Name: a mouse model for laser-induced choroidal neovascularization
Uploaded: 2015-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization at JoVE.com

The authors would like to acknowledge Jonathan Chou, MD for his assistance on preparation and editing of the final manuscript and Wenzhong Liu for the OCT data. We would also like to acknowledge support from the Macula Society Research Grant (AAF), support from an unrestricted grant to Northwestern University from Research to Prevent Blindness, Inc., New York, NY, USA, and support from NIH-EY019951.

Tutti gli animali sono trattati in conformità con la guida della cura e l&#39;uso di animali da laboratorio 2013 Edition, l&#39;Associazione per la Ricerca e la Visione e Ophthalmology (ARVO) Dichiarazione per l&#39;uso di animali in Oftalmica e Vision Research, e approvato dal Animal Istituzionale Cura e Comitato Usa per la Northwestern University. Nota: La seguente procedura può essere eseguita interamente con un operatore; tuttavia, è molto più efficiente condotto con due operatori ai compiti divisi conseguenza. 1. Preparare stazione laser e pre-laser <ol><li> Posizionare il laser e lampada a fessura dove può essere facilmente accessibile. Accendere il laser e impostato su parametri pre-determinato (ad esempio, 75 dimensioni micron posto, 100 mW di potenza, 100 durata msec). ATTENZIONE: Assicurarsi operatore porta tutti i segni di sicurezza laser animale e dispositivi di protezione individuale e pertinente sicurezza laser vengono visualizzati al di fuori della stanza procedimento. <ol><li> Prima di utilizzare eventuali animali da esperimento, trovare parametri ideali utilizzando una calibrazione, mouse non sperimentale. Parametri laser dipenderanno dal laser utilizzato. Parametri ideali sono definiti dall&#39;impostazione potenza del laser più basso che provoca costantemente la formazione di &quot;bolla&quot; se correttamente a fuoco. Guarda il video per esempio di lesione con una corretta &quot;bolla&quot; di formazione. </li></ol></li><li> Preparare la stazione di pre-laser in modo che l&#39;anestesia, animale più caldo, salviette di tessuto, e tutte le gocce per gli occhi (tropicamide, tetracaina, e lacrime artificiali) sono facilmente a portata di mano all&#39;operatore. <ol><li> Assicurarsi che animale caldo viene preriscaldata per correggere la temperatura (37 ° C) prima dell&#39;iniezione di anestetico in primo mouse per evitare l&#39;ipotermia indotta anestesia. </li></ol></li><li> Posizionare fase mouse su più caldo in modo che possa trattenere il calore e rimanere al caldo una volta procedura laser inizia. </li></ol> 2. Topo Anestesia e preparazione pre-laser <ol><li> Prima di iniettareing anestesia, ispezionare l&#39;occhio macroscopicamente per assicurarsi che non ci sono malformazioni o anomalie che diminuiscono la chiarezza della cornea (es cataratta). </li><li> Pesare mouse. </li><li> Record peso, il sesso, e il numero ID animale. </li><li> Utilizzando peso, calcolare giusta quantità di anestetico da utilizzare sulla base di indicazioni fornite da istituto (ad esempio 100 mg / kg di ketamina cloridrato, 10 mg / xylazina kg O tribromoethanol 250 mg / kg; per un 20 g di mouse iniettare 0,20 ml xilazina / ketamina cocktail O 0,25 ml di tribromoethanol). Avere una tabella di dosaggi precalcolati per peso in incrementi di 1 g, al fine di ridurre gli errori matematici. </li><li> Scruff mouse e iniettare anestetico per via intraperitoneale basano su calcoli al punto 2.4. </li><li> Posizionare il mouse su animali più caldo e aspettare fino a quando il mouse è completamente anestetizzato controllando il riflesso pedale via pizzico piedi (circa 3-5 minuti). </li><li> Arrotolate un tessuto pulire e proteggere zona nasale del mouse per evitare che aspirationi di liquido di roll-off. Mouse rotolo su un lato e una goccia (circa 30 ml) di tetracaina cloridrato in ciascun occhio per l&#39;anestesia topica. Attendere 2 minuti per soluzione abbia effetto. </li><li> Ripetere il passaggio 2.7 con una goccia di Tropicamide d&#39;attualità per dilatazione pupillare. In alternativa, utilizzare fenilefrina cloridrato (2,5%) per la dilatazione. </li><li> Attendere 2 minuti per le soluzioni per rendere effettive; tenere animali su più caldo durante questo periodo. </li><li> Trascorso il tempo necessario, posizionare rapidamente il mouse sul palco del mouse e posizionare il palcoscenico sul mento resto della lampada a fessura. </li><li> Accendere lampada a fessura per la luminosità della luce più bassa e verificare il grado di dilatazione pupillare. Se alunno non è adeguatamente dilatato (circa 2,5-3 mm), tornare mouse per animali più caldo e aspettare. In alternativa, l&#39;amministrazione un&#39;altra goccia di Tropicamide. Una volta che l&#39;occhio è sufficientemente dilatato, passare alla procedura laser. </li></ol> 3. Procedura Laser Nota: assicurarsi altri persone nella stanza indossare occhiali protettivi quando si è lontani da protetto laser lampada a fessura oculare <ol><li> Regolare la posizione del mouse sul mouse fase, in modo che sia in posizione ideale per la visualizzazione del nervo ottico (vedi 3.1.2). <ol><li> Orientare il mouse sul supporto in modo che è orizzontale, perpendicolare al fascio lampada a fessura, con la testa da un lato e la coda all&#39;altra. Posizionamento ideale del mouse farà la visualizzazione del nervo ottico molto più facile una volta che viene applicato vetrino. </li><li> Ruotare leggermente il mouse quindi è ad un angolo di 170 ° ~ con la testa più vicino all&#39;operatore laser. </li><li> Assicurarsi che il mouse sia il più vicino possibile lampada a fessura, ma ancora in una posizione in cui è stabile e dove la mano dell&#39;operatore avrà spazio sufficiente per la manipolazione fine. </li></ol></li><li> Dopo che il mouse è in posizione ideale, mettete una goccia di soluzione di lacrima artificiale su un x 25 mm coprioggetto vetro da 25 mm. <ol><li> Mettere una goccia di soluzione di lacrime artificiali sul opp del topoocchio osite - questo occhio assicurerà è idratata e la formazione di aiuto ritardo di cataratta. </li></ol></li><li> Tenere angolo del vetrino tra il pollice e le dita puntatore; posizione in modo che il vetro viene schiacciato tra punte di entrambe le dita. </li><li> Avvolgere delicatamente le altre