Name: do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis
Uploaded: 2015-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis at JoVE.com

We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).

1. Tissue Colheita e congelamento dos tecidos musculares <ol><li> Eutanásia o rato com uma overdose de isoflurano (2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano). Execute esta etapa em um exaustor e usar um método de contenção secundária, como um secador ou uma redoma de vidro contendo um cotonete embebido em isoflurano. </li><li> Confirme a morte com firmeza apertando pata. Use um método secundário de eutanásia, como luxação cervical. </li><li> Molhar a pele com álcool a 70% para reduzir a aderência de fios de cabelo soltos sobre os músculos. Descasque a pele fora o membro usando uma pinça fina, tais como # 5. </li><li> Cuidadosamente separar o músculo de interesse (tibial anterior (TA), neste caso) a partir dos ossos por baixo, a partir do tendão e remover. </li><li> Extirpar o músculo, cobri-lo em outubro (de corte ideal composto de temperatura), e coloque-o deitado sobre um molde de congelamento descartável rotulados. Certifique-se de que o músculo está em sua orientação fisiológica normal (cabeça para tail) sem esticar. Alternativamente, congelar o músculo em pequenos quadrados de isopor e fixá-lo utilizando os pinos de insetos para garantir o comprimento correto dos músculos. </li><li> Relaxar 2-metilbutano (isopentano) em um copo de aço usando azoto líquido. Isso leva, em média, 3-5 min. Continue mexendo de forma intermitente até precipitados brancos começam a se formar no fundo e paredes do copo. NOTA: Quando isso ocorre, isopentano tenha alcançado a temperatura ideal de congelamento (-150 ° C) </li><li> Mergulhe os moldes contendo músculos na gelada de 2-metilbutano. Congelar pequenos músculos, como o diafragma e longus extensor digitorum (EDL) para 6-12 seg e músculos maiores, como o sóleo gastrocnêmio (GS) e tríceps para 15 - 20 seg. Não congelar os músculos por muito tempo, pois isso pode levar a fissuras. </li><li> Transfira os tecidos congelados sobre gelo seco e deixe evaporar isopentano (note que este processo leva em média cerca de 15 - 20 min). Enrole os tecidos em papel alumínio e armazená-los em ultra baixa temperatura (-70 ° C a -80 ° C) até o corte. </li></ol> 2. Incorporar os tecidos em outubro de Elaborar bloco de tecido <ol><li> Tecidos de transporte em gelo seco para cyrostat para evitar o descongelamento. Transferência para o tecido criostato câmara (definida a -20 a -24 ° C para evitar o descongelamento completo de tecidos) e deixá-los equilibrar durante 30 min. </li><li> Vire a baía Peltier de refrigeração por diante. Se o cryostat não tem esse resfriamento, use aerosol spray de arrefecimento para congelar rapidamente a outubro Não deixe que o degelo do músculo em qualquer ponto durante a incorporação, pois isso pode resultar em danos causados ​​por congelamento. </li><li> Adicione uma camada fina e uniforme de outubro no disco de amostra e deixe esfriar. Quando a maior parte dos PTU é congelada no fundo enquanto ainda líquido na parte superior, insira o tecido na orientação correta (perpendicular outubro para seções transversais e paralelas para outubro para cortes longitudinais). Use spray de aerosol arrefecimento para congelar rapidamente outubro Toque na parte unembeded do tecido com calor extractor e aguarde 45 segundos. </li><li> Adicionar outra camada fina de outubro em torno do músculo, pulverizador com de aerossol de pulverização de arrefecimento e extrair o calor tal como no passo anterior. </li><li> Continua a adicionar outubro em pequenos incrementos e congelar rapidamente OCT utilizando uma combinação de aerossol de pulverização e extractor de calor de arrefecimento até que todo o músculo é coberto. </li><li> Colocar o extractor de calor na parte superior do bloco de tecido e esperar durante 5 min. </li></ol> 3. Preparar Seções e identificando as secções de Mid-barriga Região dos Músculos <ol><li> Montar o espécime para o cabeçote da amostra. Aperte o botão para fixar o disco. Certifique-se de que o disco de amostra está em bom contato com o cabeçote de amostra. </li><li> Ajuste a temperatura da câmara de entre -21 e -24 ° C e aguarde até que a temperatura definida é alcançada. </li><li> Ajuste as configurações de espessura (7 um); aparar o bloco através do avanço ou retração do bloco usando configurações grossas e finas. </li><li> Recolher as seçõesem pré-aquecido lâminas de microscópio com carga positiva, pressionando a parte superior da lâmina para as secções, utilizando a atracção entre cargas opostas para facilitar a aderência das secções de corte na lâmina. </li><li> Identificar as secções médio-barriga por medição da área da secção transversa (AST) das secções. Faça isso usando software de imagem no computador que está ligado ao microscópio. NOTA: As imagens de contraste de fase são tomadas e circunferência de todo o músculo é medido através de uma função de rastreamento sobre o programa de software. Isto irá proporcionar tanto CSA, bem como diâmetro mínimo furão (medida de fibras de tamanho em corte transversal que é expressa como a menor distância entre duas tangentes paralelas em lados opostos de uma partícula) medições. Nota: Quando CSA e diâmetro mínimo ferret medições começar a platô, mid barriga foi atingido. </li><li> Inventário e arquivar as lâminas a -80 ° C para a coloração futuro. NOTA: o PTU não precisam ser removidos antes da staininprocedimentos de g. Uma vez que as lâminas são lamínulas, eles estão prontos para ser manchado imediatamente. </li></ol> 4. Coloração NOTA: Embora os procedimentos passo a passo detalhadas podem ser encontradas na folha de dados do produto e deve ser seguido por procedimentos de coloração, otimização de pessoal pode ser obrigado a obter a coloração ideal. <ol><li> Como meios de montagem (ver quadro) não seja miscível com água, por meio de lâminas de desidratar graus crescentes de álcool (2 min cada em 70%, 95%, e 100% de etanol) e limpá-las com xileno (100% durante 5 min) para garantir lâminas não se tornam opaca ao longo do tempo. </li><li> Lamela seções e deixe-os secar. Imagem com microscópio equipado com software de imagem. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

