Name: a mouse model for laser-induced choroidal neovascularization
Uploaded: 2015-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization at JoVE.com

The authors would like to acknowledge Jonathan Chou, MD for his assistance on preparation and editing of the final manuscript and Wenzhong Liu for the OCT data. We would also like to acknowledge support from the Macula Society Research Grant (AAF), support from an unrestricted grant to Northwestern University from Research to Prevent Blindness, Inc., New York, NY, USA, and support from NIH-EY019951.

Todos os animais são tratados de acordo com o Guia de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório 2013 Edition, da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declaração para o uso de animais em Oftalmologia e Vision Research, e conforme aprovado pelo animal Institucional Cuidado e Utilização Comité para a Universidade de Northwestern. Nota: O procedimento que se segue pode ser feito inteiramente com um operador; No entanto, é muito mais eficientemente conduzida com dois operadores com as tarefas dividido em conformidade. 1. Prepare a Estação do laser do laser e pré- <ol><li> Posicione o laser e lâmpada de fenda, onde ele pode ser facilmente acessível. Ligue a laser e definir os parâmetros pré-determinados (por exemplo, 75 mm de tamanho local, poder mW 100, 100 duração ms). CUIDADO: Certifique-se de operador usa todos os equipamentos de protecção individual dos animais e segurança laser e laser de segurança pertinentes sinais são exibidos fora da sala de procedimento. <ol><li> Antes de usar qualquer animais experimentais, encontrar parâmetros ideais usando uma calibração, rato não-experimental. Os parâmetros do laser irá depender do laser utilizado. Parâmetros ideais são definidos pela configuração de energia menor do laser que constantemente provoca a formação de &quot;bolha&quot; quando focada corretamente. Ver vídeo, por exemplo de lesão com adequada &quot;bolha&quot; de formação. </li></ol></li><li> Prepare a estação de pré-laser de modo que a anestesia, animal mais quente, lenços de tecido, e todos os colírios (tropicamida, Tetracaína, e lágrimas artificiais) são facilmente ao nosso alcance para o operador. <ol><li> Assegure-se que animais mais quente é pré-aquecida para corrigir a temperatura (37 ° C) antes de injectar o anestésico em primeiro ratinho, a fim de evitar a hipotermia induzida pela anestesia. </li></ol></li><li> Coloque fase do mouse sobre mais quente para que ele possa reter o calor e permanecer quente uma vez procedimento a laser começa. </li></ol> 2. Rato Anestesia e Preparação Pré-a laser <ol><li> Antes de injectaring anestesia, inspecionar o olho macroscopicamente para garantir que ele não tem deformidades ou anormalidades que diminuem a clareza da córnea (por exemplo, catarata). </li><li> Pesar mouse. </li><li> Peso Record, sexo e número de identificação animal. </li><li> Usando peso, calcular o montante adequado de anestesia a ser usado com base nas orientações dadas pela instituição (por exemplo, 100 mg / kg de cloridrato de cetamina, 10 mg / kg de xilazina OU tribromoetanol 250 mg / kg; para a 20 g rato injectar 0,20 ml de xilazina / cetamina cocktail OU 0,25 ml de tribromoetanol). Tem uma tabela de dosagens pré-calculada por peso em incrementos de 1 g, a fim de reduzir os erros matemáticos. </li><li> Scruff do mouse e injetar anestésico por via intraperitoneal com base em cálculos na etapa 2.4. </li><li> Coloque o mouse sobre os animais mais quente e esperar até que o mouse é completamente anestesiados, verificando o reflexo pedal via pitada dedo do pé (cerca de 3-5 min). </li><li> Arregaçar um lenço de papel e proteger a área nasal do mouse para evitar aspiration de líquido roll-off. Rato do rolo no seu lado e colocar uma gota (aproximadamente 30 ul) de cloridrato de tetracaína em cada olho para a anestesia tópica. Aguarde 2 min para solução tenha efeito. </li><li> Repita o passo 2.7 com uma gota de Tropicamida tópico para dilatação pupilar. Como