Name: minimal invasive surgical procedure of inducing myocardial infarction in mice
Uploaded: 2015-05-04T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice at JoVE.com

This work was supported by Interdisciplinary Centre for Clinical Research IZKF Aachen (junior research group to E.A.L.) within the faculty of Medicine at RWTH Aachen University. We are grateful Dr. Rusu and Ashley Christina Vourakis for critical review of the manuscript and Mrs. Roya Soltan for the professional help with immunohistochemistry staining.

NOTA: Os experimentos apresentados neste trabalho são realizadas em conformidade com o baixo alemão e às orientações europeias de cuidados de animais. Os animais são criados na unidade de animal Institute for Science Laboratory Animal, Universiy hospital de Aachen, na Alemanha, sob a supervisão do Prof. Dr. R. Tolba e Dr. A. Teubner (oficial de bem-estar animal). 1. Animal Care <ol><li> Mantenha os ratos em uma unidade de cuidados especializados, assegurando acesso adequado à alimentação e controlo veterinário especializado e tratamento. Se os animais são movidos ou comprados de fora, por favor, assegurar alojamento de uma semana antes de se submeter ao procedimento. </li></ol> 2. intubação <ol><li> Anestesiar 8-10 semanas de idade C57BL / 6 murganhos do tipo selvagem, 25-27 g usando injecção intraperitoneal de 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina. Monitorar o nível de anestesia por reflexos pitada dedo do pé. Coloque veterinário pomada nos olhos para evitar a secura durante o procedimento. </li><li&gt; Gerenciar terapia da dor com peso buprenophine subcutaneamente 0,1 mg / kg corpo antes de iniciar o procedimento cirúrgico, seguindo as orientações de cuidados de animais de sua instituição. </li><li> Assegurar a manutenção de condições estéreis a fim de evitar as infecções durante a cirurgia, utilizando materiais e instrumentos estéreis. </li><li> Posicione o mouse anestesiados em decúbito dorsal sobre uma mesa de cirurgia aquecida. Remover o cabelo, tanto da área ventral do pescoço e metade esquerda do tórax com uma pequena lâmina de barbear e desinfectar com álcool a 70% antes da incisão. <ol><li> Executar uma pequena incisão mediana de 0,5 cm, utilizando tesouras de cirurgia no centro do pescoço. Sob a pele, percorrer os corpos gordos 2 com uma pinça curva estéreis e visualizar a traqueia sob lupa através da transparência do músculo cobertura. </li></ol></li><li> Introduzir por via oral a cânula de intubação na traquéia sob visão usando o microscópio estereoscópico (Figura 1A). Distinguir a cânula de metal through o tecido transparente. E verificar, a posição eo local durante a operação a qualquer momento (Figura 1B). </li><li> Conecte-se a cânula para o pequeno ventilador animais e ajustar as configurações de ventilação de acordo com as diretrizes fabrica (volume corrente entre 100-150 mL e uma taxa de respiração entre 100-150 por min). </li></ol> 3. Infarto do Miocárdio Indução <ol><li> Realize uma incisão na pele inferior a 0,5 cm no meio de uma linha entre xifóide e axila esquerda. Use uma pinça para separar a camada muscular das nervuras subjacentes. </li><li> Realize uma pequena incisão entre as costelas usando uma pequena tesoura até a cavidade torácica é aberta 17. Para enfarte crónica, realizar a incisão no espaço intercostal 5 th (Figura 1C) e / ou para o modelo de isquemia / reperfusão, no 4 o espaço intercostal (Figura 1D): para um número de abordagem mais fácil de seguir o 2 ° eo 3 th </sup&gt; espaço intercostal, respectivamente). </li><li> Colocar os afastadores dentro da incisão para abrir a cavidade torácica e para visualizar o coração. </li><li> Retire cuidadosamente o pericárdio para impedir processos fibróticos excessivos. </li><li> Visualize a artéria coronária esquerda descendente (LAD) como um vaso vermelho luz profunda posicionado. Se o rapaz não pode ser visualizada, considerar alguns pontos de referência para aumentar a reprodutibilidade. <ol><li> Para o modelo de enfarte crónica, colocar a ligadura no meio do lado ventral do coração (entre a aurícula e do vértice), tendo como referência a veia, como mostrado na Figura 1C. Vincular ambos os ramos da artéria 0/7 usando sutura de seda para obter uma anterior e posterior infarto transmural. A cor cinza indica a posição da ligadura e pode ser repetido se necessário (Figura 1C). </li><li> Para modelo de isquemia / reperfusão, colocar a ligadura sob a aurícula, sobre o corpo principal de LAD (Figura 1D). O ligtura está localizada ao longo de um tubo de silicone para proteger a integridade do recipiente. A cor cinza indica a área infartada e deve aparecer em todo o coração (Figura 1D). Coloque suturas temporais nas costelas durante o período de isquemia e umedeça com uma compressa para evitar a secagem do tecido. Após a isquemia, remover o tubo de silicone e cortar a sutura com pequenas tesouras para visualizar a reperfusão. </li></ol></li><li> Ao lado dos anestésicos e analgésicos utilizados no início do procedimento (passos 2.1 e 2.2), use 0,5% de isoflurano durante a cirurgia para garantir o conforto adequado do animal, ou siga as orientações de cuidados de animais de sua instituição. </li></ol> 4. Sutura e Recuperação <ol><li> Eliminar o ar residual do tórax através do preenchimento com solução salina isotônica quente. </li><li> Feche o tórax com 3 suturas 0/6 (como mostrado na Figura 2A e 2B). Posicionar as suturas mediais a um ângulo de 90 °, para assegurar queealed encerramento das nervuras, como se mostra na Figura 2 (Figura 2A, B). </li><li> Fechar a camada muscular com duas suturas (Figura 2C) e a pele com 3-4 suturas 0/6 (Figura 2D). Executar essas suturas separadamente para obter uma janela adequada para posterior medida ecocardiográfica. </li><li> Desligue a cânula de intubação do ventilador e permitir a respiração espontânea. Para posterior identificação, marcar o mouse usando o sistema local (pedir o oficial de bem-estar animal de sua instituição). </li><li> Deite o mouse no lado esquerdo sob a luz vermelha até que ele acorda. Não deixe um animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente. Não permita que um animal que tenha sido submetido a cirurgia para estar na companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. </li><li> Gerencie terapia da dor com buprenophine 0,1 mg / kg de peso corporal, por via subcutânea, para os próximos três dias, seguindo as orientações de cuidados de animais de sua instituição. </li&gt; </ol> 5. Análise do Infarto do Miocárdio <ol><li> Regularmente monitorar a função cardíaca por meio de ecocardiografia (Figura 3A): a fração de ejeção, fração de encurtamento, o débito cardíaco e as dimensões do coração. </li><li> Anestesiar os animais utilizando injecção intraperitoneal de 100 mg / kg de cetamina e 10 mg / kg de xilazina. Confirmar anestesia adequada antes da cirurgia pela ausência de reflexos. </li><li> Abra a cavidade torácica e extirpar do coração, colocando-o em solução PBS estéril lavagem extensivamente o sangue restante. </li><li> Se necessário, recolher o sangue directamente do coração, evitando a lesão das regiões infracted, ou após a remoção do coração, a partir da cavidade torácica. </li><li> Após a lavagem, parar o coração em Diastola em solução de KCl saturada (steril filtrada 3M KCl em PBS). Para a análise histológica corrigir o coração em formol 10% e prossiga com o Passo 5.7. </li><li> Se necessário, medir a viabilidade do carrocélulas cardíacas por cloreto de tetrazólio Evans-Azul / trifenil (TTC) coloração. Após a reconstrução da ligadura inicial no local, o coração perfundir com 200 ul de uma solução de azul de Evans% usando uma cânula aórtica e congelar o coração num pequeno saco de plástico a -20 ° C, sem lavagem. <ol><li> Após 2 h, executar 5 slides transversalmente usando um bisturi afiado e incubar durante 10-15 minutos em solução de TTC a 37 ° C, tal como descrito por fabricado. Fixar as lâminas durante 10 minutos em 10% de formalina e colocá-los entre as lâminas microscópicas para posterior análise. </li><li> Incorporar o tecido cardíaco em parafina, posicionando-se o coração na ponta, para efectuar o seccionamento transversal. Realizar secção série de 5 um. Recolher os primeiros 20 seções e descartar o próximo 300 m. Continuar o protocolo de secção até que o nível da válvula mitral foi atingido (Figura 3A, B). As secções em série, 400 um entre si ao longo de todo o coração são recolhidos e podem ser corados fou a análise qualitativa e quantitativa. </li></ol></li><li> Meça o tamanho do infarto usando uma etapa de Gomori coloração 6-8. </li><li> Analisar a angiogênese, conteúdo de colágeno ou recrutamento de células inflamatórias na secção de série utilizando a coloração imuno habitual. </li></ol>

