Name: determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings at JoVE.com

Ringraziamo il ritardo Rudy Limburgo per fabbricare le perimetro del braccio cardanici, Kimberly Jamison, Matthew McHenry, e Raju Metherate per averci prestato attrezzature, e Almut Kelber e Kentaro Arikawa, per incoraggiamento. Questo lavoro è stato sostenuto da una National Science Foundation (NSF) Graduate Research Fellowship per KJM e Grant NSF IOS-1.257.627 a ADB

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

registrazione intracellulare può essere una tecnica difficile da padroneggiare a causa dei molti passaggi tecnici coinvolti. Per gli esperimenti di successo devono essere considerati diversi punti importanti. In primo luogo, è importante avere una tabella correttamente vibrazionalmente-isolato su cui viene eseguita l&#39;esperimento. Molti ricercatori utilizzano le tabelle d&#39;aria, che separano completamente il tavolo dalla base, dando isolamento dalle vibrazioni superiori. La nostra messa a punto prevede un tavolo di marmo di spessore con una sandbox in cima, in cui è collocato l&#39;apparecchio fase micromanipolatore / portaelettrodo / campione. Si tratta di un efficace e più conveniente alternativa ad un tavolo d&#39;aria, soprattutto se l&#39;accesso al gas in-house o aria compressa è una limitazione. Possono essere adottate misure addizionali di assorbimento delle vibrazioni come sospensioni pneumatiche passiva, o l&#39;aggiunta di elementi ammortizzanti per le gambe del tavolo (ad esempio, apertura palle da tennis, tubi bicicletta, pastiglie gel denso). Inoltre, è essenziale che l&#39;apparato sperimentale sia all&#39;interno di ungabbia di Faraday con tutto correttamente a terra. La gabbia di Faraday dovrebbe avere uno schermo rete metallica nella parte anteriore che può essere rimosso quando si lavora all&#39;interno della gabbia e sostituita facilmente quando la registrazione. Anche una piccola quantità di rumore elettrico ambientali (in particolare a 50 Hz rumore dalla rete principale di alimentazione AC) può fare una buona registrazione altrimenti inutilizzabili. Durante la preparazione del campione, emolinfa e pigmenti strati che circondano la ommatidi può impedire le registrazioni di successo. Se il foro nella cornea viene tagliata troppo grande, normale pompaggio emolinfa nel corpo provoca la superficie del liquido per muoversi su e giù nel sito taglio, causando una registrazione instabile. Una volta che il foro è tagliato, emolinfa e di superficie strati di pigmento si coagulare rapidamente in uno crosta impenetrabile anche quando sigillato con vaselina, quindi è importante per ottenere l&#39;elettrodo nell&#39;occhio appena possibile. soluzione di Ringer può essere usato al posto di vasellina. L&#39;elettrodo di massa può essere introdotto nellaapparato boccale o nel tronco di un antenna taglio. Inoltre, è spesso utile mantenere l&#39;animale come dark-adattato possibile. Per questo metodo, passi includono mantenere sala di registrazione molto scuro, bloccando la luce diffusa dalla lampada Xenon penetri nella gabbia di Faraday, lampeggia stimolo di breve durata (30-50 msec), e un abbastanza bassa frequenza tra i lampi (0,5 o superiore). Quando un pigmento visivo assorbe un fotone, il cromoforo in rodopsina commuta da 11- cis -3-hydroxyretinal a tutto - trans -retinal, inducendo il cambiamento conformazionale della proteina opsin, e attivando l&#39;intero complesso come metarhodopsin, che avvia la proteina G cascata. Photo-sbiancamento si verifica quando l&#39;alta intensità luminosa fa sì che il cromoforo per separare fisicamente dalla proteina opsin. Il tempo è un fattore limitante in questo esperimento perché l&#39;elettrodo sarà solo stabilmente registrare le risposte dall&#39;interno della cella per un certo periodo di tempo prima che cada fuorio la membrana è danneggiata. Per questo motivo noi non rompiamo per consentire alla cellula di recuperare, ma lo facciamo usare una durata del flash e la frequenza che abbiamo trovato non degrada la risposta della cellula nel corso del tempo. È importante ridurre sia la frequenza e l&#39;intensità della luce in caso fotometabolismo. Durante la registrazione, un grande elettrodo o grande movimento dall&#39;elettrodo possono danneggiare la cella quando penetrano la membrana. Solo punte sottili (almeno ~ 100 MW) e piccoli movimenti devono essere utilizzate quando si avvicina una cella per la registrazione. Se la registrazione intracellulare viene applicata ad altre applicazioni, come le registrazioni cerebrali, estremamente fini, elettrodi robuste possono essere estratti utilizzando vetro di quarzo, ma un estrattore specializzata devono essere utilizzati per questi elettrodi. La prima volta facendo un elettrodo programma di tirare, abbiamo controllato la resistenza punta dal riempimento dell&#39;elettrodo, fissandolo al titolare elettrodo in una configurazione finto, e mettendo la punta e elettrodo di massa in soluzione salina. Next abbiamo applicato una corrente per misurare la variazione di tensione sull&#39;oscilloscopio. Per spostare l&#39;elettrodo usiamo un micromanipolatore manuale che si muove lungo due assi. Esistono altri manipolatori compresi quelli digitali che permettono il movimento lungo i tre assi e questi possono essere utilizzati per questo o più complesse applicazioni. Ci sono molti modi per costruire uno stadio per la registrazione, e ci sono molti diversi tipi di hardware e software utilizzati nella registrazione e analisi dei dati osservati. La nostra messa a punto rappresenta una configurazione semplice, facile e conveniente della piattaforma di registrazione. Nel costruire la curva VlogI, funzioni sviluppate da Naka e Rushton 33 e altri 34,35 di conto per le porzioni non lineari delle risposte tracciati. Vari metodi sono utilizzati per adattare questa curva ai dati, e tracciati i risultati di un tale metodo che non richiede software curva-montaggio, anche se altri metodi sono adatti anche 36,37 ( <strong&gt; Figura 7). Può anche essere utile confrontare sensibilità spettrale a modelli di rodopsina assorbanza a una data lunghezza d&#39;onda di picco. Diversi modelli pubblicati scopo di riprodurre rodopsina assorbanza spettri 38,39. Un&#39;idea più precisa dello spettro assorbanza del pigmento visivo espressa in una cellula fotorecettore insetto può essere modellato tenendo conto delle proprietà ommatidial come pigmenti di filtro, ma questo richiede la misurazione di fisiologica supplementare e parametri anatomici 11,40. Una limitazione del metodo è che se l&#39;organismo studio esprime più opsin geneticamente simili nell&#39;occhio, può essere difficile identificare quale opsin mRNA probabilmente corrisponde a quale classe spettrale di fotorecettori. Per superare questo problema, questo metodo è stato combinato con colorante-iniezioni e ibridazione in situ o immunoistochimica per identificare correttamente le opsins espresso in cellule registrate 10. Il nostro metodo è semplice e accessibile per i ricercatori non hanno familiarità con elettrofisiologia visivo. Questa tecnica è comune in neuroscienze, ma specifiche e metodi chiari sono assenti in letteratura, rendendo questo metodo difficile da riprodurre. Sebbene esistano molte varianti di questa tecnica, offriamo un modo semplice per misurare la sensibilità spettrale nell&#39;occhio composto. Il dato fisiologico è un pezzo importante delle prove in storie di ecologia visiva ed evoluzione 41. variazione di sequenza opsina è strettamente collegato con la sensibilità di una cellula fotorecettore, rendendo questo metodo ideale per gli studi che esaminano la base genetica per il cambiamento fenotipico. Misura della sensibilità delle cellule fotorecettori può anche essere accoppiato con saggi di discriminazione colore comportamentali, che mostra la base fisiologica per importanti soglie di discriminazione nella visione dei colori 42-46. In manipolazioni genetiche o terapeutici in Drosophila per esempio, questo tecnica può essere un buon modo per misurare la corretta funzione fisiologica dell&#39;occhio o del cervello e 47,48. Anche se il nostro non è il primo o il metodo più complesso di registrazione intracellulare negli occhi, la nostra speranza è che possiamo rendere questo metodo più facilmente disponibile per la riproduzione e l&#39;integrazione nei programmi di ricerca al di fuori delle neuroscienze formale.