tre dita intorno corpo dell&#39;animale per il sostegno e la stabilizzazione mano. Posizione della mano in modo che il vetrino di vetro può essere facilmente posizionato sul occhio del mouse. <ol><li> Assicurarsi che il polso è stabilizzato su una superficie stabile in modo da ridurre il tremore della mano. </li></ol></li><li> Una volta ottenuta la posizione stabile, premere delicatamente coprioggetto in vetro (con goccia di lacrima artificiale ancora aderito) sul occhio del mouse. <ol><li> Assicurarsi che il vetrino sia posizionato il più possibile perpendicolare al fascio laser al fine di evitare fascio laser dispersione o riflessione. Il vetrino agisce come una lente a contatto per appiattire la cornea. </li></ol></li><li> Guardare attraverso lampada a fessura e con la mano libera ginocchiera concentrarsi untIL retina possono essere visualizzati. La retina avrà un / colore rosso giallo chiaro a seconda della posizione visualizzato, distinti, vasi rossi saranno visibili. </li><li> Lentamente e con attenzione manipolare testa mouse e / o coprioggetto fino a visualizzare il nervo ottico. Il nervo ottico sarà di colore giallo con più navi che si irradiano da esso. </li><li> Una volta operatore ha confermato la visualizzazione di nervo ottico, accendere il laser focalizzazione del fascio. </li><li> Una volta fascio laser è stata accesa, manovrare laser focalizzazione del fascio nella posizione desiderata (circa 1 diametro del disco del nervo ottico). </li><li> Fuoco del raggio laser sul RPE del fondo dell&#39;occhio. Messa a fuoco appropriata si ottiene con il raggio laser più nitida e chiara. Se l&#39;obiettivo fascio appare ovale o fuori fuoco, ginocchiera fuoco lampada a fessura o riposizionare vetro coprioggetto. </li><li> Una volta che il fascio di puntamento è focalizzata sulla RPE, avviare somministrazione laser utilizzando grilletto piede del laser. <ol><li> Essere sicuri di evitare vasi retinici per prevenire intraoculare luimorrhage. </li></ol></li><li> Osservare per la comparsa di una bolla subito dopo la somministrazione laser. Il contorno del tiro laser dovrebbe essere chiara e non confuso in alcun modo. <ol><li> Se il colpo del laser non provoca la formazione di bolle, o area di impatto sembra confuso (aspetto torbido con mal definito confine circolare contro chiaro, confine ben definito di un impatto di successo), o se l&#39;emorragia è visto dopo la somministrazione del laser, non lo fanno includere queste lesioni per le analisi future. </li></ol></li><li> Ripetere i passaggi 3,10-3,12 per tutte le posizioni volute CNV (di solito a 3, 6, 9, e 12 posizioni intorno nervo ottico). Se induzioni laser sono applicati a circa stessa distanza dal nervo ottico, rifocalizzazione non dovrebbe essere necessario. Tuttavia, a causa del forte curvatura dell&#39;occhio mouse e piccole variazioni che possono esistere nella retina, ricentrare la trave può essere necessario tra le amministrazioni laser consecutivi. </li><li> Record in un notebook della posizione e risultato di postaamministrazione tiro laser ach e risultato (buon fine, nebbioso, emorragia, ecc.) di ogni colpo somministrato per l&#39;occhio. Assicurarsi di posizionare il laser in modalità stand-by quando non è in uso. </li><li> Ripetere 3,1-3,14 per altro occhio del mouse, se necessario, utilizzando la mano opposta per la stabilizzazione e un nuovo vetrino. </li><li> Dopo che tutti i colpi di laser desiderati vengono somministrati, spegnere laser e lampada a fessura. </li><li> Eliminare vetrino e posto del mouse su più caldo per il recupero dall&#39;anestesia. Macroscopicamente ispezionare occhio per eventuali infortuni e una goccia di soluzione di lacrime artificiali per mantenere l&#39;occhio idratato e potenzialmente impedire il futuro sviluppo della cataratta. Una volta che il mouse si riprende dall&#39;anestesia, tornare alla gabbia. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td></td><td> AVERTIN </td><td> AVERTIN </td><td> AVERTIN </td><td> XYL / KET </td><td> XYL / KET </td></tr><tr><td> Mouse Peso (g) </td><td> Dose (mg / kg) </td><td&gt; Soluzione Concentrazione (mg / ml) </td><td> Anestetico Dose (ml) </td><td> Dose (mg / kg) </td><td> Anestetico Dose (ml) </td></tr><tr><td> 15 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.1875 </td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> 16 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.2 </td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.16 </td></tr><tr><td> 17 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2125 </td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> 18 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.225 </td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.18 </td></tr><tr><td> 19 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2375 </td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.19 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.25</td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> 21 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2625 </td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.21 </td></tr><tr><td> 22 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,275 </td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.22 </td></tr><tr><td> 23 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,2875 </td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.23 </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.3 </td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,3125 </td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.25 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,325 </td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.26 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 250 </td><td&gt; 20 </td><td> 0,3375 </td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.27 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.35 </td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.28 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0,3625 </td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.29 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 250 </td><td> 20 </td><td> 0.375 </td><td> 100 mg / kg di ketamina; 10 mg / kg xilazina </td><td> 0.3 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: XyIKet Dosaggio Chart.