A histologia e imuno-histoquímica têm sido utilizados como ferramentas fundamentais para a compreensão da manifestação e progressão da patologia de várias desordens neuromusculares. Classicamente, biópsias musculares foram fixadas pela primeira vez em formaldeído e depois incorporado com cera de parafina. Enquanto fixação em formol preserva a arquitetura do tecido e permite o armazenamento e transporte de tecido à temperatura ambiente, também inativa enzimas e proteínas ligações cruzadas que obrigariam a novas medidas para alcançar immunostaining precisas. Este problema é eliminado com a utilização de secções congeladas, mas este método apresenta desafios técnicos únicos na obtenção de resultados óptimos de coloração e 14,15 interpretação precisa. Em primeiro lugar, é essencial que as amostras sejam congeladas imediatamente após a excisão cirúrgica como autólise e decomposição começa logo após a remoção do corpo. Os tecidos também devem ser congelados rapidamente e completamente para a quantidade adequada de tempo que varia de acordo com o tamanho/ Espessura do tecido. Se isso não for feito corretamente, congelar dano ocorrerá tornando o tecido inútil para avaliação histológica. Após congelação, tecidos deve ser imediatamente armazenado em gelo seco e, em seguida, transferidos para uma temperatura ultra baixa (-80 ° C) congelador até seccionamento. É importante notar que os tecidos não deve ser removido do congelador sem ser em gelo seco por congelação-descongelação, também pode danificar arquitectura dos tecidos. Outra nota de importância quando da realização de análise histológica é cuidar para analisar sempre a mesma parte do tecido de interesse para assegurar a uniformidade entre análise. Isto pode ser feito por secções do músculo através da realização de análise da porção média do ventre. Esta é a parte do músculo que é mais espesso e, por conseguinte, terá maior área da secção transversal do. A fim de assegurar que você está realmente seccionamento porção média do ventre, CSA de seções devem ser medidos utilizando o software de imagem histológica. Measurementos deve continuar a ser feito até que a área transversal começa a estagnar. Quando isso ocorre, a meio da barriga tenha sido alcançada; apenas esta parte do tecido deve ser usado para análise histológica para garantir a uniformidade entre as comparações. Depois de corte foi preenchido e as lâminas foram preparadas, que deve ser deixada a secar à temperatura ambiente durante 1 - 2 h. Secagem permite a aderência adequada da secção para a corrediça e também evita que o excesso de água para cristalizar após a transferência para -80 ° C congelador. É importante notar que as lâminas apenas devem também ser tratadas em gelo seco quando se selecciona lâminas para análise para evitar ciclos de congelamento e descongelamento. Uma vez que os slides foram selecionadas para a coloração, os protocolos incluídos com a mancha deve ser seguido primeira a título experimental até que foram alcançados os melhores resultados. Ao realizar immunostaining, é importante certificar-se de lâminas não sequem durante o procedimento. A secagem das lâminas pode resultar em interacção transientes para permanecer intacta após incubação. Estas interacções não pode ser removido durante a lavagem e resultar em coloração inespecífica. A secagem pode ser evitada mantendo diapositivos numa atmosfera humidificada. Execução de incubações com partes cobertas com parafilme e desliza sobre uma toalha de papel úmido selado em uma caixa de slides pequeno é suficiente para garantir slides não vai secar a qualquer momento durante o procedimento. Histologia é uma ferramenta essencial na visualização morfologia e vários aspectos da patologia. Embora um tanto trivial, é da maior importância que tomar muito cuidado na preparação de tecidos poderiam ser utilizados para histologia. A partir de excisão de congelamento, de corte e coloração, os tecidos devem ser tratados de uma forma que irá evitar danos causados ​​por congelamento e produzir as imagens mais precisas possível. Sem preservação adequada, a coloração não refletir com precisão fisiologia e, portanto, levar a erros de interpretação.

