fazemos uso deste princípio em relacionar as respostas celulares a uma intensidade conhecida e ao mesmo comprimento de onda de respostas em diferentes comprimentos de onda e na mesma intensidade, mas sensibilidade relativa desconhecida. Os tipos de células são frequentemente identificado pelo comprimento de onda a que os seus picos de sensibilidade. Aqui nós mostramos um método para gravação e análise de sensibilidade espectral de fotorreceptores no olho de uma borboleta intracelular, com um foco em tornar este método mais acessível à comunidade científica em geral. Embora a gravação intracelular continua a ser comum na literatura, particularmente com respeito à visão de cores em insetos, encontramos that descrições de materiais e métodos são geralmente demasiado curto para permitir a reprodução da técnica. Nós apresentamos este método em formato de vídeo com o objectivo de permitir sua replicação mais fácil. Descrevemos também a técnica de utilização de equipamento de fácil obtenção e acessível. Abordamos ressalvas comuns que muitas vezes não são relatados, que retardam a investigação ao otimizar uma técnica nova e complexa.

<table><tbody><tr><td>Butterfly pupae</td><td></td><td></td><td>Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits</td></tr><tr><td>Large plastic cylinder</td><td></td><td></td><td>Any chamber that remains humidified will work</td></tr><tr><td>Insect pins, size 2</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>100% Desert Mesquite Honey</td><td>Trader Joe&#039;s</td><td></td><td>Any honey or sucrose solution will work</td></tr><tr><td>Xenon Arc Lamp</td><td>Oriel Instruments</td><td>66003</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Universal Power Supply</td><td>Oriel Instruments</td><td>68805</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Optical Track</td><td>Oriel Instruments</td><td>11190</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Large (2x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11641</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Small (4x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10</td><td>Newport Corporation</td><td>TA-8Q20-10</td><td></td></tr><tr><td>Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 &amp;amp; 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr><tr><td>No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>Fixed lens mount, 50.8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>Fixed lens mount, 25.4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td>Condenser lens assembly</td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>Convex silica lens, 50.8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>Six Position Filter Wheel, x2</td><td>Newport Corporation</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>Filter Wheel Mount Hub</td><td>Newport Corporation</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>Concave silica lens, 25.4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPC034</td><td></td></tr><tr><td>Collimator holder</td><td>Newport Corporation</td><td>77612</td><td></td></tr><tr><td>Collimating beam probe</td><td>Newport Corporation</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>600 &amp;mu;m diameter UV-vis fiber obtic cable</td><td>Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Shutter with drive unit</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND10</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Cal lamp</td><td>Ocean Optics</td><td>LS-1-Cal</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite Software</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 300 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 310 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 320 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 330 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 340 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 350 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 360 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67760</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 370 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 380 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 390 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 400 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 410 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 420 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 430 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 440 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 450 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 460 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 470 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 480 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 492 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 500 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 510 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 520 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 532 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65640</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 540 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 550 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 560 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 570 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 580 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65646</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 589 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65647</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 600 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65648</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 610 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65649</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 620 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65650</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 632 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65651</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 640 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65653</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 650 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65655</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 660 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67769</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 671 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65657</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 680 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67770</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 690 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65659</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 700 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67771</td><td></td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td></td><td></td><td>Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>Wild M5</td><td>Any Stereomicroscope will do</td></tr><tr><td>Microscope stand with swinging arm and heavy base</td><td>McBain Instruments</td><td></td><td>Any heavy base with arm will do</td></tr><tr><td>Cardan arm</td><td></td><td></td><td>Custom built, See &lt;strong&gt;Figure 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Fiber-lite high intensity illuminator</td><td>Dolan-Jenner</td><td>MI-150</td><td>For lighting specimen</td></tr><tr><td>Fiber-lite goose-neck light guide</td><td>Dolan-Jenner</td><td>EEG 2823</td><td>Any goose-neck light guide will do</td></tr><tr><td>Marble table</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Raised wooden table</td><td></td><td></td><td>Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath</td></tr><tr><td>Wooden box filled with sand</td><td></td><td></td><td>custom built, any box with sand</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Carl Zeiss - Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Specimen stage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alligator clip wires for grounding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulated copper wire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver wire, 0.125 mm diameter</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW0510</td><td></td></tr><tr><td>BNC cables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preamplifier with headstage</td><td>Dagan Corporation</td><td>IX2-700</td><td></td></tr><tr><td>Humbug Noise reducer</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe</td><td>EZ Digital</td><td>os-5030</td><td></td></tr><tr><td>BNC T-adapter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powerlab hardware 2/20</td><td>ADI instruments</td><td>ML820</td><td></td></tr><tr><td>Labchart software</td><td>ADI instruments</td><td>Chart 5</td><td></td></tr><tr><td>10 MHz Pulse Generator</td><td>BK Precision</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Borosillicate glass capillaries with filament</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, 3 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slotted plastic tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low melting temperature wax</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soldering Iron</td><td>Weller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platform with ball-and-socket magnetic base</td><td>Hama photo and video</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double edge carbon steel, breakable razor blade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings

gravação intracelular é uma técnica poderosa usada para determinar a forma como uma única célula podem responder a um dado estímulo. Na pesquisa visão, a gravação intracelular tem sido historicamente uma técnica comum usada para estudar as sensibilidades de células fotorreceptoras individuais a diferentes estímulos luminosos que ainda está sendo usado hoje. No entanto, continua a existir uma carência de metodologia detalhada na literatura para os investigadores que desejam replicar experiências de gravação intracelulares no olho. Aqui nós apresentamos o inseto como um modelo para examinar a fisiologia do olho em geral. células fotorreceptoras de insectos estão localizados perto da superfície do olho e são, portanto, fácil de alcançar, e muitos dos mecanismos envolvidos na visão são conservadas entre filos animais. Nós descrevemos o procedimento básico para in vivo de gravação intracelular de células fotorreceptoras no olho de uma borboleta, com o objetivo de tornar esta técnica mais acessível a pesquisadores com pouca experiência anterior em electrophysiology. Introduzimos o equipamento básico necessário, como preparar uma borboleta vivo para o registo, o modo de inserir um microeléctrodo de vidro em uma única célula, e, finalmente, o processo de gravação em si. Nós também explicar a análise básica de dados de resposta matérias para determinar sensibilidade espectral de tipos de células individuais. Embora o protocolo centra-se na determinação da sensibilidade espectral, outros estímulos (por exemplo, luz polarizada) e variações do método são aplicáveis ​​a esta configuração.