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The authors declare they have no competing financial interests.

Ci sono diversi fattori che possono influenzare la consegna del laser e conseguente sviluppo CNV dopo il successo del laser-induzione. Questi fattori devono essere controllati e standardizzati per avere i risultati più affidabili. Il più pertinente di questi fattori sono la selezione del mouse (genotipo, età e sesso), la selezione anestetico, e le impostazioni di laser. Il modello di topo specifico utilizzato può avere un effetto significativo sul corso dello sviluppo CNV. Il genotipo più utilizzato è il topo C57BL / 6. Il venditore da cui provengono gli animali può influenzare la dimensione risultante CNV. Povera et al. dimostrato differenze significative nella finale formato CNV in C57BL / 6 topi da Jackson, Charles Rivers, e laboratori Taconic, con i topi da Taconic in via di sviluppo significativamente più grande CNV rispetto alle altre due vendor 4. Pertanto, l&#39;acquisto da una società e l&#39;utilizzo di tutti i topi dallo stesso fornitore aiuterà a ridurre al minimo le differenze esternein CNV dimensione della lesione. L&#39;età e il sesso del topo è stato anche dimostrato di essere un fattore importante da considerare quando si progetta l&#39;esperimento. Topi di sesso femminile sviluppano più CNV di topi maschi della stessa età, e topi anziani di entrambi i sessi sviluppano più CNV di giovani topi 22,23. A seconda dei parametri sperimentali, gli operatori dovrebbero tenere a mente questi fattori. Ad esempio, se gli operatori utilizzano la procedura laser-CNV a chiarire scopi meccanicistici e droga-sviluppo, di entrambi i sessi in età diverse dovrebbero essere utilizzati per definire i meccanismi che sono specifici per i due sessi e quelle che non lo sono. Anestesia adeguata è un passaggio critico per questa procedura, in particolare durante il processo di apprendimento. La maggior parte dei IACUC regimi approvati possono indurre l&#39;anestesia per almeno 15-30 minuti, che è più che sufficiente tempo per fornire 4-5 colpi di laser a ciascun occhio una volta che la procedura è stato masterizzato. Tuttavia, se troppo tempo è trascorso, l&#39;anestesia può portare a opacizzazione della lente reversibili, rendering l&#39;occhio otticamente impervio per sperimentale CNV 24. I due protocolli principali utilizzati per indurre l&#39;anestesia sono un xilazina / ketamina cocktail o tribromoethanol (TBE) consegnati per via intraperitoneale. Sebbene alcuni rapporti pongono i vantaggi di TBE a xilazina / ketamina in termini di formazione della cataratta, sia eventualmente provocare lo sviluppo di una lente torbida se l&#39;operatore non funziona rapidamente 14. Un modo per estendere il tempo prima dello sviluppo della cataratta è quello di mantenere l&#39;idratazione dell&#39;occhio, come indicato nel protocollo dettagliato, attraverso l&#39;applicazione di lacrime artificiali 25. Questo metodo, a prescindere dalla sostanza anestetico usato, dovrebbe aiutare a ritardare la formazione della cataratta e dare all&#39;operatore più tempo per completare la procedura. Impostazioni laser possono essere un fattore importante nell&#39;induzione affidabile di CNV. Calibrare la potenza del laser e la durata sono un importante passo preliminare prima di effettuare la procedura su animali da esperimento. Colpi laserche causa emorragia o sono fuori fuoco, senza formazione di bolle dovrebbero essere escluse dal calcolo, come questo interrompe il processo di sviluppo CNV. Se più navi sono rotti causando emorragia diffuso, dovrebbe essere esclusa l&#39;intero occhio. Idealmente, la potenza più bassa e la durata più breve dei laser che rompe costantemente membrana di Bruch causando la formazione di bolle e una lesione con netta demarcazione devono essere utilizzati 4. Protocolli che sperimentano con impostazioni di potenza differenti hanno dimostrato che maggiore potenza e durata provocare danni tissutali eccessivo e tassi più bassi di formazione, successivamente CNV 4, 14,17. Inoltre, la posizione della lesione laser può anche influenzare lo sviluppo CNV. Impatti consegnati circa 1 diametro del disco (DD) dal disco ottico ceduto zona significativamente più grandi volumi CNV di quelli consegnati distanza 23 &lt;1 DD o 2 o più DD. A seconda della analisi post-laser, posizione lesione può o non può essere cruciale. Per esempio,se un&#39;immagine PTOM da ottenere di tutte le lesioni, posizione centrale attorno al nervo ottico è vitale. Contrastingly, se le lesioni sono da analizzare tramite piano di montaggio, la posizione della lesione non è così cruciale. Infine, garantire che ultimi scatti non siano troppo vicini l&#39;uno all&#39;altro oppure due lesioni possono &quot;crescere&quot; insieme. Il saggio CNV è un metodo affidabile per studiare sperimentalmente AMD neovascolare. L&#39;angiogenesi risultante dalla induzione laser è simile in posizione e l&#39;aspetto complessivo alla angiogenesi osservata in pazienti AMD umani. Tuttavia, non è affatto un modello perfetto. A differenza dell&#39;occhio umano, i topi non hanno una macula definita, e l&#39;angiogenesi lesioni legate acuta visto nel modello CNV indotta da laser sostanzialmente diversa da quella geneticamente influenzato, patologia cronica di AMD 7,8,14. L&#39;ambiente retinica mouse è sano e angiogenesi risultante si verifica come reazione al trauma causato dall&#39;impatto laser, piuttosto che genetica / eFattori AMBIENTALI e l&#39;età, come in AMD umano. Contrastingly, l&#39;ambiente della retina umana in AMD è in uno stato di infiammazione cronica, durante il quale anomalie in VEGF e altre citochine causano CNV 3. Chiaramente, lo sviluppo neovascolare in questi due ambienti è notevolmente diversa. In conclusione, il protocollo CNV indotta da laser è uno che è inizialmente difficile da eseguire ma alla fine gratificante master. La multa destrezza necessaria per tenere il mouse e vetrino, così come manipolare la testa vetrino e il mouse per visualizzare il nervo ottico sono esercizi che richiedono pazienza e pratica, tanto più che hanno bisogno di essere eseguito bene utilizzando sia mani dell&#39;operatore. Tuttavia, una volta che la tecnica si impara può essere un modo efficace per implementare CNV sperimentale e può essere applicato a molti aspetti della ricerca AMD neovascolare.