Le proprietà elettriche delle cellule come i neuroni si osservano misurando il flusso di ioni attraverso le membrane cellulari come un cambiamento di tensione o corrente. Una varietà di tecniche elettrofisiologiche sono state sviluppate per misurare eventi bioelettrici nelle cellule. I neuroni trovati nelle occhi degli animali sono accessibili e loro circuiti è spesso meno complesso nel cervello, rendendo queste cellule buoni candidati per lo studio elettrofisiologico. Le applicazioni più comuni di elettrofisiologia negli occhi includono elettroretinografia (ERG) 1,2 e microelettrodi registrazione intracellulare. ERG prevede il posizionamento di un elettrodo o sull&#39;occhio di un animale, applicando un stimolo luminoso, e misurando la variazione di tensione come somma delle risposte di tutte le celle vicine 3-6. Se uno è specificamente interessati a caratterizzare sensibilità spettrali dei fotorecettori singoli, spesso contemporaneamente più tipi di cellule rispondono a diversi punti di forza per un dato stimolo; cosìpuò essere difficile determinare la sensibilità di specifici tipi cellulari a partire da dati ERG soprattutto se ci sono diversi tipi di fotorecettori spettralmente-simili negli occhi. Una possibile soluzione è quella di creare transgenici Drosophila con il fotorecettore (opsina) gene di interesse espressa nelle cellule di maggioranza R1-6 negli occhi e quindi eseguire ERGs 7. I potenziali svantaggi di questo metodo includono non a bassa espressione della proteina fotorecettore 8, e il periodo di tempo lungo per la generazione e lo screening di animali transgenici. Per gli occhi con un minor numero di tipi di fotorecettori spettralmente distinti, l&#39;adattamento dell&#39;occhio con filtri colorati può aiutare con la riduzione del contributo di alcuni tipi di cellule per l&#39;ERG, in tal modo consentendo la stima della sensibilità spettrale massimi 9. registrazione intracellulare è un&#39;altra tecnica nella quale un elettrodo multa infilza una cella e viene applicato uno stimolo. I record elettrodi solo indivLa risposta di cellule idual in modo che la registrazione e l&#39;analisi più celle individuali può produrre sensibilità specifiche delle fisiologicamente diversi tipi di cellule 10-14. Anche se il nostro protocollo si concentra sulla analisi della sensibilità spettrale, i principi fondamentali della intracellulare registrazione con elettrodi appuntiti sono modificabili per altre applicazioni. Usando una differente preparazione di un campione, per esempio, e utilizzando elettrodi quarzo taglienti, si può registrare dalla profonda nel lobo ottico o altre regioni del cervello, a seconda della domanda viene chiesto. Ad esempio, i tempi di risposta dei singoli fotorecettori 15, attività cellulare nell&#39;ottica lobi 16 (lamina midollare o lobula 17), cervello 18 o altri gangli 19 possono anche essere registrati con tecniche simili, o stimoli di colore potrebbe essere sostituito con polarizzazione 20 -22 o movimento sTIMOLI 23,24. Fototrasduzione, il processo attraverso il quale la lucel&#39;energia viene assorbita e convertita in un segnale elettrochimico, è un antico tratto comune a quasi tutti i presenti il giorno 25 phyla animali. Il pigmento visivo trovato nelle cellule fotorecettori e responsabile per l&#39;avvio fototrasduzione visivo è rodopsina. Rhodopsins in tutti gli animali sono costituiti da una proteina opsin, membro del 7 transmembrana G famiglia dei recettori accoppiati alle proteine, e un cromoforo associato che deriva dalla retina o una molecola simile 26,27. Opsina sequenza di aminoacidi e la struttura cromofori influenzare l&#39;assorbanza della rodopsina a diverse lunghezze d&#39;onda della luce. Quando un fotone viene assorbito dal cromoforo rodopsina viene attivato, avviando una cascata proteina G nella cella che conduce verso l&#39;apertura dei canali ionici di membrana 28. Diversamente dalla maggior parte dei neuroni, le cellule fotorecettori subiscono potenziali cambiamenti graduali che possono essere misurati come una variazione relativa di ampiezza risposta con il cambiamento stimolo luminoso. Tipicamente un determinatoTipo fotorecettore esprime un solo gene opsina (anche se esistono eccezioni 8,10,29-31). visione del colore sofisticata, del tipo presente in molti vertebrati e artropodi, si ottiene con un occhio complesso di centinaia o migliaia di cellule visive ogni esprimono uno o più tipi di tanto in tanto rodopsina. informazioni Visual viene catturato confrontando risposte oltre il mosaico fotorecettore tramite complesso segnalazione neurale valle nell&#39;occhio e nel cervello, provocando la percezione di un&#39;immagine completa di colori e movimento. Dopo aver misurato le risposte grezzi di una cellula fotorecettore a diverse lunghezze d&#39;onda della luce tramite registrazione intracellulare, è possibile calcolare la sua sensibilità spettrale. Questo calcolo è basato sul principio di Univariance, che afferma che la risposta di una cellula fotorecettore è dipendente dal numero di fotoni assorbe, ma non sulle particolari proprietà dei fotoni assorbe 32. Ogni fotone che è Absorbed da rodopsina indurrà lo stesso tipo di risposta. In pratica, ciò significa che l&#39;ampiezza risposta grezzo di una cella aumenterà dovuti a un aumento dell&#39;intensità della luce (più fotoni per assorbire), o ad un cambiamento nella lunghezza d&#39;onda verso la sua sensibilità di picco (maggiore probabilità di rodopsina assorbire quella lunghezza d&#39;onda). Noi facciamo uso di questo principio nel relativo risposte cellulari ad intensità nota e la stessa lunghezza d&#39;onda di risposte a diverse lunghezze d&#39;onda e la stessa intensità ma sconosciuto sensibilità relativa. Le cellule sono spesso identificati dalla lunghezza d&#39;onda alla quale loro picchi di sensibilità. Qui vi mostriamo un metodo per la registrazione e l&#39;analisi di sensibilità spettrale dei fotorecettori negli occhi di una farfalla intracellulare, con una particolare attenzione per rendere questo metodo più accessibile alla comunità di ricerca più ampia. Sebbene registrazione intracellulare tuttora comune in letteratura, in particolare relativamente alla visione dei colori in insetti, abbiamo trovato that descrizioni di materiali e metodi sono generalmente troppo breve per consentire una riproduzione della tecnica. Presentiamo questo metodo in formato video allo scopo di consentire la replicazione facile. Descriviamo anche la tecnica utilizzando attrezzature facilmente reperibili ea prezzi accessibili. Ci rivolgiamo avvertimenti comuni che spesso non sono segnalati, che rallentano la ricerca quando l&#39;ottimizzazione di una nuova e complessa tecnica.

