Name: determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings at JoVE.com

우리는 격려를 우리에게 장비를 대출에 대한 카단 팔 둘레, 킴벌리 제이미 슨, 매튜 맥 헨리, 및 라주 Metherate의 제조 후반 루디 림 부르 흐, 감사 및 Almut Kelber와 켄타로 아리카. 이 작품은 ADB에 대한 국립 과학 재단 (NSF) 대학원 연구 KJM에 친목 및 NSF 부여 IOS-1257627에 의해 지원되었다

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

세포 내 기록 때문에 관련된 많은 기술적 인 단계를 마스터하기 어려운 기술이 될 수 있습니다. 성공적인 실험을 위해 몇 가지 중요한 점을 고려해야합니다. 우선, 실험을 수행하는 적절를 진동 절연 테이블을 갖는 것이 중요하다. 많은 연구자들은 완전히 우수한 제진주는베이스로부터 분리 탁상 공기 테이블을 사용한다. 우리의 설치는 미세 조작기 / 전극 홀더 / 표본 스테이지 장치를 배치되는 상단에 샌드 박스와 두꺼운 대리석 테이블을 포함한다. 이 사내 가스 또는 압축 공기에 대한 액세스가 제한 사항입니다 특히, 공기 테이블에 효과적이고 더 저렴한 대안입니다. 추가의 진동 흡수 수단이 수동 에어 서스펜션 또는 테이블 다리 완충 요소의 첨가 등 취할 수있다 (예를 들어, 테니스 공, 자전거 튜브 두꺼운 겔 패드를 열림). 또한, 실험 장치는 내부에 필수적이다모든과 패러데이 케이지가 제대로 접지. 패러데이 케이지는 녹음 할 때 쉽게 케이지 내부에서 작업 할 때 제거하고 교체 할 수있는 앞의 금속 메쉬 스크린을 가져야한다. 주변 전기 노이즈 (주 AC 전원 공급 장치에서 특히 50 Hz의 잡음) 심지어 소량 그렇지 않으면 좋은 기록을 사용할 수 있습니다. ommatidia, 개안을 둘러싼 시료, 체액 및 안료 층을 준비 할 때 성공적인 녹음을 방지 할 수있다. 각막에 구멍이 너무 큰 절단되면, 체내에서 체액 정상적인 펌핑 불안정 기록 결과 절단 부위에서 위아래로 이동하기 액면시킨다. 구멍이 절단되면, 체액 및 표면 색소 층이 바셀린 밀봉에도 뚫을 딱지로 급속 응고되므로, 가능한 한 빨리 눈에 전극을 얻는 것이 중요하다. 링거 용액 대신 바셀린 사용될 수있다. 접지 전극으로 도입 될 수있다구기 또는 절단 안테나의 그루터기로. 또한, 어두운 적응 가능한 동물을 유지하는 것이 도움이된다. 이 방법의 경우, 단계는 패러데이 케이지, 짧은 기간의 자극이 깜박입니다 (30 ~ 50 밀리 초) 및 플래시 (0.5 이상) 사이에 충분히 낮은 주파수를 입력에서 크세논 램프에서 미광을 차단, 매우 어두운 녹음실을 유지하는 것을 포함한다. 시각 색소가 광자를 흡수 할 때, 로돕신에서 발색단은 모든 -3- hydroxyretinal로 11- 시스에서 전환 - 트랜스 옵신 단백질의 구조적 변화를 유도하고, G 단백질을 시작 metarhodopsin로 전체 단지를, 활성화, 레티 날 종속. 높은 강도의 빛이 물리적으로 옵신 단백질에서 분리하는 발색단을 발생 때 사진 표백가 발생합니다. 이 나오며 전에 전극 만 안정적 일정 시간 동안 세포 내에서 응답을 기록하기 때문에 시간이 실험에서 제한 요소이고또는 멤브레인이 손상되었습니다. 이러한 이유로 우리는 세포가 복구 할 수 있도록 휴식하지 않지만, 우리는 우리가 시간이 지남에 따라 세포의 반응을 저하하지 않는 발견 플래시 지속 시간 및 주파수를 사용합니까. 이 사진 표백가 발생했을 경우 빛의 양 빈도와 강도를 감소하는 것이 중요하다. 