Età degenerazione maculare (AMD) è una delle principali cause di cecità negli individui di età superiore ai 50 1-3. AMD possono essere classificati in due forme: atrofica (&quot;a secco&quot;) e AMD neovascolare (&quot;wet&quot;) di AMD. La prima è caratterizzata da atrofia geografica dell&#39;epitelio pigmentato retinico (RPE), coriocapillare e fotorecettori, mentre il secondo è caratterizzato dalla invasione dei vasi anomali della coroide negli strati retinici esterni causando perdite, emorragia, e la fibrosi, e in ultima analisi, porta alla cecità 1,2. Delle due forme, AMD neovascolare rappresenta la maggior parte della perdita della vista 1. Fortunatamente, questa forma ha numerose opzioni efficaci per la gestione farmacologica, mentre la sua controparte atrofica attualmente con dimostrato trattamenti medici 3. Inoltre, perché la forma neovascolare è stato facilmente ri-capitolò in un modello animale, è stato più ampiamente accessibili a un baseRicerca MD esplorare i meccanismi patologici alla base per lo sviluppo di nuove terapie 4. Il primo modello animale di neovascolarizzazione coroidale sperimentale (CNV) è stato sviluppato da Ryan et al. nei primati non umani 5. Questo modello di rottura indotta della membrana di Bruch con la fotocoagulazione laser, che ha causato una risposta infiammatoria locale con conseguente angiogenesi simile a quello visto in AMD neovascolare. La progressione istopatologica dell&#39;angiogenesi induzione post-laser è stato trovato per imitare AMD neovascolare, che ha confermato la validità del modello 6. Primati non umani offrire l&#39;anatomia più simili agli esseri umani, ma purtroppo, sono costosi da mantenere, non può essere facilmente manipolati geneticamente, e hanno un decorso lento della progressione della malattia 7. Contrastingly, modelli di roditori sono molto più costo-efficace per mantenere, può essere geneticamente manipolati con relativa facilità, e hanno un molto più veloce course di progressione della malattia (esperimenti possono essere condotti su una scala temporale di settimane rispetto a mesi). Questi esperimenti dovrebbero essere condotti solo in roditori pigmentati in quanto è molto difficile da visualizzare in animali albini. Il modello di CNV mouse laser-indotta, sviluppato dal gruppo di Campochiaro alla fine degli anni 90 del 10, è cresciuto fino a essere il modello animale dominante nella maggior parte dei recenti studi 11-16. A causa della patogenesi complessa e ancora chiaro di CNV, il modello laser è stato applicato in tutti gli aspetti della ricerca AMD umida che vanno dallo studio dei meccanismi molecolari dell&#39;angiogenesi guida per valutare nuove modalità di trattamento per il futuro uso umano. Ad esempio, Sakurai et al. e-Espinosa Heidmann et al. utilizzato il modello laser per studiare l&#39;effetto di macrofagi sullo sviluppo di CNV utilizzando topi transgenici e trattamenti farmacologici deplezione 15, 16. Giani et al. e Hoerster et al. usato ottica tomografia a coerenza (OCT) per l&#39;immagine del CNV, nel tentativo di caratterizzare la progressione della CNV e confrontare i risultati istopatologici i risultati visti in ottobre di imaging 12,17 indotta da laser. Infine, gli studi che coinvolgono iniezione intravitreale di agenti anti-angiogenici sono stati usati come prerequisiti per la sperimentazione umana e sono stati di vitale importanza nello sviluppo della prima generazione di agenti anti-VEGF utilizzate nella gestione di DMLE neovascolare oggi 10,18,19. Modelli per CNV sperimentale alternativi utilizzano metodi chirurgici per indurre CNV. Questa procedura comporta l&#39;iniezione di sostanze pro-angiogenici (ad esempio vettori virali ricombinanti overexpressing VEGF, iniezione sottoretinica di cellule RPE e / o perline di polistirene) per imitare l&#39;aumentata espressione di VEGF visto in DMLE neovascolare, con l&#39;obiettivo di causare angiogenesi 8,20. Tuttavia, questo metodo si ottiene un drasticamente minore incidenza di neovascolarizzazione; questi studi hanno dimostrato che in CNVC57 / BL6 topi si verifica nel 31% delle iniezioni rispetto al tasso di successo ~ 70% visto nel metodo fotocoagulazione laser nello stesso ceppo di topi 8,14. Per queste ragioni, e dati i vantaggi dell&#39;utilizzo di roditori rispetto a primati non umani, il modello murino di indotta da laser CNV è diventato il modello animale standard CNV per la maggior parte neovascolare esperimenti di studio AMD 8. L&#39;occhio mouse è un minuscolo, delicato dei tessuti con cui lavorare. Manovre dell&#39;occhio per visualizzare la retina è difficile e richiede molta pratica fino a raggiungere la padronanza. Questo compito è complicato dal fatto che deve essere appreso con la mano dominante e non dominante. Inoltre, dopo che i movimenti fini richieste per visualizzare la retina sono stati tratti, il coordinamento tra entrambe le mani e il pedale funzionamento del laser sono importanti. In questo lavoro, abbiamo cercato di distillare le sfide di apprendimento di tutte le manipolazioni fisiche coinvolte nel indotta da laser CNV procedure in una guida che avrebbe aiutato gli operatori a raggiungere un rapido successo con questo modello.