<table><tbody><tr><td>Butterfly pupae</td><td></td><td></td><td>Several local species available, need USDA permits for shipping. Carolina Bio Supply has several insect species that may be ordered within the U.S. without the need for additional permits</td></tr><tr><td>Large plastic cylinder</td><td></td><td></td><td>Any chamber that remains humidified will work</td></tr><tr><td>Insect pins, size 2</td><td>BioQuip</td><td>1208B2</td><td></td></tr><tr><td>100% Desert Mesquite Honey</td><td>Trader Joe&#039;s</td><td></td><td>Any honey or sucrose solution will work</td></tr><tr><td>Xenon Arc Lamp</td><td>Oriel Instruments</td><td>66003</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Universal Power Supply</td><td>Oriel Instruments</td><td>68805</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Optical Track</td><td>Oriel Instruments</td><td>11190</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Large (2x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11641</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Rail Carrier, Small (4x)</td><td>Oriel Instruments</td><td>11647</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Thread Adaptor, 8-32 Male to 1/4-20 Male, pack of 10</td><td>Newport Corporation</td><td>TA-8Q20-10</td><td></td></tr><tr><td>Optical Mounting Post, 1.0 in., 0.5 in. Dia. Stainless, 8-32 &amp;amp; 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>SP-1</td><td></td></tr><tr><td>No Slip Optical Post Holder, 2 in., 0.5 in. Diameter Posts, 1/4-20 (5x)</td><td>Newport Corporation</td><td>VPH-2</td><td></td></tr><tr><td>Fixed lens mount, 50.8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-2</td><td></td></tr><tr><td>Fixed lens mount, 25.4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>LH-1</td><td></td></tr><tr><td>Condenser lens assembly</td><td>Newport Corporation</td><td>60006</td><td></td></tr><tr><td>Convex silica lens, 50.8 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPX055</td><td></td></tr><tr><td>Six Position Filter Wheel, x2</td><td>Newport Corporation</td><td>FW1X6</td><td></td></tr><tr><td>Filter Wheel Mount Hub</td><td>Newport Corporation</td><td>FWM</td><td></td></tr><tr><td>Concave silica lens, 25.4 mm</td><td>Newport Corporation</td><td>SPC034</td><td></td></tr><tr><td>Collimator holder</td><td>Newport Corporation</td><td>77612</td><td></td></tr><tr><td>Collimating beam probe</td><td>Newport Corporation</td><td>77644</td><td></td></tr><tr><td>Ferrule Converter, SMA Termination to 11 mm Standard Ferrule</td><td>Newport Corporation</td><td>77670</td><td>This adapter allows the fiber optic to fit into the collimator holder&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>600 &amp;mu;m diameter UV-vis fiber obtic cable</td><td>Oriel Instruments</td><td>78367</td><td>Oriel is now a part of Newport Corporation</td></tr><tr><td>Shutter with drive unit</td><td>Uniblitz</td><td>100-2B</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.1 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND01</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.3 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND03</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 0.5 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND05</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 1.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND10</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 2.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND30</td><td></td></tr><tr><td>UV Fused Silica Metallic ND Filter, 3.0 OD</td><td>Newport</td><td>FRQ-ND50</td><td></td></tr><tr><td>LS-1-Cal lamp</td><td>Ocean Optics</td><td>LS-1-Cal</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>USB-2000</td><td></td></tr><tr><td>SpectraSuite Software</td><td>Ocean Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 300 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67749</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 310 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67752</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 320 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67754</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 330 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67756</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 340 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65614</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 350 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67757</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 360 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67760</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 370 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67761</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 380 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67762</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 390 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67763</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 400 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65732</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 410 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65619</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 420 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65621</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 430 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65622</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 440 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67764</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 450 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65625</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 460 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67765</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 470 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65629</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 480 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65630</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 492 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65633</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 500 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65634</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 510 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65637</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 520 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65639</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 532 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65640</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 540 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65642</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 550 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65644</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 560 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67766</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 570 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67767</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 580 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65646</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 589 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65647</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 600 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65648</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 610 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65649</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 620 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65650</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 632 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65651</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 640 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65653</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 650 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65655</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 660 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67769</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 671 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65657</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 680 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67770</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 690 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>65659</td><td></td></tr><tr><td>Interference bandpass filter, 700 nm&amp;nbsp;</td><td>Edmund Optics</td><td>67771</td><td></td></tr><tr><td>Faraday cage</td><td></td><td></td><td>Any metal structure will work that can be grounded and that fits the experimental setup.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope, 6X, 12X, 25X, 50X magnification</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>Wild M5</td><td>Any Stereomicroscope will do</td></tr><tr><td>Microscope stand with swinging arm and heavy base</td><td>McBain Instruments</td><td></td><td>Any heavy base with arm will do</td></tr><tr><td>Cardan arm</td><td></td><td></td><td>Custom built, See &lt;strong&gt;Figure 4&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Fiber-lite high intensity illuminator</td><td>Dolan-Jenner</td><td>MI-150</td><td>For lighting specimen</td></tr><tr><td>Fiber-lite goose-neck light guide</td><td>Dolan-Jenner</td><td>EEG 2823</td><td>Any goose-neck light guide will do</td></tr><tr><td>Marble table</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Raised wooden table</td><td></td><td></td><td>Hole should be cut through this table so that the sandbox can rest on the marble table underneath</td></tr><tr><td>Wooden box filled with sand</td><td></td><td></td><td>custom built, any box with sand</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Carl Zeiss - Jena</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Specimen stage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alligator clip wires for grounding</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulated copper wire</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silver wire, 0.125 mm diameter</td><td>World Precision Instruments</td><td>AGW0510</td><td></td></tr><tr><td>BNC cables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preamplifier with headstage</td><td>Dagan Corporation</td><td>IX2-700</td><td></td></tr><tr><td>Humbug Noise reducer</td><td>Quest Scientific</td><td>Humbug</td><td></td></tr><tr><td>Oscilloscope, 30 MHz, 2 CH, Dual Trace, Alt-triggering, without probe</td><td>EZ Digital</td><td>os-5030</td><td></td></tr><tr><td>BNC T-adapter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Powerlab hardware 2/20</td><td>ADI instruments</td><td>ML820</td><td></td></tr><tr><td>Labchart software</td><td>ADI instruments</td><td>Chart 5</td><td></td></tr><tr><td>10 MHz Pulse Generator</td><td>BK Precision</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Borosillicate glass capillaries with filament</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-4</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, 3 M</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slotted plastic tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Low melting temperature wax</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soldering Iron</td><td>Weller</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platform with ball-and-socket magnetic base</td><td>Hama photo and video</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Double edge carbon steel, breakable razor blade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72004</td><td></td></tr><tr><td>Vaseline</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