막 관통 할 때 기록하는 동안, 전극에 의해 큰 전극의 끝 부분이나 큰 운동은 세포에 손상을 줄 수 있습니다. 만 좋은 팁 기록 셀을 접근 할 때 (이상 ~ 100 MΩ)과 작은 움직임이 사용되어야한다. 세포 내 기록이 뇌 레코딩과 같은 다른 애플리케이션에 적용되는 경우, 극히 작은, 튼튼한 전극은 석영 유리를 이용하여 인출 될 수 있지만, 특별한 풀러 이들 전극에 사용되어야한다. 제 프로그램 당기는 전극을 제조 할 때, 우리는, 전극을 메우기 모의 설정에 전극 홀더에 고정하고, 생리 식염수의 선단부와 접지 전극을 배치하여 선단 저항을 조사했다. 엔내선 우리는 오실로스코프의 전압의 변화를 측정하는 전류를 적용했다. 우리는 두 개의 축을 따라 이동하는 수동 미세 조작기를 사용하는 전극의 끝 부분을 이동합니다. 다른 조작기 세 축을 따라 이동 가능하고 이러한이 또는 더 복잡한 응용 프로그램에 사용될 수있는 디지털 것들을 포함하여 존재한다. 기록 단계를 구축하는 방법은 여러 가지가 있으며, 하드웨어와 소프트웨어의 다양한 유형의 기록에 사용 관측 데이터 분석이있다. 우리의 설치는 기록 장비 중 하나, 간단한 쉽고, 저렴한 설치를 나타냅니다. VlogI 곡선을 작성하는데, 함수 나카 및 33 Rushton 등 플롯 응답 비선형 부분들 (34, 35)에 의해 개발 된 계정. 다양한 방법이 데이터 커브를 피팅하는데 사용되며, 다른 방법이 또한 적합하다하더라도, 우리는 곡선 피팅 소프트웨어를 필요로하지 않는 한 이러한 방법의 결과를 플롯 36,37 ( <st룽&gt; 그림 7). 또한 주어진 파장에서 피크의 흡광도 로돕신 모델 스펙트럼 감도를 비교하는 것이 유용 할 수있다. 여러 게시 된 모델은 로돕신의 흡수 스펙트럼 (38, 39)을 재현하는 것을 목표로하고 있습니다. 곤충 시각 세포에서 발현 시각적 안료의 흡수 스펙트럼의보다 정확한 개념은 필터링 안료 계정 ommatidial 특성을 고려하여 모델링 될 수도 있지만, 추가로 생리 학적 해부 11,40 파라미터의 측정을 필요로한다. 방법의 한계는 연구 유기체가 눈에 하나 이상의 유사한 옵신 유전자를 발현하는 경우가 mRNA의 가능성 시각 세포의 어느 스펙트럼 클래스에 대응하는 옵신 확인하는 것이 어려울 수 있다는 것이다. 이러한 문제를 극복하기 위해,이 방법은 염료 주사와 동일계 하이브리드 또는 성공적 opsins를 식별하는 면역 결합 된 기록 셀 (10)을 표현. 우리의 방법은 간단하고 시각적 인 전기 생리학에 익숙하지 않은 연구자 액세스 할 수 있습니다. 이 기술은 신경 과학에서 흔히 있지만, 고유하고 명확한 방법은 재현이 방법은 어렵게, 문헌에 존재하지 않는다. 이 기술의 많은 변형이 존재하지만, 우리는 화합물 눈에 분광 감도를 측정하는 간단한 방법을 제공합니다. 생리 학적 데이터를 시각적 생태학과 진화 (41)의 이야기에서 증거의 중요한 부분입니다. 옵신 서열 변화는 표현형 변화의 유전 적 기초 조사 연구를위한이 방법 이상적, 시각 세포의 감도와 긴밀하게 연결되어 있습니다. 시각 세포의 감도 측정은 색각 42-46에서 중요한 차별 임계 값에 대한 생리 학적 기초를 보여주는 행동 색상 차별 분석와 결합 될 수있다. 예를 들어 초파리의 유전 적 또는 치료 적 조작,이 technique는 눈이나 뇌뿐만 아니라 47, 48의 적절한 생리 기능을 측정하는 좋은 방법이 될 수 있습니다. 우리가 첫 번째 또는 두 눈의 세포 내 기록의 가장 복잡한 방법은 아니지만, 우리의 희망은 우리가 공식적인 신경 과학의 외부 연구 프로그램에서 재생 및 통합을위한 더 쉽게이 방법을 사용할 수 있도록 할 수 있다는 것입니다.