alternativa, use o cloridrato de fenilefrina (2,5%) para a dilatação. </li><li> Aguarde 2 min de soluções para surtir efeito; manter animais em mais quente durante este tempo. </li><li> Após o tempo adequado tenha decorrido, rapidamente colocar o mouse sobre o palco do mouse e coloque o estágio no queixo resto da lâmpada de fenda. </li><li> Ligue lâmpada de fenda para o menor brilho luz e verificar o grau de dilatação pupilar. Se pupila dilatada não é adequadamente (aproximadamente 2,5-3 mm), retorne mouse para animais mais quente e esperar. Como alternativa, administrar uma gota de Tropicamida. Uma vez que olho é suficientemente dilatado, avance para o procedimento a laser. </li></ol> 3. Laser Procedimento Nota: Certifique-se de outra ps pessoas na sala de usar óculos de proteção quando está longe de lâmpada de fenda olho peça protegida por laser <ol><li> Ajustar o posicionamento do mouse sobre o estágio do mouse, de modo que ele está na posição ideal para a visualização de nervo óptico (ver 3.1.2). <ol><li> Orientar o mouse ao seu titular para que ele fique na horizontal, perpendicular à fenda feixe de luz, com a cabeça de um lado e cauda na outra. Posicionamento ideal do rato fará a visualização do nervo óptico muito mais fácil uma vez tampa de deslizamento é aplicada. </li><li> Ligeiramente vire o mouse por isso é em um ângulo de 170 ° ~ com a cabeça mais perto do operador de laser. </li><li> Certifique-se de que o mouse é o mais próximo possível para lâmpada de fenda, mas ainda em uma posição onde ele é estável e onde a mão do operador terá espaço suficiente para manipulação fina. </li></ol></li><li> Após o ratinho está idealmente posicionado, colocar uma gota da solução de lágrima artificial em 25 mm x 25 mm lamela de vidro. <ol><li> Coloque uma gota de solução de lágrima artificial em opp de ratoolho osite - este olho irá garantir é hidratada e ajuda a formação de atraso de catarata. </li></ol></li><li> Segure esquina da lamela entre o polegar eo ponteiro dedos; posição, de modo que o vidro é apertado entre as pontas de dois dedos. </li><li> Suavemente embrulhar os restantes três dedos ao redor do corpo do animal para o apoio ea estabilização mão. Posição da mão de modo que a lamela de vidro pode ser facilmente colocado no olho do mouse. <ol><li> Certifique-se de que o pulso está estabilizada em uma superfície firme, a fim de reduzir o tremor da mão. </li></ol></li><li> Uma vez que posição estável é obtido, pressione cuidadosamente lamela de vidro (com gota de lágrima artificial ainda aderido) sobre o olho do mouse. <ol><li> Certifique-se a lamela estiver posicionado o mais perpendicular possível para o feixe de laser, a fim de evitar a dispersão do feixe de laser ou reflexão. A lamela age como uma lente de contacto para aplanar a córnea. </li></ol></li><li> Olhe através de lâmpada de fenda e com a mão livre de alternância concentrar untIL retina pode ser visualizado. A retina vai ter uma cor amarelo claro / vermelho, dependendo da localização visualizado, vasos distintos, vermelho será visível. </li><li> Devagar e com cuidado manipular cabeça de rato e / ou lamela até visualizar o nervo óptico. O nervo óptico será de cor amarela com múltiplos vasos que irradiam a partir dele. </li><li> Uma vez operador confirmou visualização do nervo óptico, ligue a laser com foco feixe. </li><li> Uma vez feixe de laser ter sido ligado, manobrar a laser de focagem do feixe para a posição desejada (aproximadamente 1 diâmetro do disco do nervo óptico). </li><li> Concentre-se feixe de laser sobre o RPE do fundo de olho. A focagem adequada é por ter conseguido o feixe de laser mais nítida e clara. Se visando feixe olha oval ou fora de foco, alternar o foco lâmpada de fenda ou re-posição lamela de vidro. </li><li> Uma vez que o feixe de mira está focada em RPE, iniciar administração laser utilizando gatilho pé do laser. <ol><li> Certifique-se de evitar vasos da retina para evitar que ele intraocularmorrhage. </li></ol></li><li> Prestar atenção para o aparecimento de uma bolha