determination of photoreceptor cell spectral sensitivity in an insect model from in vivo intracellular recordings

registrazione intracellulare è una tecnica potente usato per determinare come una singola cellula può rispondere ad un dato stimolo. Nella ricerca visione, la registrazione intracellulare è stata storicamente una tecnica comune usata per studiare la sensibilità di cellule visive individuali a diversi stimoli luminosi che è ancora in uso oggi. Tuttavia, rimane una carenza di metodologia dettagliata nella letteratura per i ricercatori che desiderano replicare gli esperimenti di registrazione intracellulare negli occhi. Qui vi presentiamo l&#39;insetto come modello per l&#39;esame fisiologia dell&#39;occhio, più in generale. fotorecettori insetti si trovano vicino alla superficie dell&#39;occhio e sono quindi facilmente raggiungibili, e molti dei meccanismi coinvolti nella visione si conservano tutta phyla animali. Descriviamo la procedura di base per la registrazione in vivo intracellulare di cellule visive negli occhi di una farfalla, con l&#39;obiettivo di rendere questa tecnica più accessibile ai ricercatori con poca esperienza precedente in electrophysiology. Introduciamo l&#39;attrezzatura di base, come preparare una farfalla reale per la registrazione, come inserire un microelettrodo di vetro in una singola cella, e infine la procedura di registrazione stessa. Spieghiamo anche l&#39;analisi di base dei dati di risposta prime per determinare la sensibilità spettrale di tipi di cellule individuali. Sebbene il protocollo concentra sulla determinazione sensibilità spettrale, altri stimoli (ad esempio, la luce polarizzata) e variazioni del metodo sono applicabili a questa configurazione.