이러한 신경 세포 등의 전기적 특성은 전압 또는 전류의 변화로 세포막을 가로 지르는 이온의 흐름을 측정함으로써 관찰된다. 전기 생리 다양한 기술 세포 생체 이벤트를 측정하기 위해 개발되었다. 동물의 눈에있는 뉴런 액세스 할 수 있습니다 및 회로는 전기 생리 연구를 위해이 세포 좋은 후보를 만들고, 뇌보다 자주 덜 복잡하다. 눈에서 전기 생리학의 일반적인 응용 프로그램은 전위도 (ERG) 1, 2, 미세 세포 내 기록을 포함한다. ERG는 또는 동물의 눈에 전극을 배치하는 광 자극을인가하고, 모든 주변 셀 3-6의 응답의 합과 같은 전압에서의 변화를 측정하는 것을 포함한다. 하나의 개별 시각 세포의 분광 감도 특성에 특별히 관심이 있다면, 종종 여러 종류의 세포를 동시에 주어진 자극에 다른 힘에 반응; 따라서를눈의 스펙트럼과 유사한 시각 세포의 여러 가지 종류가 특히 ERG 데이터에서 특정 세포 유형의 감도를 결정하기 어려울 수있다. 하나의 잠재적 인 해결책은 눈 R1-6 대부분 세포에서 발현 관심 감광체 (옵신) 유전자로 형질 전환 된 초파리 만들고 ERG의 7 수행하는 것이다. 이러한 방법의 잠재적 인 단점은 감광체 단백질 (8)의 저 발현에는, 형질 전환 동물의 생성 및 스크리닝 긴 시간 프레임을 포함하지 않는다. 스펙트럼 별개의 광 수용체의 적은 종류의 눈에 들어, 컬러 필터와 눈의 적응함으로써, ERG 일부 세포 유형의 기여를 낮추는 분광 감도 최대 9의 추정을 허용 도움이 될 수 있습니다. 세포 내 기록 미세 전극 셀 impales 다른 기술되고 자극이인가된다. 전극 레코드는 해당 개인 노멀idual 세포의 반응은 기록 및 다수의 개별 셀을 분석하는 것은 생리 학적으로 서로 다른 세포 유형 10-14의 특정 감도를 얻을 수 있도록. 우리의 프로토콜은 분광 감도의 분석에 초점을 맞추고 있지만, 날카로운 전극 기록 세포의 기본 원칙은 다른 응용 프로그램에 대한 수정이다. 예를 들어, 시료의 다른 제제를 사용하여 날카로운 석영 전극을 이용하는 경우, 하나의 요구되는 문제에 따라서, 뇌 광섬유 로브 또는 다른 지역의 깊이에서 기록 할 수있다. 예를 들어, 각각의 감광 셀 (15)의 응답 시간은 광 세포 활성은 19과 같은 유사한 기술로 기록 될 수 있고, 또는 컬러 자극 편광 20로 대체 될 수있다 (16) (얇은, 골수 또는 lobula 17), 머리 (18) 또는 다른 신경 로브 -22 또는 운동은 23, 24을 자극. Phototransduction, 프로세스의 광에 의해에너지를 흡수하고 전기 신호로 변환, 거의 모든 오늘날 동물 문 (phyla) (25)에 공통 고대 특징이다. 광 수용체 세포에서 발견 비주얼 phototransduction을 시작 책임이 시각 색소는 로돕신입니다. 모든 동물 Rhodopsins 망막 또는 유사한 분자 (26, 27)에서 파생 옵신 단백질 7 트랜스 G 단백질 결합 수용체 부류의 구성원과 연관된 발색단으로 구성된다. 아미노산 서열 및 발색 구조 옵신 광의 상이한 파장에 로돕신의 흡수에 영향을 미친다. 광자 발색단에 의해 흡수되면 로돕신은 궁극적으로 막 결합 이온 채널 (28)의 개구부를 리드 셀 G 단백질 캐스케이드를 개시 활성화된다. 대부분의 신경 세포와는 달리, 감광 셀은 빛 자극 변화에 응답하여 진폭 상대적인 변화로 측정 할 수있다 그레이드 전위 변화를 겪는다. 일반적으로 주어진감광체 종류 하나만 옵신 유전자 발현 (예외 8,10,29-31 존재하지만). 정교한 색각는 다양한 척추 동물 및 절지 동물에서 발견되는 종류의 각각은 하나 이상의 때때로 로돕신 유형을 나타내는 시각 세포 수백 또는 수천의 복소 눈으로 달성된다. 시각 정보는 컬러 및 모션 완전한 화상의 인식 결과 눈과 뇌 신경 신호 전달 복합체 하류를 통해 감광 모자이크 통해 응답을 비교함으로써 캡처된다. 세포 내 기록 통한 광의 상이한 파장에 대한 시각 세포의 원료 응답을 측정 한 결과, 분광 감도를 계산할 수있다. 이 계산은 시각 세포의 반응이 아니라 그것이 흡수 된 광자 (32)의 특정 특성에,이 흡수 된 광자의 수에 의존한다고 Univariance의 원리에 기초한다. abso 어떤 광자응답의 동일한 종류를 유도 할 것이다 로돕신 의해 rbed. 실제로, 이것은 셀의 원료 응답 진폭 (로돕신 높은 확률 그 파장을 흡수) (흡수 이상의 광자)의 광 강도의 증가 중 인해 증가 또는 피크 감도 향해 파장 시프트에 것을 의미한다. 우리는 알려진 강도와 다른 파장에서 반응 동일한 파장과 같은 강도하지만 알 수없는 상대 감도 세포 반응을 관련이 원리를 사용합니다. 세포 유형은 종종 파장에서 자신의 감도 피크로 식별됩니다. 여기에서 우리는 넓은 연구 커뮤니티에이 방법이 더 접근하기를 중심으로, 세포 내 기록과 나비의 눈에서 광 수용체의 분광 감도의 분석을위한 하나의 방법을 보여줍니다. 세포 내 기록 특히 곤충 색맹에 대하여, 문헌에 공통 남아 있지만, 우리는 그쪽 발견대상 및 방법의 t 설명은 일반적으로 기술의 재생을 허용하기에 너무 짧은 있습니다. 우리는 쉽게 복제를 허용의 목적으로 비디오 형식에서이 방법을 제시한다. 우리는 또한 쉽게 얻을 수 저렴한 장비를 사용하는 방법을 설명합니다. 우리는 새롭고 복잡한 기술을 최적화 할 때 연구를 느리게 자주보고되지 않습니다 일반적인주의 사항을 해결합니다.