imediatamente após a administração do laser. O esboço do tiro de laser deve ser clara e não nebulosa de qualquer forma. <ol><li> Se o tiro de laser não resulta na formação de bolhas, ou área de impacto parece nebuloso (aparência turva com borda circular mal definido vs. fronteira clara, bem definida de um impacto positivo), ou se a hemorragia é visto após a administração de laser, não incluir essas lesões para análise futura. </li></ol></li><li> Repita os passos de 3,10-3,12 para todas as posições desejadas CNV (geralmente aos 3, 6, 9 e 12 posições ao redor do nervo óptico). Se induções a laser são aplicados em aproximadamente mesma distância do nervo óptico, refocus não deve ser necessário. No entanto, devido à forte curvatura do olho do rato e pequenas variações que podem existir na retina, a recentragem do feixe pode ser necessário entre administrações consecutivas de laser. </li><li> Registro em um notebook a localização e resultado de eadministração tiro a laser e ach resultado (sucesso, obscuro, hemorragia, etc.) de cada tiro administrados para o olho. Certifique-se de colocar o laser no modo stand-by quando não estiver em uso. </li><li> 3,1-3,14 Repetir para o outro olho do rato, se necessário, usando a outra mão para a estabilização e uma nova lamela. </li><li> Depois de todos os disparos de laser desejados são administrados, desligue a laser e lâmpada de fenda. </li><li> Descarte lamela e lugar do mouse sobre mais quente para a recuperação da anestesia. Macroscopicamente inspecionar olho por qualquer prejuízo e coloque uma gota de solução de lágrima artificial para manter o olho hidratado e potencialmente prevenir o desenvolvimento de catarata futuro. Uma vez que o mouse se recupera da anestesia, voltar a gaiola. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td></td><td> AVERTIN </td><td> AVERTIN </td><td> AVERTIN </td><td> XYL / KET </td><td> XYL / KET </td></tr><tr><td> Peso do rato (g) </td><td> Dose (mg / kg) </td><td&gt; Concentração da Solução (mg / ml) </td><td> Anestésico Dose (ml) </td><td> Dose (mg / kg) </td><td> Anestésico Dose (ml) </td></tr><tr><td> 15 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,1875 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> 16 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,16 </td></tr><tr><td> 17 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2125 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,17 </td></tr><tr><td> 18 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,225 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,18 </td></tr><tr><td> 19 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2375 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,19 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,25</td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> 21 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2625 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,21 </td></tr><tr><td> 22 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,275 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,22 </td></tr><tr><td> 23 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2875 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,23 </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,3 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,24 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,3125 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,325 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,26 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 250 </td><td&gt; 20 </td><td> 0,3375 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,35 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,28 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,3625 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,29 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,375 </td><td> 100 mg / kg de cetamina; 10 mg / kg de xilazina </td><td> 0,3 </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Dose XyIKet Chart.