Per molti elementi della configurazione di registrazione, una descrizione scritta non fornisce dettagli sufficienti. Figura 1 è una schematica dei componenti coinvolti nella configurazione registrazione completa. In figura 2, spettri sono tracciate per luce bianca e ciascun filtro di interferenza a dare un senso del perché è necessario un fattore di correzione e ciò che è necessario per calcolare la correzione. La Figura 3 mostra foto e un diagramma del braccio cardanico che viene utilizzato per queste esperimenti. figura 4 è una immagine composita che mostra la fase di registrazione e micromanipolatore. la Figura 5 mostra diverse fasi nella preparazione di una farfalla per l&#39;esperimento. Una volta iniziata la registrazione, una variazione negativa di tensione in risposta a un lampo di luce significa che l&#39;elettrodo è al di fuori di una cella, come in figura 6a. La forza della risposta dipende dalla vicinanza dell&#39;elettrodopunta ad una cellula fotorecettore, e l&#39;angolo di incidenza della luce flash. La risposta dovrebbe essere di grandi dimensioni (&gt; 30 mV) prima che la punta è abbastanza vicino a una cella per infilzare. Figura 6b mostra una chiara risposta depolarizzante ad uno stimolo leggero, a significare l&#39;ingresso in una cellula fotorecettore. Il potenziale di riposo deve essere stabile e l&#39;ampiezza risposta dovrebbe essere grande (almeno 40 mV), anche se l&#39;ampiezza assoluta può variare considerevolmente. Misuriamo risposta relativa, quindi è più importante che il rapporto segnale-rumore è alto. Se il riposo potenziali cambiamenti notevolmente, la forma d&#39;onda di risposta sembrano inusuali, o la risposta massima è troppo bassa, quindi confrontando le risposte relativi tra tutti i filtri interferenziali diventa impossibile. Esempi di registrazioni inutilizzabili sono mostrati in figura 6c, 6d. Dopo aver completato una registrazione di successo, le risposte ND devono essere rilevate e l&#39;equazione Naka-Rushton devono essere montati ai dati 33, shown in figura 7. Questa figura è tracciato utilizzando la serie di filtri ND senza filtri interferenziali. Se la registrazione è stabile, i dati della serie filtro ND dovrebbero essere simili prima e dopo l&#39;esperimento. Sensibilità spettrale viene determinato inserendo l&#39;equazione Naka-Rushton il terreno VlogI in figura 7, quindi risolvendo (I) per ogni risposta (V) ad una data lunghezza d&#39;onda, come spiegato nei calcoli della sezione 6 del protocollo. Un esempio rappresentativo di sensibilità spettrale derivati ​​da una singola registrazione viene tracciata in figura 8a (si prega di notare che questo esempio mostra i dati reali calcolati, ma il picco è stato spostato come questo risultato non pubblicato). Le cellule possono classificare picco di sensibilità a una lunghezza d&#39;onda simile e forma complessiva dello spettro sensibilità. Tipi di cellule simili vengono poi mediati e la sensibilità media è tracciata con barre di errore standard, ad ogni lunghezza d&#39;onda in Figuri 8b. Sensibilità spettrale di tre tipi di cellule tipiche disponibili a un insetto sono mostrati nella Figura 8c (ampiezza e di errore barre sono calcolati da dati reali, ma i picchi sono spostati). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig3.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> Figura 1: Schema di registrazione. Componenti Componenti del percorso della luce, il campione di installazione e registrazione di hardware sono indicati. Track ottico siede sulla panca di legno al di fuori della gabbia di Faraday. Xe, lampada allo xeno, Cd, assemblaggio condensatore, Lx, lente convessa, ND, ruota filtro a densità neutra, Cf, filtro di interferenza, S, otturatore, Lc, lente concava, Co , la sonda fascio di collimazione, Fo, cavo in fibra ottica. La gabbia di Faraday siede sullapanca di legno in tutto il campione. La panca di legno si siede sopra, ma non tocchi il tavolo di marmo vibrazionalmente isolato sotto. Registrazione (Rc) e di riferimento (Rf) elettrodi sono collegati al headstage (Hs). Rc è introdotto nell&#39;occhio (E) e Rf viene introdotto in un&#39;altra parte del corpo. La headstage è parte della configurazione preamplificatore (Pa) al di fuori della gabbia di Faraday. Il segnale viene trasmesso dal preamplificatore attraverso il riduttore di rumore Humbug (Hb), e nella oscilloscopio (Os). Dal oscilloscopio il segnale viene fatto passare attraverso l&#39;hardware Powerlab (PLB) e nel computer portatile (CPU) dove viene letto dal software LabChart. L&#39;otturatore è comandato da un generatore di funzione (Fg) che viene fatto passare attraverso un secondo canale sull&#39;oscilloscopio, e può anche essere fatto passare attraverso un secondo canale sull&#39;hardware Powerlab se questo segnale sta per essere registrati pure. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig5.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> Figura 2:. Luce bianca e interferenze filtro spettri utilizzati per calcolare Fattori di correzione Gli spettri misurati nel punto 2.5 del protocollo sono mostrati 300-700 nm, per la luce bianca, così come ciascuno dei filtri interferenziali 41. Ogni spettro filtro di interferenza viene misurata solo con filtro nel percorso ottico. T 520 corrisponde alla zona sotto lo spettro del filtro con il picco 520 nm e 520 s corrisponde all&#39;intensità della luce bianca al picco di lunghezza d&#39;onda del filtro, 520 nm. Questi valori vengono utilizzati per calcolare i coefficienti di correzione per ogni filtro (in questo caso 520 nm) come descritto al punto 2.6 nel protocollo. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig4.