<table><tbody><tr><td>532 nm (green) argon ophthalmic laser</td><td>IRIDEX</td><td>GLx</td><td>any ophthalmic 532 nm (green) argon laser can be used</td></tr><tr><td>slit lamp</td><td>Carl Zeiss</td><td>30SL-M</td><td>any slit lamp can be used as long as it is compatible with the laser</td></tr><tr><td>tribromoethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td>used to make anesthetic</td></tr><tr><td>tert-amyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>152463-1L</td><td>used to make anesthetic</td></tr><tr><td>amber glass vials + septa</td><td>Wheaton</td><td>WH-223696</td><td>tribromoethanol storage</td></tr><tr><td>tissue wipes</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td>miscellaneous&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1% Tropicamide</td><td>Falcon Pharmaceuticals</td><td>RXD2974251</td><td>pupillary dilation</td></tr><tr><td>0.5% Tetracaine hydrochloride</td><td>Alcon</td><td>&amp;nbsp;0065-0741-12</td><td>topical anesthesia</td></tr><tr><td>artificial tears</td><td>Alcon</td><td>&amp;nbsp;58768-788-25</td><td>hydration</td></tr><tr><td>heat therapy pump (for animal warming)</td><td>Kent Scientific</td><td>HTP-1500</td><td>used to maintain animal body temp</td></tr><tr><td>warming pad</td><td>Kent Scientific</td><td>TPZ-0510EA</td><td>maintains animal body temperature</td></tr><tr><td>30 G insulin needles</td><td>BD</td><td>328418</td><td>IP anesthesia injection</td></tr><tr><td>scale</td><td>American Weigh Scale</td><td>AWS-1KG-BLK</td><td>mouse weighing</td></tr><tr><td>cover slip (25 mm x 25 mm)</td><td>VWR</td><td>48366089</td><td>flatten cornea to visualize mouse retina</td></tr><tr><td>xylazine</td><td>obtained from institution</td><td>obtained from institution</td><td>anesthesia</td></tr><tr><td>ketamine</td><td>obtained from institution</td><td>obtained from institution</td><td>anesthesia</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>used for volumetric re-construction</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>used for image analysis</td></tr></tbody></table>