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The authors declare they have no competing financial interests.

Existem vários fatores que podem afetar a entrega do laser e do desenvolvimento resultante da lesão CNV após laser de indução bem-sucedida. Estes factores devem ser controlados e padronizados para a fim de ter os resultados mais fiáveis. O mais pertinente desses fatores são a seleção do mouse (genótipo, idade e sexo), a seleção anestésico, e as configurações de laser. O modelo de mouse específico usado pode ter um efeito significativo sobre o curso do desenvolvimento CNV. O genótipo mais utilizado é a C57BL / 6 mouse. O fornecedor do qual são obtidos os animais podem afectar o tamanho resultante CNV. Pobre et ai. demonstraram diferenças significativas em tamanho final lesão CNV em camundongos C57BL / 6 a partir de Jackson, Charles Rivers, e laboratórios Taconic, com ratos de Taconic desenvolvimento significativamente maior CNV que os outros dois fornecedores 4. Portanto, a compra de uma empresa e usar todos os ratinhos a partir desse mesmo fornecedor vai ajudar a minimizar as diferenças externasdo tamanho da lesão CNV. A idade e o sexo do ratinho também foi demonstrado ser um factor importante a considerar ao conceber o experimento. Camundongos fêmeas desenvolvem mais CNV do que camundongos machos da mesma idade, e ratos mais velhos de ambos os sexos desenvolver mais CNV de ratos mais jovens 22,23. Dependendo dos parâmetros experimentais, os operadores devem manter esses fatores em mente. Por exemplo, se os operadores estão usando o procedimento a laser-CNV para elucidar fins mecanicistas e de desenvolvimento de drogas, ambos os sexos em diferentes idades deve ser utilizado para definir mecanismos que são específicos para os sexos e as que não são. Anestesia adequada é um passo crítico para este procedimento, especialmente durante o processo de aprendizagem. A maioria dos esquemas aprovados IACUC pode induzir a anestesia por pelo menos 15-30 min, que é mais do que tempo suficiente para entregar 4-5 disparos de laser para cada olho uma vez que o procedimento tenha sido dominada. No entanto, se demasiado tempo decorre, a anestesia pode levar a opacificação da lente reversível, rendering o olho opticamente impermeável para CNV experimental 24. Os dois principais protocolos utilizados para induzir a anestesia é um xilazina / cocktail de cetamina ou tribromoetanol (TBE) entregues por via intraperitoneal. Embora alguns relatórios postular as vantagens de TBE com xilazina / cetamina em termos de formação de catarata, ambos eventualmente, resultar no desenvolvimento de um cristalino opaco se o operador não funcionar rapidamente 14. Uma maneira de prolongar o tempo antes do desenvolvimento de cataratas é a manter a hidratação do olho, tal como referido no protocolo detalhado, através da aplicação de lágrimas artificiais 25. Este método, independentemente da substância anestésica utilizada, deve ajudar a retardar a formação de catarata e dar ao operador mais tempo para concluir o procedimento. Configurações de laser pode ser um fator importante na indução confiável de CNV. Calibrar a potência do laser e duração são um passo preliminar importante antes de realizar o procedimento em animais experimentais. Disparos de laserque causa hemorragia ou estão fora de foco, sem a formação de bolhas deve ser excluído do cálculo, pois isso perturba o processo de desenvolvimento CNV. Se vários navios são rompidos causando hemorragia difusa, todo o olho deve ser excluído. Idealmente, a menor potência e menor duração do laser que consistentemente rompe a membrana de Bruch causando a formação de bolhas e uma lesão com demarcação clara deve ser utilizado 4. Protocolos experimentando com diferentes configurações de energia têm demonstrado que o aumento da potência e duração levam a dano tecidual excessiva e as taxas posteriormente mais baixos de formação CNV 4, 14,17. Além disso, a localização da lesão laser também pode afectar o desenvolvimento da CNV. Impactos entregues aproximadamente 1 diâmetro do disco (DD) a partir do disco óptico rendeu área significativamente maior do que os volumes CNV entregues &lt;1 DD ou 2 ou mais de distância DDs 23. Dependendo da análise pós-laser, a localização da lesão pode ou não ser crucial. Por exemplo,se uma imagem outubro deve ser obtido de todas as lesões, localização central em redor do nervo óptico é vital. Em contraste, se as lesões estão a ser analisado via plano de montagem, localização da lesão não é tão crucial. Finalmente, assegurar que os últimos tiros não são colocados muito próximos um do outro, ou então duas lesões podem &quot;crescer&quot; junto. O ensaio de CNV é um método robusto para estudar experimentalmente DMRI neovascular. A angiogénese resultante da indução de laser é semelhante na localização e aparência geral da angiogénese observada em pacientes humanos AMD. No entanto, está longe de ser um modelo perfeito. Ao contrário do olho humano, os ratos não têm uma mácula definido, ea angiogênese agudas devido a lesões visto no modelo CNV induzido por laser difere fundamentalmente da influência genética, patologia crônica da AMD 7,8,14. O ambiente da retina do rato é saudável e angiogênese resultante ocorre como uma reação ao trauma causado pelo impacto laser, em vez de genética / efatores e idade AMBIENTAL, como na AMD humana. Em contraste, o ambiente da retina humana em AMD é um estado de inflamação crónica, durante a qual anormalidades na expressão de VEGF e de outras citocinas causa CNV 3. Claramente, o desenvolvimento neovascular nestes dois ambientes é marcadamente diferente. Em conclusão, o protocolo de CNV induzido por laser é aquele que é inicialmente difícil de executar, mas, em última análise compensadora para mestre. A destreza fina necessária para segurar o mouse e lamela, bem como manipular a cabeça lamela e mouse para visualizar o nervo óptico são exercícios que exigem paciência e prática, especialmente desde que eles precisam para ser bem executada utilizando quer mãos do operador. No entanto, uma vez que a técnica é aprendido pode ser uma maneira eficiente de implementar CNV experimental e pode ser aplicado à maioria dos aspectos da investigação AMD neovascular.