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 13.888888359069824px; line-height: 28px;" /> Figura 3:. Descrizione del Cardano Braccio perimetrale usata negli esperimenti Il braccio cardanico tiene il cavo in fibra ottica e consente la rotazione completa sferica e la regolazione angolare modo che la luce possa essere consegnato al corretto angolo di incidenza alla cella in fase di registrazione. (A) Top-down vista. (B) Vista dal lato ad angolo. Numeri corrispondono alla stessa parte in tutti i pannelli. (1) La piastra inferiore consente la completa rotazione circolare nel piano orizzontale. (2) La piastra verticale consente la rotazione completa del braccio circolare in un piano verticale. (3) Questo cilindro è il braccio metallico con il cavo in fibra ottica sull&#39;estremità, e permette un secondo piano verticale di rotazione circolare perpendicolare (2). (4) Il cavo in fibra ottica si tiene in posto all&#39;estremità del braccio, e la luce è diretta verso la posizione del campione nel setup sperimentale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig1.jpg" /> Figura 4:. Componenti del Impostazione registrazione (A) tubo di plastica utilizzato per contenere il campione. (B) Vista ambientale della piattaforma su cui sono montati il campione e il tubo. (C) Vista laterale della piattaforma di ball-and-giunto con base magnetica (1). Elettrodo di riferimento mantenuto immobile con colla e cera sul lato della piattaforma (2). elettrodo di riferimento avvolto intorno coccodrillo e saldati sul posto, fornendo una zona di attacco in cui l&#39;elettrodo di riferimento headstage può fermare (3). (D) elettrodo punta sotto 20X di ingrandimento. barra della scala, 25 micron. (E) di scena, supporto di elettrodo, e la configurazione micromanipolatore. Il headstage (1) è fissato sopra l&#39;apparecchio con ilFilo registrazione argento (2), e l&#39;elettrodo di riferimento con coccodrillo (3) allegati. Il portaelettrodo (4) è fissato un micromanipolatore manuale (5) con un post basso che può essere regolato con una manopola per movimento verticale o può essere spinto o tirato per il movimento orizzontale del porta elettrodo. La piattaforma magnetica con il campione si siede sul palco (6) appena sotto la porta elettrodo. (F) La gabbia di Faraday circonda il sistema di registrazione con uno schermo che può essere tirato verso l&#39;alto o verso il basso nella parte anteriore. Foglio di alluminio è collocato al di sotto di tutte le apparecchiature con tamponi in gomma sulla parte superiore. Il cavo in fibra ottica (1) porta nella gabbia dalla traccia ottica esterna, ed è diretto dal braccio cardanico (2) verso il palco (3). L&#39;apparato fase di registrazione e manipolatore è posto in una scatola di sabbia (4) appoggiata su un tavolo di marmo sotto la configurazione. Tutte le altre apparecchiature poggia sulla parte superiore del banco di legno che non tocca il tavolo di marmo. La scatola di sabbia si trova sulla cima del tavolo di marmo in un bucotagliare fuori dal tavolo di legno, in modo che il campione è completamente isolata dal vibrazionalmente dotazioni del tavolo di legno. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53829/53829fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig2.jpg" /> Figura 5:. Farfalla Prep (A) La farfalla viene inserito nel tubo e la testa, ali e antenne sono immobilizzato con cera calda. L&#39;elettrodo indifferente viene inserito nel boccale (1), un pezzo di cera secca viene utilizzata per tenere premuto l&#39;addome (2), ed un tessuto bagnato è posizionato dietro il campione. (B) Primo piano della testa cerato verso il basso. L&#39;occhio di essere registrato da (1) sia sempre libera dalla cera o detriti, e l&#39;elettrodo di riferimento (2) viene inserito nel l&#39;apparato boccale e cera calda è rapidamente fuso su di esso per tenerlo in posizione.(C) Un foro tagliato nell&#39;occhio in cui lo strato di cellule fotorecettore rosa-bianco può essere visto. pigmento nero e giallo emolinfa sono assenti. (D) Vista laterale del campione con un elettrodo di registrazione in vetro (1) posto negli occhi, e l&#39;elettrodo indifferente (2) collegato al palco testa, che dovrebbe completare un circuito come visto sull&#39;oscilloscopio. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53829/53829fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig6.jpg" style="font-size: 14px;" /> Figura 6:. Risposte prime dalle registrazioni del campione Ogni risposta corrisponde ad un singolo flash di luce di 50 msec di durata (barre nere). (A) Un esempio di grande cambiamento tensione negativa che dovrebbe essere visto soloprima di entrare in una cella. (B) una registrazione pulito deve avere poco rumore di fondo e una grande risposta depolarizzante, tipicamente di almeno 40 mV. (C) Un esempio di registrazione scadente a causa del potenziale variazione negativa dopo il picco principale (frecce). (D) Un altro esempio di una cattiva registrazione. Il potenziale di riposo è in fase di grandi fluttuazioni (barra rossa) e la grande quantità di rumore di fondo può oscurare l&#39;ampiezza della risposta (punta di freccia). <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig7.jpg" /> Figura 7:. Risposta-Intensity funzione log-lineare cerchi pieni mostrano le risposte misurate di una cella 3,5-0 OD, per questa configurazione sperimentale. L&#39;intensità della luce è su una scala logaritmica. Al molto elevate intensità della risposta è saturo, e molto basse intensità una piccola risposta persiste invece di cadere a zero lungo la linea. Tegli Naka-Rushton equazione 33 è dotato di questa forma non lineare (linea tratteggiata). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53829/53829fig8.jpg" /> Figura 8:. Esempi Sensibilità spettrale (A) sono state registrate le risposte di una cellula rappresentante unico e relativa sensibilità spettrale è stato calcolato. Il picco di questa cella è a 440 nm, il che significa che risponde meglio alla luce blu. dati delle celle singole possono sembrare rumoroso (picco a 380 nm). (B) Le cellule con lo stesso picco relativa e la forma sono in media insieme e vengono aggiunte barre di errore standard. Qui, sette cellule blu provenienti da sette persone sono state in media fornisce una forte evidenza che un tipo di cellula esiste in questa specie massimamente sensibili alla luce a 440 nm. (C) Questo processo può essere ripetuto per tutti i tipi cellulari trovati, e tracciati insieme. occhi insetti variano ampiamente nei loro sensibilità spettrale, ma un tipico insect può avere picchi mostrato qui, a 370 nm, 440 nm e 510 nm. Nota, queste sensibilità spettrali sono tutte calcolate sulla base dei dati reali, ma i picchi sono stati spostati perché la tecnica non è ancora pubblicato per questa specie.