a mouse model for laser-induced choroidal neovascularization

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) research. By administering targeted laser injury to the RPE and Bruch&#8217;s membrane, the procedure induces angiogenesis, modeling the hallmark pathology observed in neovascular AMD. 
First developed in non-human primates, the laser-induced CNV model has come to be implemented into many other species, the most recent of which being the mouse. Mouse experiments are advantageously more cost-effective, experiments can be executed on a much faster timeline, and they allow the use of various transgenic models. The miniature size of the mouse eye, however, poses a particular challenge when performing the procedure. Manipulation of the eye to visualize the retina requires practice of fine dexterity skills as well as simultaneous hand-eye-foot coordination to operate the laser. However, once mastered, the model can be applied to study many aspects of neovascular AMD such as molecular mechanisms, the effect of genetic manipulations, and drug treatment effects. 
The laser-induced CNV model, though useful, is not a perfect model of the disease. The wild-type mouse eye is otherwise healthy, and the chorio-retinal environment does not mimic the pathologic changes in human AMD. Furthermore, injury-induced angiogenesis does not reflect the same pathways as angiogenesis occurring in an age-related and chronic disease state as in AMD.
Despite its shortcomings, the laser-induced CNV model is one of the best methods currently available to study the debilitating pathology of neovascular AMD. Its implementation has led to a deeper understanding of the pathogenesis of AMD, as well as contributing to the development of many of the AMD therapies currently available.

Quantificazione del CNV può essere effettuata attraverso l&#39;analisi dei coroide piatto montato con immunofluorescenza per etichettare i vasi CNV. I due metodi più frequentemente utilizzati di preparazione dei tessuti sono etichettatura FITC-destrano, fatto tramite perfusione immediatamente prima del sacrificio degli animali, o post mortem immuno-colorazione con un marker delle cellule endoteliali. Entrambi questi metodi sono stati descritti in precedenza in dettaglio 13,14,21; figure 1 e 2 mostrano esempi di ciascuna rispettivamente. Dopo l&#39;acquisizione di immagini di microscopia confocale, una delle aree (2-Dimensioni) o il volume (3-Dimensioni) possono essere calcolate e visualizzate con il software ImageJ o Volocity. Oltre alla quantificazione, imaging PTOM possono utilizzato per visualizzare CNV in vivo. Un esempio di immagine sezione trasversale della retina con conseguente CNV è mostrato in figura 3. <img a<html> lt = &quot;Figura 1&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53.502 / 53502fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1:. CNV Perfusione colorazione e di aree (2D) Esempio di calcolo (25X) (A) FITC destrano irrorato CNV lesione. (B) Area ImageJ metodo di quantificazione tramite soglia. Mouse Strain:. C57BL / 6J <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53502/53502fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53502/53502fig2.jpg" /> Figura 2: CNV Immunostaining &amp; Volume (3D) Esempio di calcolo (25X) (A) isolectin GS-IB4 macchiato CNV.. (B) ricostruzione 3D del CNV lesione en faccia vista. (C) ricostruzione 3D vista laterale (C una larghezza di piastrelle B e = 35 micron). Mouse Strain: C57BL / 6J.g2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53502/53502fig3.jpg" /> Figura 3:. Ottobre di sezioni trasversali CNV Visualizzazione (A) ottobre en faccia vista di CNV lesione. (B) ottobre trasversale B-scan di retina con CNV cerchiato in giallo. Mouse Strain:. C57BL / 6J <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53502/53502fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Un modello di topo per Laser-indotta della coroide neovascolarizzazione

The mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) model has been a crucial mainstay model for neovascular age-related macular degeneration (AMD) ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

17.5K Views.  Northwestern University Feinberg School of Medicine. Here, we present the mouse laser-induced choroidal neovascularization (CNV) protocol, an experimental model that re-creates the vascular hallmarks of neovascular age-related macular degeneration (AMD). Once mastered, it can reliably and effectively induce CNV as a model system to test various experimental measures.

Video: A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization

Laser-Induced Chronic Ocular Hypertension Model on SD Rats

Glaucoma is one of the major causes of blindness in the world. Elevated intraocular pressure is a major risk factor. Laser photocoagulation induced ocular hypertension is one of the well established animal models. This video demonstrates how to induce ocular hypertension by Argon laser photocoagulation in rat.

Glaucoma is one of the major causes of blindness in the world. Elevated intraocular pressure is a major risk factor. Laser photocoagulation induced ocular hypertension is one of the well established animal models. This video demonstrates how to induce ocular hypertension by Argon laser photocoagulation in rat.

Laser-Induced cronica ipertensione oculare su Ratti modello SD

Glaucoma is one of the major causes of blindness in the world. Elevated intraocular pressure is a major risk factor. Laser photocoagulation induced ocular ...