O exame de histologia muscular desempenha um papel crítico na compreensão de diferentes tipos de distúrbios neuromusculares 1-4. Quando combinado com outras técnicas, permite que pesquisadores para ter uma idéia melhor da manifestação ea progressão da patologia e também pode ser essencial para avaliar a eficácia de uma intervenção terapêutica 5-10. No entanto, para ser exato, os tecidos precisam ser preservados de forma adequada, de modo a preservar o estado fisiológico imediatamente antes da excisão. Isso requer muito cuidado durante a remoção, preservação, seccionamento e coloração. Os tecidos podem ser preparados de duas maneiras diferentes para estudo microscópico luz. O método primeiro, fixados em formalina embebidos em parafina (FFPE) seções, requer tecidos fixados em formol 10% tamponado naturais antes de ser incorporado com cera de parafina 11,12. A etapa de fixação ajuda a preservar a morfologia melhor, mas também ligações cruzadas pr endógenooteins necessitando, portanto, de antigénios intrincado procedimentos de recuperação para a imunocoloração e eliminando a possibilidade de coloração enzimática em tais seções 12. As secções congeladas, por outro lado, não precisa de ser pré-fixo ou processado; por conseguinte, as proteínas são capazes de reter conformações nativas biológicos 13,14. Além disso, cortes congelados também permitem rápido tempo de resposta, que às vezes é necessário, por exemplo, no diagnóstico intra-operatório de sarcomas e outras biópsias cirúrgicas 15. No entanto, se não for feito corretamente, este método é propenso a congelar danos, que introduz alterações à arquitetura muscular fazendo as seções impróprios para exame histológico. Este artigo irá delinear o método mais eficaz para preparar biópsias musculares, a fim de alcançar uma óptima coloração para exame adequado.