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Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

La tecnica elettrofisiologica di registrazione intracellulare è dimostrato e utilizzato per determinare la sensibilità spettrali dei fotorecettori singoli nell&#39;occhio composto di una farfalla.

Determinazione del fotorecettore cellulare Sensibilità spettrale in un modello da insetti<em&gt; In Vivo</em&gt; registrazioni intracellulari

Intracellular recording is a powerful technique used to determine how a single cell may respond to a given stimulus. In vision research, intracellular ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings

11.4K Views.  University of California, Irvine.  La tecnica elettrofisiologica di registrazione intracellulare è dimostrato e utilizzato per determinare la sensibilità spettrali dei fotorecettori singoli nell'occhio composto di una farfalla. 

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Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissezione e la cultura di neuroni embrionali commissurali da midollo spinale

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Ricerca

Neuroscienze

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic nerve. In vivo recordings of ganglion cell spike trains in several animal models have revealed much of what is known about how the early visual system processes and encodes visual information. However, such recordings have been rare in one of the most common animal models, the rat, possibly owing to difficulty in detecting spikes fired by small diameter axons. The many retinal disease models involving rats motivate a need for characterizing the functional properties of ganglion cells without disturbing the eye, as with intraocular or in vitro recordings. Here, we demonstrate a method for recording ganglion cell spike trains from the optic chiasm of the anesthetized rat. We first show how to fabricate tungsten-in-glass electrodes that can pick up electrical activity from single ganglion cell axons in rat. The electrodes outperform all commercial ones that we have tried. We then illustrate our custom-designed stereotaxic system for in vivo visual neurophysiology experiments and our procedures for animal preparation and reliable and stable electrode placement in the optic chiasm.

Single-unit In vivo Recordings from the Optic Chiasm of Rat

Retinal ganglion cells transmit visual information from the eye to the brain with sequences of action potentials. Here, we demonstrate how to record the action potentials of single ganglion cells in vivo from anesthetized rats.

Singola unità In vivo Registrazioni dal chiasma ottico di Rat

Information about the visual world is transmitted to the brain in sequences of action potentials in retinal ganglion cell axons that make up the optic ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Caratterizzazione elettrofisiologica di GFP-Esprimendo popolazioni di cellule nella retina intatto

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, enabling the use of D. melanogaster molecular genetics to study inositol-lipid signaling and Transient Receptor Potential (TRP) channels at the single-molecule level. A handful of labs have mastered this powerful technique, which enables the analysis of the physiological responses to light under highly controlled conditions. This technique allows control over the intracellular and extracellular media; the membrane voltage; and the fast application of pharmacological compounds, such as a variety of ionic or pH indicators, to the intra- and extracellular media. With an exceptionally high signal-to-noise ratio, this method enables the measurement of dark spontaneous and light-induced unitary currents (i.e.&#160;spontaneous and quantum bumps) and macroscopic Light-induced Currents (LIC) from single D. melanogaster photoreceptors. This protocol outlines, in great detail, all the key steps necessary to perform this technique, which includes both electrophysiological and optical recordings. The fly retina dissection procedure for the attainment of intact and viable ex vivo isolated ommatidia in the bath chamber is described. The equipment needed to perform whole-cell and fluorescence imaging measurements are also detailed. Finally, the pitfalls in using this delicate preparation during extended experiments are explained.