Para muitos elementos da configuração de gravação, uma descrição escrita não fornece detalhes suficientes. A Figura 1 é um esquema dos componentes envolvidos na configuração completa de gravação. Na Figura 2, os espectros são traçados para a luz branca e cada um filtro de interferência para dar um sentido de por que é necessário um factor de correcção eo que é necessário para calcular essa correção. A Figura 3 mostra fotos e um diagrama do braço Cardan que é usado para estes experiências. a Figura 4 é uma imagem composta que mostra a fase de gravação e micromanipulador. a Figura 5 mostra vários passos na preparação de uma borboleta para a experiência. Uma vez que o início da gravação, uma alteração na tensão negativa em resposta a um flash de luz significa que o eléctrodo está fora de uma célula, como na Figura 6a. A força da resposta depende da proximidade do eléctrodoDica Para uma célula de fotorreceptores, e do ângulo de incidência da luz do flash. A resposta deve ser grande (&gt; 30 mV) antes de a ponta está perto o suficiente para uma célula para empalar. Figura 6B mostra uma resposta despolarizante claro para um estímulo de luz, o que significa a entrada em uma das células fotorreceptoras. O potencial de repouso deve ser estável e a amplitude da resposta deve ser grande (pelo menos 40 mV), embora a amplitude absoluta pode variar consideravelmente. Medimos a resposta relativa, por isso é mais importante que a relação sinal-ruído é alta. Se o descanso alterações potenciais grandemente, a forma de onda de resposta parecer anormal, ou a resposta máxima é demasiado baixo, então a comparação das respostas relativas em todos os filtros de interferência torna-se impossível. Exemplos de gravações não utilizáveis ​​são mostrados na Figura 6c, 6d. Depois de completar um registo bem sucedido, as respostas ND deve ser traçada e a equação Naka-Rushton deve ser ajustada aos dados 33, shown na Figura 7. Esta figura é representada usando a série filtro ND, sem quaisquer filtros de interferência. Se a gravação é estável, os dados da série filtro ND deve ser semelhante antes e depois da experiência. Sensibilidade espectral é determinado pelo ajuste da equação Naka-Rushton para a trama VlogI na Figura 7, em seguida, resolvendo para (I) para cada resposta (V) em um determinado comprimento de onda, como explicado nos cálculos da secção 6 do protocolo. Um exemplo representativo de sensibilidade espectral derivada de uma única gravação é plotado na Figura 8a (por favor note que este exemplo mostra dados reais calculados, mas o pico foi deslocado como este resultado é inédito). Os tipos de células podem ser classificadas por uma sensibilidade de pico no comprimento de onda similar e forma global do espectro de sensibilidade. Tipos de células semelhantes são então calculados e a sensibilidade média é representada com barras de erro padrão em cada comprimento de onda na Figure 8b. Sensibilidades espectrais de três tipos de células típicos encontrados em um insecto são mostrados na Figura 8c (magnitude e barras de erro são calculados a partir de dados reais, mas os picos são deslocados). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig3.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> Figura 1:. Esquemático de componentes de gravação Componentes do caminho da luz, espécime de configuração, e gravação de hardware são indicados. Trilha óptica senta-se no banco de madeira fora da gaiola de Faraday. Xe, lâmpada de arco de xenon, Cd, montagem condensador, Lx, lente convexa, ND, roda de filtro de densidade neutra, Cf, filtro de interferência, S, obturador, Lc, lente côncava, Co , sonda feixe collimating, FO, cabo de fibra óptica. A gaiola de Faraday senta-se nabanco de madeira em todo o espécime. O banco de madeira fica acima, mas não toque na mesa de mármore vibrationally isolado por baixo. Gravação (Rc) e de referência (Rf) eléctrodos estão ligados ao andar de entrada (Hs). Rc é introduzida no olho (E) e Rf é introduzido numa outra parte do corpo. O headstage é parte da configuração pré-amplificador (Pa) fora da gaiola de Faraday. O sinal é transmitido a partir do pré-amplificador de ruído através do redutor da farsa (Hb), e no osciloscópio (OS). A partir do osciloscópio o sinal é passado através do hardware Powerlab (Plb) e em que o computador portátil (CPU), onde ele é lido pelo software LabChart. O obturador é controlado por um gerador de funções (Fg) que é passado através de um segundo canal no osciloscópio, e podem também ser passados ​​através de um segundo canal no hardware Powerlab se esse sinal vai ser gravado. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig5.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> Figura 2:. Luz Branca e Interferência Filtro Spectra usada para calcular fatores de correção Os espectros medida no passo 2.5 do protocolo são mostrados 300-700 nm, para a luz branca, bem como cada um dos filtros de interferência 41. Cada espectro filtro de interferência é medido com apenas esse filtro no caminho da luz. 520 t corresponde à área sob o espectro para o filtro com pico a 520 nm, e de 520 corresponde à intensidade de luz branca em pico de comprimento de onda do filtro, a 520 nm. Estes valores são utilizados para calcular os factores de correcção para cada filtro (neste caso a 520 nm), tal como descrito na etapa 2.6 do protocolo. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig4.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> Figura 3:. Descrição do Cardan perímetro do braço utilizado nas experiências O braço Cardan prende o cabo de fibra óptica e permite a rotação esférica completa e regulação angular de modo que a luz pode ser entregue no ângulo apropriado de incidência para a célula a ser gravada. (A) de cima para baixo ponto de vista. (B) Vista do lado em um ângulo. Os números correspondem à mesma parte em todos os painéis. (1) A placa de fundo permite a rotação completa circular no plano horizontal. (2) A chapa vertical permite a rotação circular do braço num plano vertical. (3) Este cilindro contém o braço de metal com o cabo de fibra óptica na extremidade, e que permite que um segundo plano vertical de rotação circular perpendicular a (2). (4) O cabo de fibra óptica é mantida iN lugar na extremidade do braço, e a luz é dirigida para o local da amostra na montagem experimental. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig1.jpg" /> Figura 4:. Componentes da configuração de gravação (A) do tubo de plástico usado para armazenar a amostra. (B) A vista aérea da plataforma sobre a qual a amostra e tubo são montados. (C) Vista lateral da plataforma de bola-e-conjunta com base magnética (1). eléctrodo de referência mantida imóvel com cola e cera no lado da plataforma (2). eletrodo de referência envolvida em torno de jacaré e soldada no lugar, proporcionando uma área de fixação, onde o eletrodo de referência headstage pode cortar (3). (D) Eletrodo ponta sob ampliação de 20x. Barra de escala, 25 um. (E) Palco, suporte do eletrodo e configuração micromanipulador. O andar de entrada (1) é fixada por cima do aparelho com ofio de gravação de prata (2), eo eletrodo de referência com jacaré (3) anexado. O suporte do eléctrodo (4) está fixado a um micromanipulador manual (5) com um poste em baixo que pode ser ajustado com um botão para o movimento vertical ou pode ser empurrado ou puxado para o movimento horizontal do suporte de eléctrodo. A plataforma magnética com a amostra fica no palco (6) logo abaixo o suporte do eléctrodo. (F) A gaiola de Faraday rodeia a configuração de gravação com uma tela que pode ser puxado para cima ou para baixo na frente. A folha de alumínio é colocado debaixo todo o equipamento com almofadas de borracha na parte superior. O cabo de fibra óptica (1) conduz para dentro da gaiola da pista óptica fora, e é dirigido por o braço de Cardan (2) para a fase (3). O aparelho fase de gravação e manipulador é colocado em uma caixa de areia (4) descansando sobre uma mesa de mármore debaixo da configuração. Todos os outros equipamentos repousa na bancada de madeira que não toca a mesa de mármore. A caixa de areia fica em cima da mesa de mármore em um buracocortada da mesa de madeira, de modo que a amostra é completamente vibrationally isolado do equipamento sobre a mesa de madeira. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53829/53829fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig2.jpg" /> Figura 5:. Prep borboleta (A) a borboleta é inserido dentro do tubo e a cabeça, asas, e antenas são imobilizadas com cera quente. O eléctrodo indiferente é inserido o aparelho bucal (1), um pedaço de cera seca é usado para manter para baixo no abdómen (2), e um tecido molhado é colocado atrás do espécime. (B) Close-up da cabeça encerado para baixo. O olho a ser gravado a partir de (1) é mantido limpo de cera ou detritos, eo eletrodo de referência (2) é inserido no aparelho bucal e cera quente é rapidamente derretido sobre ele para mantê-lo no lugar.(C) Um furo cortado dentro do olho, onde a camada de células fotorreceptoras-rosa branca pode ser visto. pigmento preto e hemolinfa amarelo estão ausentes. (D) vista lateral do espécime com um eléctrodo de registo de vidro (1) colocada no olho, e o eléctrodo indiferente (2) ligados à fase de cabeça, que deve completar um circuito, como visto no osciloscópio. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53829/53829fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para visualizar uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig6.jpg" style="font-size: 14px;" /> Figura 6:. Responses-primas a partir de gravações de amostra Cada resposta corresponde a um único flash de luz de 50 mseg de duração (barras pretas). (A) Um exemplo da grande variação de tensão negativa que deve ser vista apenasantes de entrar em uma célula. (B) Uma gravação limpa deve ter pouco ruído de fundo e uma grande resposta despolarizante, tipicamente de pelo menos 40 mV. (C) Um exemplo de uma gravação pobres devido à mudança potencial negativo após o pico principal (setas). (D) Um outro exemplo de uma gravação má. O potencial de repouso está passando por grandes flutuações (barra vermelha) e a grande quantidade de ruído de fundo pode obscurecer a amplitude da resposta (seta). <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig7.jpg" /> Figura 7:. Response-Intensidade Função Log-Linear círculos sólidos mostram as respostas medidas de uma célula 3,5-0 OD, para esta configuração experimental. A intensidade da luz é em uma escala logarítmica. Em muito altas intensidades a resposta é saturado, e em intensidades muito baixas uma pequena resposta persistir em vez de cair para zero ao longo da linha. Tequação ele Naka-Rushton 33 está equipado com esta forma não-linear (linha pontilhada). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig8.jpg" /> Figura 8:. Exemplos de sensibilidade espectral (A) foram registadas respostas Uma única célula representativa e sensibilidade espectral relativa foi calculada. O pico desta célula é a 440 nm, o que significa que responde melhor a luz azul. dados de célula única pode parecer ruidosa (pico a 380 nm). (B) As células com o mesmo pico relativa e forma-se a média em conjunto e as barras de erro padrão são adicionados. Aqui, sete células azuis de sete indivíduos foram em média, fornecendo forte evidência de que um tipo de célula existe nesta espécie maximamente sensíveis à luz a 440 nm. (C) Este processo pode ser repetido para todos os tipos de células encontradas, e representada graficamente em conjunto. Os olhos dos insetos variam muito em suas sensibilidades espectrais, mas um ins típicosect pode ter picos mostrados aqui, a 370 nm, 440 nm e 510 nm. A nota, estas sensibilidades espectrais são todos calculados usando dados reais, mas os picos foram deslocados porque os dados ainda não foi publicado para esta espécie.