Degeneração macular (AMD) relacionada com a idade é uma das principais causas de cegueira em indivíduos com idade superior a 50 3/1. AMD podem ser classificados em duas formas: atrófica (&quot;secar&quot;) e AMD neovascular (&quot;wet&quot;) AMD. O primeiro é caracterizada por atrofia geográfica do epitélio pigmentado da retina (RPE), coriocapilar, e fotorreceptores, enquanto o último é caracterizada pela invasão de vasos sanguíneos anormais a partir do coróide para as camadas externas retinianas provocando fugas, hemorragia, e fibrose, e, finalmente levando a cegueira 1,2. Das duas formas, DMRI neovascular representa a maioria da perda de visão 1. Felizmente, essa forma tem inúmeras opções eficazes de gestão farmacológicas, ao passo que o seu homólogo atrófica não tem comprovada tratamentos médicos 3. Além disso, porque a forma neovascular foi facilmente re-capituló num modelo animal, que tem sido mais amplamente acessível a um básicaPesquisa MD explorar os mecanismos patológicos subjacentes, a fim de desenvolver novas terapias 4. O primeiro modelo animal experimental de neovascularização coroidal (CNV) foi desenvolvido por Ryan et al. em primatas não humanos 5. Esta ruptura induzida modelo de membrana de Bruch através fotocoagulação por laser, o que provocou uma resposta inflamatória local na angiogénese resultante semelhante ao observado em DMRI neovascular. A progressão histopatológico de angiogênese indução de pós-laser foi encontrado para imitar neovascular AMD, que confirmou a validade do modelo 6. Os primatas não humanos oferecem a anatomia mais semelhantes aos seres humanos, mas, infelizmente, são caros de manter, não pode ser facilmente manipulado geneticamente, e tem um curso lento tempo de progressão da doença 7. Em contraste, os modelos de roedores são muito mais para manter a relação custo-eficácia, pode ser geneticamente manipulados com relativa facilidade, e têm um muito mais rápido course de progressão da doença (experiências pode ser conduzida numa escala de tempo de semanas contra meses). Estas experiências só devem ser realizados em roedores pigmentadas, uma vez que é muito difícil de visualizar em animais albinos. O modelo CNV induzido por laser do mouse, primeiro desenvolvido pelo grupo Campochiaro no final dos anos 90, 10, tem crescido a ser o modelo animal dominante na maioria dos estudos recentes 11-16. Devido à patogénese complexo e ainda não está claro da CNV, o modelo de laser foi aplicado em todos os aspectos da investigação AMD molhado variando de estudar os mecanismos moleculares que conduzem a angiogénese para avaliar novas modalidades de tratamento para futuro uso humano. Por exemplo, Sakurai et al. e Espinosa-Heidmann et ai. utilizado o modelo de laser para investigar o efeito de macrófagos no desenvolvimento de CNV utilizando ratinhos transgénicos e tratamentos farmacológicos exaustão 15, 16. Giani et ai. e Hoerster et ai. usado óptico de tomografia de coerência (OCT) para a imagem da CNV em um esforço para caracterizar a progressão da CNV e comparar os achados histopatológicos com os resultados vistos em outubro imagem 12,17 induzida por laser. Finalmente, estudos envolvendo injeção intravítrea de agentes anti-angiogênicos têm sido usados ​​como pré-requisitos para testes em humanos e foram vitais no desenvolvimento da primeira geração de agentes anti-VEGF utilizados na gestão de DMRI neovascular hoje 10,18,19. Modelos alternativos para CNV experimental utilizam métodos cirúrgicos para induzir a CNV. Este procedimento envolve a injecção de substâncias pró-angiogénicas (por exemplo, vectores virais recombinantes que sobre-expressam o VEGF, a injecção sub-retiniana de células EPR e / ou pérolas de poliestireno) para simular o aumento da expressão de VEGF na DMRI neovascular visto, com o objectivo de causar a angiogénese 8,20. No entanto, este método produz uma incidência drasticamente menor de neovascularização; estes estudos mostraram que na CNVC57 / BL6 ratos ocorre em 31% de injecções de 70% contra a taxa de sucesso ~ visto no método de fotocoagulação com laser na mesma estirpe de ratinhos 8,14. Por estas razões, e tendo em conta as vantagens do uso de roedores contra primatas não-humanos, o modelo de ratinho de CNV induzido por laser tornou-se o modelo animal padrão de CNV para a maioria experiências de estudo AMD neovascular 8. O olho do rato é um tecido minúsculo, delicado para trabalhar. Manobras do olho de visualizar a retina é difícil e requer muito prática até que seja alcançado o domínio. Esta tarefa é complicada pelo facto de que deve ser aprendido com a mão dominante e não-dominante. Além disso, após os movimentos finos necessários para visualizar a retina foram aprendidas, a coordenação entre ambas as mãos ea pedal operar o laser são importantes. Neste trabalho, buscou-se destilar os desafios de aprender todas as manipulações físicas envolvidas no CNV proc induzida por laseredure em um guia que iria ajudar as operadoras a alcançar o sucesso rápido com este modelo.