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors enable the measurement of spontaneous dark bumps, quantum bumps, macroscopic responses to light, and current-voltage relationships under various conditions. In combination with D. melanogaster genetic manipulation tools, this method enables the study of the ubiquitous inositol-lipid signaling pathway and its target, the TRP channel.

Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor cells in isolated eyestalks using the discontinuous single electrode-switched voltage-clamp configuration. First, with a razor blade we made an opening in the dorsal cornea to get access to the retina. Thereafter, we inserted a glass electrode through the opening, and penetrated a cell as reported by the recording of a negative potential. Membrane potential was clamped at the photoreceptor's resting potential and a light-pulse was applied to activate currents. Finally, the two light-flash protocol was employed to measure current desensitization and recovery. The first light-flash triggers, after a lag period, the transduction ionic current, which after reaching a peak amplitude decays towards a desensitized state; the second flash, applied at varying time intervals, assesses the state of the light-activated conductance. To characterize the light-elicited current, three parameters were measured: 1) latency (the time elapsed between light flash delivery and the moment in which current achieves 10% of its maximum value); 2) peak current; and 3) desensitization time constant (exponential time constant of the current decay phase). All parameters are affected by the first pulse.
To quantify recovery from desensitization, the ratio p2/p1 was employed versus time between pulses. p1 is the peak current evoked by the first light-pulse, and p2 is the peak current evoked by the second pulse. These data were fitted to a sum of exponential functions. Finally, these measurements were carried out as function of circadian time.

A protocol for the study of desensitization and sensitivity recovery of crayfish photoreceptors as a function of circadian time is presented.

Desensibilizzazione e recupero dei fotorecettori dei gamberi al momento della consegna di uno stimolo leggero

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor ...

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is initiated by photon absorption-inducing isomerization of the chromophore, promoting conformational changes of the opsin and resulting in a second dark-stable photopigment state (metarhodopsin, M). Investigation of this bi-stable photopigment using random mutagenesis requires simple and robust methods for screening mutant flies. Therefore, several methods for measuring reductions in functional photopigment levels have been designed. One such method exploits the charge displacements within the photopigment following photon absorption and the huge amounts of photopigment molecules expressed in the photoreceptors. This electrical signal, named the early receptor potential (or early receptor current), is measured by a variety of electrophysiological methods (e.g., electroretinogram and whole-cell recordings) and is linearly proportional to functional photopigment levels. The advantages of this method are the high signal-to-noise ratio, direct linear measurement of photopigment levels, and independence of phototransduction mechanisms downstream to rhodopsin or metarhodopsin activation. An additional electrophysiological method called prolonged depolarizing afterpotential (PDA) exploits the bi-stability of Drosophila photopigment and the absorption-spectral differences of fly R and M pigment states. The PDA is induced by intense blue light, converting saturating amounts of rhodopsin to metarhodopsin, resulting in the failure of light-response termination for an extended time in darkness, but it can be terminated by metarhodopsin to rhodopsin conversion using intense orange light. Since the PDA is a robust signal that requires massive photopigment conversion, even small defects in the biogenesis of the photopigment lead to readily detected abnormal PDA. Indeed, defective PDA mutants led to the identification of novel signaling proteins important for phototransduction.

Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors

We present a protocol to electrophysiologically characterize bi-stable photopigments: (i) exploiting the charge displacements within the photopigment molecules following photon-absorption and their huge amount in the photoreceptors, and (ii) exploiting the absorption-spectra differences of rhodopsin and metarhodopsin photopigment states. These protocols are useful to screen for mutations affecting bi-stable photopigment systems.&#160;

Metodi elettrofisiologici per misurare i livelli di fotopigmento nei fotorecettori di Drosophila

The Drosophila G-protein-coupled photopigment rhodopsin (R) is composed of a protein (opsin) and a chromophore. The activation process of rhodopsin is ...

In Vivo Intracellular Recording of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in a Butterfly

Source: McCulloch, K. J., et al.. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53829">Determination of Photoreceptor Cell Spectral Sensitivity in an Insect Model from In Vivo Intracellular Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates the procedure for in vivo intracellular recording of photoreceptor cells in the eye of a butterfly and determining the spectral sensitivity of individual cell types. This technique enables the study of sensitivities of individual photoreceptor cells to different light stimuli.

Registrazione intracellulare in vivo della sensibilità spettrale delle cellule fotorecettrici in una farfalla

1. Specimen Prep and Recording Procedure

	Prepare the Specimen
	
		Affix an individual butterfly inside a small plastic tube with hot wax so the head is ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Imaging and Optical Techniques

Electrophysiological Recording of Voltage Responses of Drosophila Retinal Photoreceptors to Light Stimuli

Source: Juusola, M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54142">Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video outlines the protocol for electrophysiological recording of photoreceptor activity in the eye of an immobilized Drosophila, enabling precise measurement of voltage changes in response to light stimuli.

Registrazione elettrofisiologica delle risposte di tensione dei fotorecettori retinici di Drosophila agli stimoli luminosi

1. Recording from R1-R6 Photoreceptors 

	Always be grounded when operating the microelectrode amplifier (for example by touching the metal surface of the ...

Determinazione del fotorecettore cellulare Sensibilità spettrale in un modello da insetti

Riepilogo

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