Ricerca

Biologia

A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model of ocular hypertension to mimic human high-tension glaucoma. Here laser illumination is applied to the corneal limbus to photocoagulate the aqueous outflow, inducing angle closure. The changes of IOP are monitored using a rebound tonometer before and after the laser treatment. An optomotor behavioral test is used to measure corresponding changes in visual capacity. The representative result from one mouse which developed sustained IOP elevation after laser illumination is shown. A decreased visual acuity and contrast sensitivity is observed in this ocular hypertensive mouse. Together, our study introduces a valuable model system to investigate neuronal degeneration and the underlying molecular mechanisms in glaucomatous mice.

Chronic ocular hypertension is induced using laser photocoagulation of the trabecular meshwork in mouse eyes. The intraocular pressure (IOP) is elevated for several months after laser treatment. The decrease of visual acuity and contrast sensitivity of experimental animals are monitored using the optomotor test.

Un modello di topo indotta da laser di cronica ipertensione oculare per caratterizzare difetti visivi

Glaucoma, frequently associated with elevated intraocular pressure (IOP), is one of the leading causes of blindness. We sought to establish a mouse model ...

Medicina

An Alkali-burn Injury Model of Corneal Neovascularization in the Mouse

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the cornea, which can be caused by trauma, keratoplasty or infectious disease, breaks down the so called &lsquo;angiogenic privilege' of the cornea and forms the basis of multiple visual pathologies that may even lead to blindness. Although there are several treatment options available, the fundamental medical need presented by corneal neovascular pathologies remains unmet. In order to develop safe, effective, and targeted therapies, a reliable model of corneal NV and pharmacological intervention is required. Here, we describe an alkali-burn injury corneal neovascularization model in the mouse. This protocol provides a method for the application of a controlled alkali-burn injury to the cornea, administration of a pharmacological compound of interest, and visualization of the result. This method could prove instrumental for studying the mechanisms and opportunities for intervention in corneal NV and other neovascular disorders.

Neovascularization (NV) of the cornea can complicate multiple visual pathologies. Utilizing a controlled, alkali-burn injury model, a quantifiable level of corneal NV can be produced for mechanistic study of corneal NV and evaluation of potential therapies for neovascular disorders.

Un Injury Modello alcali-burn di neovascolarizzazione corneale nel mouse

Under normal conditions, the cornea is avascular, and this transparency is essential for maintaining good visual acuity. Neovascularization (NV) of the ...

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, difficulties in observing posterior choroidal melanoma in vivo limit tumor location and growth evaluation in real-time. The approach described here optimizes techniques for establishing choroidal melanoma in mice via a multi-step sub-choroidal B16LS9 cell injection procedure. To enable precision in injecting into the small dimensions of the mouse uvea, the complete procedure is performed under a microscope. First, a conjunctival peritomy is formed in the dorsal-temporal area of the eye. Then, a tract into the sub-choroidal space is created by inserting a needle through the exposed sclera. This is followed by the insertion of a blunt needle into the tract and the injection of melanoma cells into the choroid. Immediately after injection, noninvasive optical coherence tomography (OCT) imaging is utilized to determine tumor location and progress. Retinal detachment is evaluated as a predictor of tumor site and size. The presented method enables the reproducible induction of choroid-localized melanoma in mice and the live imaging of tumor growth evaluation. As such, it provides a valuable tool for studying intraocular tumors.

Implantation and Evaluation of Melanoma in the Murine Choroid via Optical Coherence Tomography

The present protocol describes the implantation and evaluation of melanoma in the murine choroid utilizing optical coherence tomography.

Impianto e valutazione del melanoma nella coroide murina mediante tomografia a coerenza ottica

Establishing experimental choroidal melanoma models is challenging in terms of the ability to induce tumors at the correct localization. In addition, ...

Ricerca sul cancro

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

In Vivo Imaging multimodale e l'analisi di Mouse indotta da Laser modello di Neovascularization coroidico

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

Neuroscienze

Optimization of the Retinal Vein Occlusion Mouse Model to Limit Variability

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a detailed method pointing out critical steps is provided with recommendations for optimization to achieve consistently successful occlusion rates across different genetically modified mouse strains. The RVO mouse model consists primarily of the intravenous administration of a photosensitizer dye followed by laser photocoagulation using a retinal imaging microscope attached to an ophthalmic guided laser. Three variables were identified as determinants of occlusion consistency. By adjusting the wait time after rose bengal administration and balancing the baseline and experimental laser output, the variability across experiments can be limited and a higher success rate of occlusions achieved. This method can be used to study retinal diseases that are characterized by retinal edema and hypoxic-ischemic injury. Additionally, as this model induces vascular injury, it can also be applied to study the neurovasculature, neuronal death, and inflammation.

Here, we describe an optimized protocol for retinal vein occlusion using rose bengal and a laser-guided retinal imaging microscope system with recommendations to maximize its reproducibility in genetically modified strains.

Ottimizzazione del modello murino di occlusione venosa retinica per limitare la variabilità

Mouse models of retinal vein occlusion (RVO) are often used in ophthalmology to study hypoxic-ischemic injury in the neural retina. In this report, a ...