<table><tbody><tr><td>Butterfly pupae</td><td></td><td></td><td>Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits</td></tr><tr><td>Large plastic cylinder</td><td></td><td></td><td>Any chamber that remains humidified will work</td></tr><tr><td>Insect pins, size 2</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>100% Desert Mesquite Honey</td><td>Trader Joe&#039;s</td><td></td><td>Any honey or sucrose solution will work</td></tr><tr><td>Xenon Arc Lamp</td><td>Oriel Instruments</td><td>66003</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Universal Power Supply</td><td>Oriel Instruments</td><td>68805</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Optical Track</td><td>Oriel Instruments</td><td>11190</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Large (2x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11641</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Small (4x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10</td><td>Newport Corporation</td><td>TA-8Q20-10</td><td></td></tr><tr><td>Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 &amp;amp; 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr><tr><td>No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>Fixed lens mount, 50.8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>Fixed lens mount, 25.4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td>Condenser lens assembly</td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>Convex silica lens, 50.8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>Six Position Filter Wheel, x2</td><td>Newport Corporation</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>Filter Wheel Mount Hub</td><td>Newport Corporation</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>Concave silica lens, 25.4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPC034</td><td></td></tr><tr><td>Collimator holder</td><td>Newport Corporation</td><td>77612</td><td></td></tr><tr><td>Collimating beam probe</td><td>Newport Corporation</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>600 &amp;mu;m diameter UV-vis fiber obtic cable</td><td>Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Shutter with drive unit</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND10</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Cal lamp</td><td>Ocean Optics</td><td>LS-1-Cal</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite Software</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 300 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 310 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 320 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 330 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 340 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 350 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 360 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67760</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 370 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 380 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 390 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 400 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 410 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 420 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 430 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 440 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 450 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 460 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 470 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 480 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 492 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 500 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 510 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 520 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 532 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65640</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 540 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 550 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 560 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 570 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 580 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65646</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 589 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65647</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 600 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65648</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 610 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65649</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 620 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65650</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 632 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65651</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 640 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65653</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 650 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65655</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 660 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67769</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 671 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65657</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 680 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67770</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 690 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65659</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 700 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67771</td><td></td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td></td><td></td><td>Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>Wild M5</td><td>Any Stereomicroscope will do</td></tr><tr><td>Microscope stand with swinging arm and heavy base</td><td>McBain Instruments</td><td></td><td>Any heavy base with arm will do</td></tr><tr><td>Cardan arm</td><td></td><td></td><td>Custom built, See &lt;strong&gt;Figure 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Fiber-lite high intensity illuminator</td><td>Dolan-Jenner</td><td>MI-150</td><td>For lighting specimen</td></tr><tr><td>Fiber-lite goose-neck light guide</td><td>Dolan-Jenner</td><td>EEG 2823</td><td>Any goose-neck light guide will do</td></tr><tr><td>Marble table</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Raised wooden table</td><td></td><td></td><td>Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath</td></tr><tr><td>Wooden box filled with sand</td><td></td><td></td><td>custom built, any box with sand</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Carl Zeiss - Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Specimen stage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alligator clip wires for grounding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulated copper wire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver wire, 0.125 mm diameter</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW0510</td><td></td></tr><tr><td>BNC cables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preamplifier with headstage</td><td>Dagan Corporation</td><td>IX2-700</td><td></td></tr><tr><td>Humbug Noise reducer</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe</td><td>EZ Digital</td><td>os-5030</td><td></td></tr><tr><td>BNC T-adapter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powerlab hardware 2/20</td><td>ADI instruments</td><td>ML820</td><td></td></tr><tr><td>Labchart software</td><td>ADI instruments</td><td>Chart 5</td><td></td></tr><tr><td>10 MHz Pulse Generator</td><td>BK Precision</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Borosillicate glass capillaries with filament</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, 3 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slotted plastic tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low melting temperature wax</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soldering Iron</td><td>Weller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platform with ball-and-socket magnetic base</td><td>Hama photo and video</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double edge carbon steel, breakable razor blade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings

세포 내 기록 단일 셀은 주어진 자극에 응답 할 수 있는지 결정하는데 사용될 수있는 강력한 기술이다. 비전 연구에서는 세포 내 기록은 역사적으로 오늘날 사용되는 다른 빛의 자극에 각각의 광 수용체 세포의 민감도를 연구하는 데 사용되는 일반적인 기술하고있다. 그러나, 눈에 세포 내 기록 실험을 복제하고자하는 연구자의 문헌에서 상세한 방법론의 부족이 남아있다. 여기에 우리가 더 일반적으로 눈의 생리를 조사하기위한 모델로 곤충을 제시한다. 곤충 시각 세포는 눈의 표면 근처에 위치하기 때문에 달성하기 용이 한 시각에 관련기구의 대부분은 동물 phyla의 걸쳐 보존되어있다. 우리는 전자에 약간의 사전 경험이있는 연구자들에게이 기술을 더 접근 할 수 있도록 목표로, 나비의 눈에서 광 수용체 세포의 생체 내 세포 내 녹음을위한 기본 절차를 설명lectrophysiology. 우리는 단일 셀에 유리 미세하고, 마지막으로 기록 절차 자체를 삽입하는 방법, 녹화 라이브 나비을 제조하는 방법에 필요한 기본 장비를 소개한다. 또한 각각의 세포 종류의 분광 감도를 판정하기위한 원료 응답 데이터의 기본 분석을 설명한다. 우리 프로토콜 분광 감도를 결정하는 단계에 중점을두고 있지만, 다른 자극 (예를 들면, 편광) 및 상기 방법의 변형이 설정에 적용될 수있다.