<table><tbody><tr><td>Cryostat</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123&lt;br /&gt;Alternative: Richard Allen Scientific</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500&lt;br /&gt;Alternative: Olympus</td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Nikon Imaging Software Basic Research</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500&lt;br /&gt;Alternatives: Image J, Metamorph</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>14043-220-05</td><td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td><td>1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A.</td></tr><tr><td>OCT</td><td>4583</td><td>Sakura Inc.</td><td>Torrence, CA 90501 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: Leica Microsystem</td></tr><tr><td>Freeze It</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Disposable tissue mold</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Colorfrost plus slides</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Ethyl alcohol</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-methyl butane</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A.&lt;br /&gt;Alternative source: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis

A avaliação histológica de biópsias do músculo tem servido como uma ferramenta indispensável para a compreensão do desenvolvimento e progressão da patologia de doenças neuromusculares. No entanto, a fim de fazê-lo, o cuidado apropriado deve ser tomado quando excisão e preservar tecidos para alcançar a coloração ideal. Um método de preservação de tecido envolve a fixação tecidos em formaldeído e, em seguida, incorporando-os com cera de parafina. Este método preserva morfologia bem e permite o armazenamento a longo prazo a temperatura ambiente, mas é difícil e requer a manipulação de produtos químicos tóxicos. Além disso, os resultados de fixação em formaldeído antígeno cross-linking, o que exige protocolos de recuperação antigênica para immunostaining eficaz. Pelo contrário, o seccionamento congelado não necessita de fixação e, assim, retém a conformação antigénio biológica. Este método também fornece uma vantagem distinta em volta rápida em torno do tempo, tornando-se especialmente útil em situações que necessitam de avaliação histológica rápido como intraoperativa biópsias cirúrgicas. Aqui nós descrevemos o método mais eficaz de preparação de biópsias musculares para visualização com diferentes colorações histológicas e imunológicas.