<table><tbody><tr><td>532 nm (green) argon ophthalmic laser</td><td>IRIDEX</td><td>GLx</td><td>any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used</td></tr><tr><td>slit lamp</td><td>Carl Zeiss</td><td>30SL-M</td><td>any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser</td></tr><tr><td>tribromoethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td>used to make anesthetic</td></tr><tr><td>tert-amyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>152463-1L</td><td>used to make anesthetic</td></tr><tr><td>amber glass vials + septa</td><td>Wheaton</td><td>WH-223696</td><td>tribromoethanol storage</td></tr><tr><td>tissue wipes</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td>miscellaneous&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1% Tropicamide</td><td>Falcon Pharmaceuticals</td><td>RXD2974251</td><td>pupillary dilation</td></tr><tr><td>0.5% Tetracaine hydrochloride</td><td>Alcon</td><td>&amp;nbsp;0065-0741-12</td><td>topical anesthesia</td></tr><tr><td>artificial tears</td><td>Alcon</td><td>&amp;nbsp;58768-788-25</td><td>hydration</td></tr><tr><td>heat therapy pump (for animal warming)</td><td>Kent Scientific</td><td>HTP-1500</td><td>used to maintain animal body temp</td></tr><tr><td>warming pad</td><td>Kent Scientific</td><td>TPZ-0510EA</td><td>maintains animal body temperature</td></tr><tr><td>30 G insulin needles</td><td>BD</td><td>328418</td><td>IP anesthesia injection</td></tr><tr><td>scale</td><td>American Weigh Scale</td><td>AWS-1KG-BLK</td><td>mouse weighing</td></tr><tr><td>cover slip (25 mm x 25 mm)</td><td>VWR</td><td>48366089</td><td>flatten cornea to visualize mouse retina</td></tr><tr><td>xylazine</td><td>obtained from institution</td><td>obtained from institution</td><td>anesthesia</td></tr><tr><td>ketamine</td><td>obtained from institution</td><td>obtained from institution</td><td>anesthesia</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>used for volumetric re-construction</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>used for image analysis</td></tr></tbody></table>

a mouse model for laser-induced choroidal neovascularization

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch&#8217;s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD. 
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects. 
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Quantificação de lesões de NVC pode ser realizado através da análise da coróide planas montadas usando coloração por imunofluorescência para rotular os vasos NVC. Os dois métodos mais utilizados de preparação do tecido são rotulagem FITC-dextrano, feito através de perfusão imediatamente antes do sacrifício animal, ou post-mortem imuno-coloração com um marcador de células endoteliais. Ambos os métodos foram descritos anteriormente em detalhe 13,14,21; figuras 1 e 2 mostram exemplos de cada um deles, respectivamente. Após a aquisição das imagens de microscopia confocal, qualquer área (2-Dimensões) ou volume (3-dimensões) pode ser calculada e visualizada com o software ImageJ ou Volocity. Além de quantificação, OCT pode ser usado para visualização da lesão CNV in vivo. Um exemplo de uma imagem em corte transversal da retina com resultante CNV é mostrado na Figura 3. <img a<html> lt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53502 / 53502fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1:. CNV Perfusão Coloração &amp; Área (2D) Exemplo de Cálculo (25X) (A) FITC dextrano perfusão lesão CNV. Método de quantificação (B) área ImageJ via limiar. Rato Strain:. C57BL / 6J <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53502/53502fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53502/53502fig2.jpg" /> Figura 2: CNV Immunostaining &amp; Volume (3D) Exemplo de cálculo (25X) (A) isolectin GS-IB4 manchado lesão CNV.. (B) a reconstrução 3D de lesão CNV en vista rosto. Vista lateral (C) reconstrução 3D (B e C uma largura tile = 35 mm). Estirpe de ratinho: C57BL / 6J.&quot;target =&quot; _ blank g2large.jpg &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53502/53502fig3.jpg" /> Figura 3:. Outubro Transversais CNV Visualization (A) outubro en vista face da lesão CNV. (B) outubro transversal B-scan de retina com CNV circulados em amarelo. Rato Strain:. C57BL / 6J <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53502/53502fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Um modelo de rato para induzida por laser coróide Neovascularização

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

a-mouse-model-for-laser-induced-choroidal-neovascularization

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

17.5K visualizações.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Vídeo: A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

Laser-Induced Chronic Ocular Hypertension Model on SD Rats

Glaucoma is one of the major causes of blindness in the world. Elevated intraocular pressure is a major risk factor. Laser photocoagulation induced ocular hypertension is one of the well established animal models. This video demonstrates how to induce ocular hypertension by Argon laser photocoagulation in rat.

Glaucoma is one of the major causes of blindness in the world. Elevated intraocular pressure is a major risk factor. Laser photocoagulation induced ocular hypertension is one of the well established animal models. This video demonstrates how to induce ocular hypertension by Argon laser photocoagulation in rat.