녹화 설정의 많은 요소를 들어, 서면 설명은 충분한 정보를 제공하지 않는다.도 1은 완전한 녹화 설정에 관련된 구성 요소의 도면이다. 도 2에서, 스펙트럼 보정 팩터가 필요한 이유를 이해하고 이것이 정정을 계산하기 위해 필요하다 수득 백색광 각 간섭 필터 그려진다. 3 사진 및 이들에 사용되는 카아 아암의 다이어그램을 나타낸다 실험.도 4는 기록 ​​단계 및 미세 조작기를 나타내는 합성 화상이다.도 5는 실험 나비 제제의 여러 단계를 도시한다. 기록이 시작되면, 플래시 광에 응답하여 음의 전압 변화는 전극이도 6a에서와 같이 셀의 외부에 있다는 것을 의미한다. 반응의 강도가 전극 근방에 따​​라시각 세포 및 플래시 광의 입사 각도로 기울어. 응답은 커야한다 (&gt; 30 MV) 끝이 푹 찌르다하는 셀에 충분히 가까이 전에. 6B 그림은 시각 세포로 항목을 상징하는 빛 자극에 대한 명확한 탈분극 응답을 보여줍니다. 절대 진폭이 상당히 달라질 수 있지만, (적어도 40 MV) 휴지 전위는 안정적이어야하며 응답 진폭 커야한다. 우리는 상대 응답을 측정하므로이 신호 대 잡음비가 높은 것이 더 중요하다. 전위 변화를 크게 쉬고 경우 응답 파형을 보이는 비정상적 또는 최대 응답은 모든 간섭 필터가 불가능해진다 걸쳐 다음 대하여 응답을 비교 너무 낮다. 불가능한 기록의 예는도 6C, 6D에 나타내었다. 레코딩 완료 후, ND 응답 플롯되어야하며 나카 Rushton 식은 데이터 (33)에 장착해야이야hown 그림 7.이 수치는 간섭 필터없이 ND 필터 시리즈를 사용하여 그려집니다. 기록이 안정적이면 ND 필터 일련의 데이터는 이전과 이후의 실험과 유사해야한다. 프로토콜의 제 6의 계산에 설명 된 바와 같이 분광 감도는 주어진 파장에서 각 응답 (V)에 대한 (I)에 대한 해결 한 다음,도 7에 VlogI 플롯에 나카 Rushton 방정식 피팅에 의해 결정된다. 하나의 기록에서 파생 된 분광 감도의 대표적인 예는 (이 예제를 참고하시기 바랍니다 실제 계산 된 데이터를 보여 주지만,이 결과가 게시되지 않은 그대로 피크가 이동 된)도 8a에 도시된다. 세포 유형은 동일한 파장에서 최고 민감도 및 민감도 스펙트럼의 전체적인 형상으로 분류 될 수있다. 유사 세포 유형은 평균화되어 평균 감도 Figu의 각 파장에서의 표준 오차 막대 플롯도 8b를 다시. 곤충에서 발견되는 세 가지 일반적인 유형의 세포의 분광 감도가도 8c에 도시되어있다 (크기 및 오차 막대는 실제 데이터를 사용하여 계산되지만, 피크 시프트된다). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig3.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> 그림 1 :. 빛의 경로 기록 구성 요소의 도식은 설치 표본 및 하드웨어를 기록하는 표시됩니다. 광학 트랙은 패러데이 케이지 외부 나무 벤치에 앉아있다. 크세논 (Xe), 크세논 아크 램프, CD, 콘덴서 조립, LX, 볼록 렌즈, ND, 감광 필터 휠, Cf를, 간섭 필터, S, 셔터, LC, 오목 렌즈, 공동 , 평행 광 프로브 FO, 광섬유 케이블. 패러데이 케이지에 앉아시편 주위에 나무 벤치. 나무 벤치 위에 앉아하지만 아래를 진동 격리 된 대리석 테이블을 터치하지 않습니다. (RC)를 기록 및 기준 (RF) 전극 headstage (HS)에 부착된다. Rc를는 눈 (E)로 도입되고, Rf는 신체의 다른 부분 내로 도입된다. headstage는 패러데이 케이지 외부 전치 증폭기 (PA)의 설치 부분이다. 신호 협잡 노이즈 리듀서 (HB)를 통해 전치 증폭기에서 전달하고, 오실로스코프 (OS)로된다. 오실로스코프에서 신호는 PowerLab의 하드웨어 (PLB)를 통해이 Labchart 소프트웨어에 의해 판독 된 노트북 컴퓨터 (CPU)에 전달된다. 셔터는 오실로스코프의 제 2 채널 통과 함수 발생기 (FG)에 의해 제어되고,이 신호뿐만 아니라 기록하는 경우는 또한 하드웨어 PowerLab의 제 2 채널을 통해 전달 될 ​​수있다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig5.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> 그림 2 :. 화이트 라이트와 간섭 필터 스펙트럼 교정 인자를 계산하는 데 사용되는 프로토콜의 단계 2.5에서 측정 된 스펙트럼은 백색광뿐만 아니라 각각의 41 간섭 필터를 들어, 300에서 700 나노 미터로 표시됩니다. 각각의 간섭 필터 스펙트럼 광로 만 필터로 측정된다. T (520)는 520 nm의 피크를 가진 스펙트럼 필터 하부의 영역에 대응하고, S (520)는 필터, 520 nm의 피크 파장 백색광의 강도에 대응한다. 이러한 값은 프로토콜의 단계 2.6에 기재된 바와 같이 (이 경우에 520 nm의) 각 필터에 대한 보정 계수를 계산하는 데 사용된다. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-페이지 = &quot;1&quot;&gt; <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig4.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> 도 3. 실험에 사용 카아 팔 둘레 설명 카아 아암 광섬유 케이블 보유 완전한 구형 회전 광이 기록되는 셀에 입사 적절한 각도로 전달 될 ​​수 있도록 각도 조정을 허용한다. (A) 하향식보기. 각도 측으로부터 (B) 볼. 