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Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

A técnica eletrofisiológica da gravação intracelular é demonstrado e usado para determinar sensibilidades espectrais de células fotorreceptoras único no olho composto de uma borboleta.

Determinação dos fotorreceptores celular Sensibilidade espectral em um inseto modelo de<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações intracelulares

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

11.4K visualizações.  University of California, Irvine.  A técnica eletrofisiológica da gravação intracelular é demonstrado e usado para determinar sensibilidades espectrais de células fotorreceptoras único no olho composto de uma borboleta. 

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic nerve. In vivo recordings of ganglion cell spike trains in several animal models have revealed much of what is known about how the early visual system processes and encodes visual information. However, such recordings have been rare in one of the most common animal models, the rat, possibly owing to difficulty in detecting spikes fired by small diameter axons. The many retinal disease models involving rats motivate a need for characterizing the functional properties of ganglion cells without disturbing the eye, as with intraocular or in vitro recordings. Here, we demonstrate a method for recording ganglion cell spike trains from the optic chiasm of the anesthetized rat. We first show how to fabricate tungsten-in-glass electrodes that can pick up electrical activity from single ganglion cell axons in rat. The electrodes outperform all commercial ones that we have tried. We then illustrate our custom-designed stereotaxic system for in vivo visual neurophysiology experiments and our procedures for animal preparation and reliable and stable electrode placement in the optic chiasm.

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Retinal ganglion cells transmit visual information from the eye to the brain with sequences of action potentials. Here, we demonstrate how to record the action potentials of single ganglion cells in vivo from anesthetized rats.

Única unidade de In vivo Gravações do quiasma óptico de rato

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Caracterização eletrofisiológica de GFP-Expressando populações de células na retina intacta

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Labeling fluorescentes retrógrada Permite alvejado Extracelular Gravação Single-unidade dos neurônios identificados<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Método eletrofisiológico para respostas gravação intracelular de tensão<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores e Interneurônios à luz Estímulos<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Método eletrofisiológico para gravações de tensão de célula inteira de<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor cells in isolated eyestalks using the discontinuous single electrode-switched voltage-clamp configuration. First, with a razor blade we made an opening in the dorsal cornea to get access to the retina. Thereafter, we inserted a glass electrode through the opening, and penetrated a cell as reported by the recording of a negative potential. Membrane potential was clamped at the photoreceptor's resting potential and a light-pulse was applied to activate currents. Finally, the two light-flash protocol was employed to measure current desensitization and recovery. The first light-flash triggers, after a lag period, the transduction ionic current, which after reaching a peak amplitude decays towards a desensitized state; the second flash, applied at varying time intervals, assesses the state of the light-activated conductance. To characterize the light-elicited current, three parameters were measured: 1) latency (the time elapsed between light flash delivery and the moment in which current achieves 10% of its maximum value); 2) peak current; and 3) desensitization time constant (exponential time constant of the current decay phase). All parameters are affected by the first pulse.
To quantify recovery from desensitization, the ratio p2/p1 was employed versus time between pulses. p1 is the peak current evoked by the first light-pulse, and p2 is the peak current evoked by the second pulse. These data were fitted to a sum of exponential functions. Finally, these measurements were carried out as function of circadian time.

A protocol for the study of desensitization and sensitivity recovery of crayfish photoreceptors as a function of circadian time is presented.

Dessensibilização e recuperação de fotorreceptores de lagostins após a entrega de um estímulo leve

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

Métodos Eletrofisiológicos para Medir Níveis de Fotopigment em Fotorreceptores de Drosophila

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

In Vivo Intracellular Recording of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in a Butterfly

Source: McCulloch, K. J., et al.. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53829">Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the procedure for in vivo intracellular recording of photoreceptor cells in the eye of a butterfly and determining the spectral sensitivity of individual cell types. This technique enables the study of sensitivities of individual photoreceptor cells to different light stimuli.

Registro intracelular in vivo da sensibilidade espectral de células fotorreceptoras em uma borboleta

1. Specimen Prep and Recording Procedure

	Prepare the Specimen
	
		Affix an individual butterfly inside a small plastic tube with hot wax so the head is ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Electrophysiological Recording of Voltage Responses of Drosophila Retinal Photoreceptors to Light Stimuli

Source: Juusola, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54142">Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video outlines the protocol for electrophysiological recording of photoreceptor activity in the eye of an immobilized Drosophila, enabling precise measurement of voltage changes in response to light stimuli.

Registro eletrofisiológico das respostas de voltagem de fotorreceptores retinianos de Drosophila a estímulos luminosos

1. Recording from R1-R6 Photoreceptors 

	Always be grounded when operating the microelectrode amplifier (for example by touching the metal surface of the ...

Determinação dos fotorreceptores celular Sensibilidade espectral em um inseto modelo de

Resumo

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