A instalação para a colheita e congelamento de tecidos pode ser visto na Figura 1. Tecidos excisados ​​deve ser armazenado em uma gaze embebida em PBS para evitar a secagem (Figura 1A). Quando os tecidos são selecionados para serem utilizados para análise histológica eles devem ser mergulhados em outubro e dispostas em molde crio na orientação adequada e tão perto de comprimento fisiológico possível para garantir a morfologia preciso (Figura 1B). Polpa de isopentano apropriada para congelamento de tecidos pode ser conseguida por arrefecimento de isopentano no azoto líquido e agitando até pequenos precipitados brancos aparecem na parte inferior. Neste ponto, os meios de comunicação é adequado para congelamento (Figura 1C). Os tecidos devem ser congeladas 6-15 seg em isopentano arrefecido, dependendo do tamanho / espessura do tecido (Figura 1D). Na sequência de congelamento, o músculo aparecerá branco giz em que ponto ele deve ser armazenado em gelo seco e mais tarde transferido para -80 &lt;strong&gt; ° C congelador. Configuração criostato e os ingredientes necessários para a preparação do bloco de músculo gradualmente por incorporação do tecido em OCT são mostrados na Figura 2. O criostato deve ser definido entre -20 e -24 ° C (Figura 2A). Outubro e congelá-los devem estar prontamente disponíveis para criar bloco adequado para o corte. Dentro de criostato deve ter escovas pequenas para manipular e achatam seções de corte de lâmina de decisões, bem como pinças para manejo de bloco de tecido, porque ele nunca deve ser tocada com as mãos para garantir o tecido permanece congelado (Figura 2B). Outubro deve ser adicionado ao tecido para criar bloco de corte, mas devem ser imediatamente congelados com Freeze-It spray e, em seguida, ainda arrefecida com heat-extractor retratado aqui (Figura 2C). Para secções transversais, o tecido deve ser colocado sobre a amostra, de modo que a cabeça está orientada perpendicularmente à lâmina (Figura 2D). SeIm press ão deve ser ajustada para atingir a espessura de corte desejada (5-10 uM, dependendo do tecido). Se congelado corretamente o rosto do tecido deve ser calcário branco, enquanto um tecido que foi congelado de forma inadequada ou descongelado durante o processo de montagem aparece vermelho / rosa. A Figura 3 mostra tecidos representativos para amostras manuseadas inadequadamente (Figura 3A) e amostras tratadas adequadamente (Figura 3B) . A região do ventre médio é determinado por medição CSA e diâmetro mínimo doninha usando um microscópio equipado com óptica de contraste de fase e software de análise de imagem. Uma imagem representativa de software de análise é mostrado na Figura 4. Hematoxilina e eosina imagens coradas de uma biópsia adequadamente congelados e seccionados ao longo com um congelamento de biópsia danificado tibial anterior (TA) são mostrados na Figura 5. As secções que são adequadamente processados ​​terão morpholo consistenteGy e ainda em toda a coloração (Figura 5A). Indevidamente processadas músculos que estão danificados ou congelamento prematuramente descongelados parecerá ter várias quebras na morfologia e têm a aparência de &quot;desfiado trigo&quot; (Figura 5B). Figura 6 mostra câmara úmida para immunostaining ideal. As lâminas devem ser cobertos com parafilme, mantidos em uma toalha de papel molhado, e selado em uma caixa pequena para evitar a secagem das secções durante immunostaining. Figura 7 mostra um slide imunohistoquímica amostra que tenha sido devidamente preparadas e coradas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Preparação e criados para congelamento do tecido apropriado. (A) excisada tecidos devem ser armazenados em gaze embebida em PBS. (B) A tecidos selectedfor histológicaanálise mergulhado em outubro e dispostas em molde crio na orientação correta (de barriga para tendão) e tão perto comprimento fisiológico possível. (C) de lodo de isopentano apropriada para o tecido. Nota: pequenos precipitados brancos aparecem na parte inferior. (D) de tecido congelado após imersão em isopentano. Nota:. Aparência branca como giz <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52793/52793fig1highres.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. Configurações de criostato e os ingredientes necessários para o corte. (A) Criostato definido entre -20 e -24 ° C com outubro e aerosol spray de arrefecimento prontamente disponíveis. (B) Dentro de configuração de cryostat completo com pequenos pincéis para manipular e achatar seç corteons para fazer slides, bem como uma pinça para manusear de bloco de tecido. (C) bloco de tecido congelado pronto para ser resfriado com extrator de calor (seta branca). Bloco (D) Tissue posta sobre a cabeça pronta para ser cortada de montagem. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52793/52793fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. tecidos representativos de músculos corretamente e incorretamente preservadas. (A) Indevidamente congelados ou manipulados (B) Devidamente congelado e manipulados muscular. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52793/52793fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt= &quot;Figura 4&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52793 / 52793fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 4. Determinação da área da seção transversal do músculo TA usando software de imagem da Nikon. Screenshot imagem de contraste de fase de secção muscular que foi circulado usando imaginar software para a medição da CSA e diâmetro min furão de. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52793/52793fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig5highres.jpg" width="700" /> Figura 5. Imagens representativas dos músculos H &amp; E manchada adequadamente e de forma inadequada preparados. (A) Bem seção processado. (B) seção muscular congelamento danificado incorretamente processado. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52793/52793fig5highres.jpg" target="_blank">Por favor, cli</a>ck aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig6highres.jpg" width="600" /> Figura 6. umidificado câmara apropriado para immunostaining. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52793/52793fig6highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52793/52793fig7highres.jpg" width="350" /> Figura 7. Exemplo de imuno-histoquímica de slides de slides devidamente preparados e corados. Deslize foi corado com Fibronectina (verde) e DAPI (azul). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52793/52793fig7highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

Fazer e não fazer na preparação de músculo Cortes congelados para análise histológica