숫자는 모든 패널에서 같은 부분에 해당합니다. (1) 바닥 판의 수평면 내의 모든 원형 회전을 허용한다. (2) 수직 플레이트 수직면 아암의 전체 순환 회전을 허용한다. (3)이 실린더 단부에 광섬유 케이블 금속 지지대를 보유하고, (2)에 수직 인 원형 회전 2 수직 평면을 허용한다. (4) 광섬유 케이블이 유지되고 난n 개의 아암의 단부에 배치하고 빛이 실험 장치에서의 시료의 위치에 관한 것이다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig1.jpg" /> 그림 4 :. 녹화 설정의 구성 요소 (A) 플라스틱 튜브는 시료를 보관하는 데 사용. (B) 시편과 튜브가 장착 된 플랫폼의 오버 헤드보기. 자기베이스 (1)와 볼과 관절 플랫폼 (C) 측면보기. 기준 전극은 플랫폼 (2)의 측면에 접착제 및 왁스 움직이지 유지했다. 기준 전극 악어 클립 감싸 및 headstage 기준 전극은 클립 수 첨부 영역 (3)을 제공하는 위치에 결합. 20X 배율 아래 (D) 전극 팁. 스케일 바, 25 μm의. (E) 단계, 전극 홀더 및 미세 조작기의 설치. headstage (1)와 상기 고정 장치기록은 와이어 (2) 악어 클립과 기준 전극 (3) 첨부. 전극 홀더 (4)가 수동으로 고정 미세 조작기 (5) 아래에서 포스트가 수직 이동을위한 노브로 조절 될 수 있거나 또는 가압 전극 홀더의 수평 운동으로 당겨질 수있다. 시료와 자기 플랫폼은 전극 홀더 아래 단계 (6)에 앉아있다. (F)는 패러데이 케이지 아래 앞까지 당겨 지거나 할 수있는 화면 녹화 설정을 둘러싸고 있습니다. 알루미늄 호일 위에 고무 패드로 모든 장비 아래에 배치됩니다. 광섬유 케이블 (1)은 외부 광 트랙 케이지 리드 및 스테이지 (3)를 향해 카아 아암 (2)에 의해 지시된다. 기록 무대와 조작 장치는 설정 아래에 대리석 테이블에 쉬고 모래 상자 (4)에 배치됩니다. 다른 모든 장비는 대리석 테이블에 닿지 않도록 나무 벤치 위에 달려있다. 모래 상자 구멍에 대리석 테이블 위에 앉아시편이 완전히 진동 적 나무 탁상에 장비에서 분리되도록, 나무 테이블에서 잘라. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53829/53829fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig2.jpg" /> 그림 5 :. 나비 준비 (A) 나비 관과 머리, 날개에 삽입되고, 안테나 뜨거운 왁스로 고정된다. 무관심 전극 (1) 건조 왁스 편이 복부 (2) 웨트 티슈 시편 뒤에 배치를 보유하는 데 사용되는 입 부분에 삽입된다. (B) 머리의 근접 아래로 왁스 칠. 눈은 (1) 왁스 또는 파편으로부터 명백 유지에서 기록되어야하고, 상기 기준 전극 (2)의 입 부분에 삽입되어 제자리에 유지 위에 핫 왁스가 신속히 용융된다.(C) 핑크 화이트 시각 세포 층을 볼 수있는 눈으로 절단 구멍. 검은 색 안료과 노란색 체액은 존재하지 않는다. (D) 눈에 배치 유리 기록 전극 (1) 무관심 전극과 시편의 측면보기 (2) 오실로스코프에 표시되는 회로를 완료해야합니다 머리 스테이지에 부착. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53829/53829fig2large.jpg" target="_blank">보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 더 큰 버전.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig6.jpg" style="font-size: 14px;" /> 그림 6 :. 샘플 녹음에서 원시 응답 각 응답은 50 밀리 초 시간 (검은 막대)의 단일 빛 플래시에 해당합니다. (A) 막보아야 큰 음의 전압 변화의 일례셀에 들어가기 전에. (B) 깨끗한 기록은 일반적으로 적어도 40 MV를 약간의 배경 소음과 큰 탈분극 응답을 가져야한다. 인해 주 피크 (화살촉) 후에 음의 전위 변화 (C) 불량한 기록 예. (D) 나쁜 기록의 또 다른 예. 휴지 전위 변동이 큰 (빨간색 막대)과 응답 (화살촉)의 진폭을 가릴 수있는 배경 잡음의 다량 겪고있다. <img alt="그림 7" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig7.jpg" /> 그림 7 :. 응답-강도 로그 - 선형 기능 솔리드 원은이 실험적인 설정에, 0 OD 3.5에서 셀의 측정 된 응답을 보여줍니다. 빛의 강도는 로그 스케일에 있습니다. 매우 높은 농도에서 반응은 포화되고, 매우 낮은 강도에서 작은 응답 대신 제로 라인을 따라 낙하 지속. 티그는 나카 Rushton 식 (33)이 비선형 형상 (점선)에 설치된다. <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig8.jpg" /> 도 8. 분광 감도 예 (A) 하나의 대표적인 셀의 응답을 기록하고, 상대 분광 감도를 계산 하였다. 이 세포의 피크는 푸른 빛에 최선가 응답 의미, 440 nm에서입니다. 단일 셀 데이터는 시끄러운 (380 nm에서 피크)를 보일 수 있습니다. 동일한 상대 피크 모양 (B) 세포를 함께 평균을 표준 오차 막대가 추가됩니다. 여기에, 일곱 개인의 일곱 파란색 셀은 셀 타입은 440 nm에서 빛을 최대로 구분이 종에서 존재한다는 강력한 증거를 제공하는 평균되었다. (C) 본 공정은 발견 된 모든 세포 타입에 대해 반복하고 같이 나타내 어질 수있다. 곤충 눈들은 분광 감도 그러나 일반적인 기능에 다양요법은 370 nm의, 440 nm의, 510 nm에서, 여기에 표시된 피크를 가질 수있다. 이들 분광 감도는 모두 데이터를 사용하여 계산되지만, 데이터가 아직 종 번역되지 않기 때문에 피크가 시프트되어, 주.