Laser-Induced Ocular Modelo Hipertensão crônica em ratos SD

Glaucoma is one of the major causes of blindness in the world. Elevated intraocular pressure is a major risk factor. Laser photocoagulation induced ocular ...

Biologia

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

Um modelo de rato induzida por laser de crônica Ocular Hypertension para Caracterizar defeitos visuais

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Medicina

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the cornea, which can be caused by trauma, keratoplasty or infectious disease, breaks down the so called &lsquo;angiogenic privilege' of the cornea and forms the basis of multiple visual pathologies that may even lead to blindness. Although there are several treatment options available, the fundamental medical need presented by corneal neovascular pathologies remains unmet. In order to develop safe, effective, and targeted therapies, a reliable model of corneal NV and pharmacological intervention is required. Here, we describe an alkali-burn injury corneal neovascularization model in the mouse. This protocol provides a method for the application of a controlled alkali-burn injury to the cornea, administration of a pharmacological compound of interest, and visualization of the result. This method could prove instrumental for studying the mechanisms and opportunities for intervention in corneal NV and other neovascular disorders.

Neovascularization (NV) of the cornea can complicate multiple visual pathologies. Utilizing a controlled, alkali-burn injury model, a quantifiable level of corneal NV can be produced for mechanistic study of corneal NV and evaluation of potential therapies for neovascular disorders.

Um ferimento Modelo Alkali queima de córnea neovascularização no Rato

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, difficulties in observing posterior choroidal melanoma in vivo limit tumor location and growth evaluation in real-time. The approach described here optimizes techniques for establishing choroidal melanoma in mice via a multi-step sub-choroidal B16LS9 cell injection procedure. To enable precision in injecting into the small dimensions of the mouse uvea, the complete procedure is performed under a microscope. First, a conjunctival peritomy is formed in the dorsal-temporal area of the eye. Then, a tract into the sub-choroidal space is created by inserting a needle through the exposed sclera. This is followed by the insertion of a blunt needle into the tract and the injection of melanoma cells into the choroid. Immediately after injection, noninvasive optical coherence tomography (OCT) imaging is utilized to determine tumor location and progress. Retinal detachment is evaluated as a predictor of tumor site and size. The presented method enables the reproducible induction of choroid-localized melanoma in mice and the live imaging of tumor growth evaluation. As such, it provides a valuable tool for studying intraocular tumors.

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

The present protocol describes the implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid utilizing optical coherence tomography.

Implantação e Avaliação do Melanoma na Coroide Murina via Tomografia de Coerência Óptica

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Pesquisa do câncer

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

Na Vivo Imagiologia multimodal e análise do modelo de neovascularização coroide de induzida por Laser de Mouse

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

Neurociência

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a detailed method pointing out critical steps is provided with recommendations for optimization to achieve consistently successful occlusion rates across different genetically modified mouse strains. The RVO mouse model consists primarily of the intravenous administration of a photosensitizer dye followed by laser photocoagulation using a retinal imaging microscope attached to an ophthalmic guided laser. Three variables were identified as determinants of occlusion consistency. By adjusting the wait time after rose bengal administration and balancing the baseline and experimental laser output, the variability across experiments can be limited and a higher success rate of occlusions achieved. This method can be used to study retinal diseases that are characterized by retinal edema and hypoxic-ischemic injury. Additionally, as this model induces vascular injury, it can also be applied to study the neurovasculature, neuronal death, and inflammation.

Here, we describe an optimized protocol for retinal vein occlusion using rose bengal and a laser-guided retinal imaging microscope system with recommendations to maximize its reproducibility in genetically modified strains.

Otimização do Modelo de Oclusão de Veia da Retina em Camundongo para Limitar a Variabilidade

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images from which the retinal thickness can be calculated. Although OCT is widely used in clinical practice, its application in basic research is not as prevalent, especially in small animals such as mice. Because of the small size of their eyeballs, it is challenging to conduct fundus imaging examinations in mice. Therefore, a specialized retinal imaging system is required to accommodate OCT imaging on small animals. This article demonstrates a small-animal-specific system for OCT examination procedures and a detailed method for image analysis. The results of retinal OCT examination of very-low-density lipoprotein receptor (Vldlr) knockout mice and C57BL/6J mice are presented. The OCT images of C57BL/6J mice showed retinal layers, while those of Vldlr knockout mice showed subretinal neovascularization and retinal thinning. In summary, OCT examination could facilitate the noninvasive detection and measurement of retinopathy in mouse models.