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

31.9K visualizações.  Boston University. Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

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Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Indução da Aguda Skeletal regeneração muscular por cardiotoxina Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Biologia do Desenvolvimento

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures for rat laryngeal dissection, flash-freezing, and cryosectioning of the vocal folds. This study describes how to cryosection vocal folds in both longitudinal and cross-sectional planes. A novelty of this protocol is the laryngeal tracking during cryosectioning that ensures accurate identification of the intrinsic laryngeal muscles and reduces the chance of tissue loss. Figures demonstrate the progressive cryosectioning in both planes. Twenty-nine rat hemi-larynges were cryosectioned and tracked from the emergence of the thyroid cartilage to the appearance of the first section that included the full vocal fold. The full vocal fold was visualized for all animals in both planes. There was high variability in the distance from the appearance of the thyroid cartilage to the appearance of the full vocal fold in both planes. Weight was not correlated to depth of laryngeal landmarks, suggesting individual variability and other factors related to tissue preparation may be responsible for the high variability in the appearance of landmarks during sectioning. This study details a methodology and presents morphological data for preparing the rat vocal fold for histochemical neuromuscular investigation. Due to high individual variability, laryngeal landmarks should be closely tracked during cryosectioning to prevent oversectioning tissue and tissue loss. The use of a consistent methodology, including adequate tissue preparation and awareness of landmarks within the rat larynx, will assist with consistent results across studies and aid new researchers interested in using the rat vocal fold as a model to investigate laryngeal neuromuscular mechanisms.

This protocol describes methods used to prepare rat vocal folds for histochemical neuromuscular study.

Preparação da Dobra Vocal do Rato para Análises Neuromusculares

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Neurociência

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Triagem de Tecidos e Congelamento de modelos de doença do músculo esquelético

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Biologia

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Método cryosectioning para Microdissection de Murino Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative prognostic factor for several other disorders such as cardiovascular disease and cancer. Excessive lipid infiltration decreases muscle mass and strength. It also results in lipotoxicity and insulin resistance depending on total intramyocellular lipid content, lipid droplet (LD) morphology, and subcellular distribution. Fiber type (oxidative vs glycolytic) is also important, since oxidative fibers have a greater capacity to utilize lipids. Because of their crucial implications in pathophysiology, in-depth studies on LD dynamics and function in a fiber type-specific manner are warranted.
Herein, a complete protocol is presented for the quantification of intramyocellular lipid content and analysis of LD morphology and subcellular distribution in a fiber type-specific manner. To this end, serial muscle cryosections were stained with the fluorescent dye Bodipy and antibodies against myosin heavy chain isoforms. This protocol enables the simultaneous processing of different muscles, saving time and avoiding possible artifacts and, thanks to a personalized macro created in Fiji, the automatization of LD analysis is also possible.

Increasing evidence indicates that excessive infiltration of lipids inside skeletal muscle results in lipotoxicity and diabetes. Here, we present a complete protocol, including tissue processing, staining with Bodipy, image acquisition, and analysis, to quantify the size, density, and subcellular distribution of lipid droplets in a fiber-type specific manner.

Tipo de fibra e análise subcelular-específica do conteúdo de gotícula lipídica no músculo esquelético

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative ...

Medicina

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious projects to disrupt every gene in the mouse genome. The research community needs rapid and inexpensive means to phenotype tissues via histology. Histological analyses of skeletal tissues are often time consuming and semi-quantitative at best, regularly requiring subjective interpretation of slides from trained individuals. Here, we present a cryohistological paradigm for efficient and inexpensive phenotyping of mineralized tissues. First, we present a novel method of tape-stabilized cryosectioning that preserves the morphology of mineralized tissues. These sections are then adhered rigidly to glass slides and imaged repeatedly over several rounds of staining. The resultant images are then aligned either manually or via computer software to yield composite stacks of several layered images. The protocol allows for co-localization of numerous molecular signals to specific cells within a given section. In addition, these fluorescent signals can be quantified objectively via computer software. This protocol overcomes many of the shortcomings associated with histology of mineralized tissues and can serve as a platform for high-throughput, high-content phenotyping of musculoskeletal tissues moving forward.