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Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

세포 내 기록의 전기 생리 기술 시연과 나비의 화합물 눈에 하나의 광 수용체 세포의 스펙트럼 감도를 결정하는 데 사용됩니다.

에서 곤충 모델에서 시각 세포 스펙트럼 감도의 결정<em&gt; 생체</em&gt; 세포 내 녹음

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

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Universidad San Sebastian

Research

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Neuroscience

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

11.4K 조회수.  University of California, Irvine.  세포 내 기록의 전기 생리 기술 시연과 나비의 화합물 눈에 하나의 광 수용체 세포의 스펙트럼 감도를 결정하는 데 사용됩니다. 

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

배아 척수에서 뉴런의 Commissural 해부와 문화

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

연구

신경과학

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic nerve. In vivo recordings of ganglion cell spike trains in several animal models have revealed much of what is known about how the early visual system processes and encodes visual information. However, such recordings have been rare in one of the most common animal models, the rat, possibly owing to difficulty in detecting spikes fired by small diameter axons. The many retinal disease models involving rats motivate a need for characterizing the functional properties of ganglion cells without disturbing the eye, as with intraocular or in vitro recordings. Here, we demonstrate a method for recording ganglion cell spike trains from the optic chiasm of the anesthetized rat. We first show how to fabricate tungsten-in-glass electrodes that can pick up electrical activity from single ganglion cell axons in rat. The electrodes outperform all commercial ones that we have tried. We then illustrate our custom-designed stereotaxic system for in vivo visual neurophysiology experiments and our procedures for animal preparation and reliable and stable electrode placement in the optic chiasm.

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Retinal ganglion cells transmit visual information from the eye to the brain with sequences of action potentials. Here, we demonstrate how to record the action potentials of single ganglion cells in vivo from anesthetized rats.

단일 유닛 생체내에서</em암흑의 광학 Chiasm에서> 레코딩

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

손상 망막의 특성 Electrophysiological GFP - 표현 세포 집단

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

의 기록 세포 내 전압 응답에 대한 전기 생리 방법<em&gt; 초파리</em&gt; 빛 자극에 광수와의 interneurons<em&gt; 생체</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

전 세포 전압 클램프 기록을위한 전기 생리 학적 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 광 수용체

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor cells in isolated eyestalks using the discontinuous single electrode-switched voltage-clamp configuration. First, with a razor blade we made an opening in the dorsal cornea to get access to the retina. Thereafter, we inserted a glass electrode through the opening, and penetrated a cell as reported by the recording of a negative potential. Membrane potential was clamped at the photoreceptor's resting potential and a light-pulse was applied to activate currents. Finally, the two light-flash protocol was employed to measure current desensitization and recovery. The first light-flash triggers, after a lag period, the transduction ionic current, which after reaching a peak amplitude decays towards a desensitized state; the second flash, applied at varying time intervals, assesses the state of the light-activated conductance. To characterize the light-elicited current, three parameters were measured: 1) latency (the time elapsed between light flash delivery and the moment in which current achieves 10% of its maximum value); 2) peak current; and 3) desensitization time constant (exponential time constant of the current decay phase). All parameters are affected by the first pulse.
To quantify recovery from desensitization, the ratio p2/p1 was employed versus time between pulses. p1 is the peak current evoked by the first light-pulse, and p2 is the peak current evoked by the second pulse. These data were fitted to a sum of exponential functions. Finally, these measurements were carried out as function of circadian time.

A protocol for the study of desensitization and sensitivity recovery of crayfish photoreceptors as a function of circadian time is presented.

빛 자극전달 시 가재 광수용체 의 둔감화 및 회수

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

초파리 광수용체에서 광안료 수준을 측정하기 위한 전기생리학적 방법

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

In Vivo Intracellular Recording of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in a Butterfly

Source: McCulloch, K. J., et al.. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53829">Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the procedure for in vivo intracellular recording of photoreceptor cells in the eye of a butterfly and determining the spectral sensitivity of individual cell types. This technique enables the study of sensitivities of individual photoreceptor cells to different light stimuli.

나비의 광수용체 세포 스펙트럼 감도의 생체 내 세포 내 기록

1. Specimen Prep and Recording Procedure

	Prepare the Specimen
	
		Affix an individual butterfly inside a small plastic tube with hot wax so the head is ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Electrophysiological Recording of Voltage Responses of Drosophila Retinal Photoreceptors to Light Stimuli

Source: Juusola, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54142">Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video outlines the protocol for electrophysiological recording of photoreceptor activity in the eye of an immobilized Drosophila, enabling precise measurement of voltage changes in response to light stimuli.

빛 자극에 대한 초파리 망막 광수용체의 전압 반응에 대한 전기생리학적 기록

1. Recording from R1-R6 Photoreceptors 

	Always be grounded when operating the microelectrode amplifier (for example by touching the metal surface of the ...

에서 곤충 모델에서 시각 세포 스펙트럼 감도의 결정

요약

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