Application of Optical Coherence Tomography to a Mouse Model of Retinopathy

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images from which the retinal thickness can be calculated. Although OCT is widely used in clinical practice, its application in basic research is not as prevalent, especially in small animals such as mice. Because of the small size of their eyeballs, it is challenging to conduct fundus imaging examinations in mice. Therefore, a specialized retinal imaging system is required to accommodate OCT imaging on small animals. This article demonstrates a small-animal-specific system for OCT examination procedures and a detailed method for image analysis. The results of retinal OCT examination of very-low-density lipoprotein receptor (Vldlr) knockout mice and C57BL/6J mice are presented. The OCT images of C57BL/6J mice showed retinal layers, while those of Vldlr knockout mice showed subretinal neovascularization and retinal thinning. In summary, OCT examination could facilitate the noninvasive detection and measurement of retinopathy in mouse models.

Here, we describe an in vivo imaging technique using optical coherence tomography to facilitate the diagnosis and quantitative measurement of retinopathy in mice.

Applicazione della tomografia a coerenza ottica a un modello murino di retinopatia

Optical coherence tomography (OCT) offers a noninvasive method for the diagnosis of retinopathy. The OCT machine can capture retinal crosssectional images ...

Image-Guided Optical Coherence Tomography to Assess Structural Changes in Rodent Retinas

Ocular diseases, such as age-related macular degeneration, glaucoma, retinitis pigmentosa, and uveitis, are always accompanied by retinal structural changes. These diseases affecting the fundus always exhibit typical abnormalities in certain cell types in the retina, including photoreceptor cells, retinal ganglion cells, cells in the retinal blood vessels, and cells in the choroidal vascular cells. Noninvasive, highly efficient, and adaptable imaging techniques are required for both clinical practice and basic research. Image-guided optical coherence tomography (OCT) satisfies these requirements because it combines fundus photography and high-resolution OCT, providing an accurate diagnosis of tiny lesions as well as important changes in the retinal architecture. This study details the procedures of data collection and data analysis for image-guided OCT and demonstrates its application in rodent models of choroidal neovascularization (CNV), optic nerve crush (ONC), light-induced retinal degeneration, and experimental autoimmune uveitis (EAU). This technique helps researchers in the eye field to identify rodent retinal structural changes conveniently, reliably, and tractably.

The protocol presented here details the procedures of data collection and data analysis for image-guided optical coherence tomography (OCT) and demonstrates its application in multiple rodent models of ocular diseases.

Ocular diseases, such as age-related macular degeneration, glaucoma, retinitis pigmentosa, and uveitis, are always accompanied by retinal structural ...

Caratterizzazione di diversi tipi di lesioni di CNV indotta da laser nel topo

Characterization of Vascular Morphology of Neovascular Age-Related Macular Degeneration by Indocyanine Green Angiography

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of blindness among older individuals, and its prevalence is rapidly increasing due to the aging population. Choroidal neovascularization (CNV) or wet AMD, which accounts for 10%-20% of all AMD cases, is responsible for an alarming 80%-90% of AMD-related blindness. Current anti-VEGF therapies show suboptimal responses in approximately 50% of patients. Resistance to anti-VEGF treatment in CNV patients is often associated with arteriolar CNV, while responders tend to have capillary CNV. While fluorescein angiography (FA) is commonly used to assess leakage patterns in wet AMD patients and animal models, it does not provide information about CNV vascular morphology (arteriolar CNV vs. capillary CNV). This protocol introduces the use of indocyanine green angiography (ICGA) to characterize lesion types in laser-induced CNV mouse models. This method is crucial for investigating the mechanisms and treatment strategies for anti-VEGF resistance in wet AMD. It is recommended to incorporate ICGA alongside FA for comprehensive assessment of both leakage and vascular features of CNV in mechanistic and therapeutic studies.

Autore in primo piano: Superare la resistenza anti-VEGF attraverso la valutazione avanzata della morfologia vascolare nella neovascolarizzazione coroideale

Currently, fluorescein angiography (FA) is the preferred method for identifying leakage patterns in animal models of choroidal neovascularization (CNV). However, FA does not provide information about vascular morphology. This protocol outlines the use of indocyanine green angiography (ICGA) to characterize different lesion types of laser-induced CNV in mouse models.

Caratterizzazione della morfologia vascolare della degenerazione maculare neovascolare legata all'età mediante angiografia con verde indocianina

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of blindness among older individuals, and its prevalence is rapidly increasing due to the aging ...

Un modello di topo per Laser-indotta della coroide neovascolarizzazione

Riepilogo

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Laser-Induced cronica ipertensione oculare su Ratti modello SD

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Un Injury Modello alcali-burn di neovascolarizzazione corneale nel mouse

Impianto e valutazione del melanoma nella coroide murina mediante tomografia a coerenza ottica

In Vivo Imaging multimodale e l'analisi di Mouse indotta da Laser modello di Neovascularization coroidico

Ottimizzazione del modello murino di occlusione venosa retinica per limitare la variabilità

Applicazione della tomografia a coerenza ottica a un modello murino di retinopatia

Image-Guided Optical Coherence Tomography to Assess Structural Changes in Rodent Retinas

Caratterizzazione della morfologia vascolare della degenerazione maculare neovascolare legata all'età mediante angiografia con verde indocianina

Caratterizzazione della morfologia vascolare della degenerazione maculare neovascolare legata all'età mediante angiografia con verde indocianina