Here, we describe an in vivo imaging technique using optical coherence tomography to facilitate the diagnosis and quantitative measurement of retinopathy in mice.

Aplicação da Tomografia de Coerência Óptica a um Modelo de Retinopatia de Rato

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images ...

Image-Guided Optical Coherence Tomography to Assess Structural Changes in Rodent Retinas

Ocular diseases, such as age-related macular degeneration, glaucoma, retinitis pigmentosa, and uveitis, are always accompanied by retinal structural changes. These diseases affecting the fundus always exhibit typical abnormalities in certain cell types in the retina, including photoreceptor cells, retinal ganglion cells, cells in the retinal blood vessels, and cells in the choroidal vascular cells. Noninvasive, highly efficient, and adaptable imaging techniques are required for both clinical practice and basic research. Image-guided optical coherence tomography (OCT) satisfies these requirements because it combines fundus photography and high-resolution OCT, providing an accurate diagnosis of tiny lesions as well as important changes in the retinal architecture. This study details the procedures of data collection and data analysis for image-guided OCT and demonstrates its application in rodent models of choroidal neovascularization (CNV), optic nerve crush (ONC), light-induced retinal degeneration, and experimental autoimmune uveitis (EAU). This technique helps researchers in the eye field to identify rodent retinal structural changes conveniently, reliably, and tractably.

The protocol presented here details the procedures of data collection and data analysis for image-guided optical coherence tomography (OCT) and demonstrates its application in multiple rodent models of ocular diseases.

Ocular diseases, such as age-related macular degeneration, glaucoma, retinitis pigmentosa, and uveitis, are always accompanied by retinal structural ...

Caracterização de diferentes tipos de lesões de CNV induzida por laser em camundongos

Characterization of Vascular Morphology of Neovascular Age-Related Macular Degeneration by Indocyanine Green Angiography

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of blindness among older individuals, and its prevalence is rapidly increasing due to the aging population. Choroidal neovascularization (CNV) or wet AMD, which accounts for 10%-20% of all AMD cases, is responsible for an alarming 80%-90% of AMD-related blindness. Current anti-VEGF therapies show suboptimal responses in approximately 50% of patients. Resistance to anti-VEGF treatment in CNV patients is often associated with arteriolar CNV, while responders tend to have capillary CNV. While fluorescein angiography (FA) is commonly used to assess leakage patterns in wet AMD patients and animal models, it does not provide information about CNV vascular morphology (arteriolar CNV vs. capillary CNV). This protocol introduces the use of indocyanine green angiography (ICGA) to characterize lesion types in laser-induced CNV mouse models. This method is crucial for investigating the mechanisms and treatment strategies for anti-VEGF resistance in wet AMD. It is recommended to incorporate ICGA alongside FA for comprehensive assessment of both leakage and vascular features of CNV in mechanistic and therapeutic studies.

Autor em destaque: Superando a resistência anti-VEGF por meio da avaliação avançada da morfologia vascular na neovascularização coroidal

Currently, fluorescein angiography (FA) is the preferred method for identifying leakage patterns in animal models of choroidal neovascularization (CNV). However, FA does not provide information about vascular morphology. This protocol outlines the use of indocyanine green angiography (ICGA) to characterize different lesion types of laser-induced CNV in mouse models.

Caracterização da morfologia vascular da degeneração macular relacionada à idade neovascular pela angiografia com indocianina verde

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of blindness among older individuals, and its prevalence is rapidly increasing due to the aging ...

Um modelo de rato para induzida por laser coróide Neovascularização

Resumo

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Laser-Induced Ocular Modelo Hipertensão crônica em ratos SD

Um modelo de rato induzida por laser de crônica Ocular Hypertension para Caracterizar defeitos visuais

Um ferimento Modelo Alkali queima de córnea neovascularização no Rato

Implantação e Avaliação do Melanoma na Coroide Murina via Tomografia de Coerência Óptica

Na Vivo Imagiologia multimodal e análise do modelo de neovascularização coroide de induzida por Laser de Mouse

Otimização do Modelo de Oclusão de Veia da Retina em Camundongo para Limitar a Variabilidade

Aplicação da Tomografia de Coerência Óptica a um Modelo de Retinopatia de Rato

Image-Guided Optical Coherence Tomography to Assess Structural Changes in Rodent Retinas

Caracterização da morfologia vascular da degeneração macular relacionada à idade neovascular pela angiografia com indocianina verde

Caracterização da morfologia vascular da degeneração macular relacionada à idade neovascular pela angiografia com indocianina verde