In this manuscript, we present a high-throughput, semi-automated cryohistology platform to produce aligned composite images of multiple response measures from several rounds of fluorescent imaging on frozen sections of mineralized tissues.

De alto rendimento, Multi-Imagem Cryohistology de mineralizadas tecidos

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Cryosectioning da contíguos Regiões de um músculo esquelético único mouse para expressão do gene e análises histológicas

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible cytoplasmic compartments. Another hurdle is the tight apposition of myofibers to the surrounding tissues. Because the process of tissue fixation and paraffin embedding leads to the shrinkage of muscle fibers, freezing is an optimal means of hardening muscle tissue for sectioning. However, a commonly encountered issue, the formation of ice crystals, occurs during the preparation of frozen sections because of the high water content of muscle. The protocol presented here first describes a simple and efficient method for properly freezing muscle tissues by immersing them in liquid nitrogen. The problem with using liquid nitrogen alone is that it causes the formation of a nitrogen gas barrier next to the tissue, which acts as an insulator and inhibits the cooling of the tissues. To avoid this "vapor blanket" effect, a new cryovial was designed to increase the speed of liquid flow around the tissue surface. This was achieved by punching a total of 14 inlet holes in the wall of the vial. According to bubble dynamics, a higher rate of liquid flow results in smaller bubbles and fewer chances to form a gas barrier. When liquid nitrogen flows into the cryovial through the inlet holes, the flow velocity around the tissue is fast enough to eliminate the gas barrier. Compared to the method of freezing muscle tissues using pre-chilled isopentane, this protocol is simpler and more efficient and can be used to freeze muscle in a throughput manner. Furthermore, this method is optimal for institutions that do not have access to isopentane, which is extremely flammable at room temperature.

This protocol describes a procedure to freeze muscle tissues by plunging them directly into liquid nitrogen. This protocol also highlights a new cryovial that can avoid the &#34;blanket effect&#34; of nitrogen gas when liquid nitrogen contacts the tissue surface of a specimen.

Um multi-furo criotubo Elimina congelação Artifacts quando tecidos musculares são directamente Imerso em azoto líquido

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

Coloração imunofluorescente in situ de autofagia em células estaminais musculares

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

Immunolabelling Myofiber Degeneration in Muscle Biopsies

The necrosis of muscle fibres (myonecrosis) plays a central role in the pathogenesis of several muscle conditions, including muscular dystrophies. Therapeutic options addressing the causes of muscular dystrophy pathogenesis are expected to alleviate muscle degeneration. Therefore, a method to assay and quantify the extent of cell death in muscle biopsies is needed. Conventional methods to observe myofiber degeneration in situ are either poorly quantitative or rely on the injection of vital dyes. In this article, an immunofluorescence protocol is described that stains necrotic myofibers by targeting immunoglobulin G (IgG) uptake by myofibers. The IgG uptake method is based on cell features characterizing the necrotic demise, including 1) the loss of plasma membrane integrity with the release of damage-associated molecular patterns and 2) the uptake of plasmatic proteins. In murine cross-sections, the co-immunolabelling of myofibers, extracellular matrix proteins, and mouse IgG allows clean and straightforward identification of myofibers with necrotic fate. This simple method is suitable for quantitative analysis and applicable to all species, including human samples, and does not require the injection of vital dye. The staining of necrotic myofibers by IgG uptake can also be paired with other co-immunolabelling.

Described here is a protocol for direct immunolabelling of necrotic myofibers in muscle cryosections. Necrotic cells are permeable to serum proteins, including immunoglobulin G (IgG). Revealing the uptake of IgG by myofibers allows the identification and quantification of myofibers that undergo necrosis regardless of muscle condition.