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	<li>Liehn, E. A., Postea, O., Curaj, A., Marx, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+after+myocardial+infarction,+between+fantasy+and+reality:+the+role+of+chemokines.">Repair after myocardial infarction, between fantasy and reality: the role of chemokines.</a> J Am Coll Cardiol. 58 (23), 2357-2362 (2011).</li><li>Liehn, E. 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A., Koenen, R. R., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-inflammatory+therapeutic+approaches+to+reduce+acute+atherosclerotic+complications.">Anti-inflammatory therapeutic approaches to reduce acute atherosclerotic complications.</a> Curr Pharm Biotechnol. 13 (1), 37-45 (2012).</li><li>Liehn, E. A., Zernecke, A., Postea, O., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines:+inflammatory+mediators+of+atherosclerosis.">Chemokines: inflammatory mediators of atherosclerosis.</a> Arch Physiol Biochem. 112 (4-5), 229-238 (2006).</li><li>Kolk, M. V. 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The authors have nothing to disclose.

Durante o procedimento, há alguns pontos críticos a serem observados: a intubação, a abertura da cavidade torácica ea ligadura LAD. O primeiro passo crítico é a intubação do animal antes experiements. Muitos grupos são usando um suporte vertical para a fixação do rato e uma fonte de luz para inserir a cânula directamente na traqueia. Este método tem incerteza quanto à inserção correta da cânula na traquéia e é a mais propensos a falhas pelos novatos. Fazendo uma pequena incisão, a posição da cânula pode ser controlada durante toda a manobra, diminuindo assim a taxa padrão. Além disso, a traqueotomia é ultrapassado, diminuindo assim as complicações e reduzir o tempo de operação. O próximo passo é crítico da abertura da cavidade torácica. A esternotomia mediana representa uma manobra de alto risco atrasar a recuperação dos animais. A incisão lateral esquerdo que implica o corte de 2-3 costelas 15 </sup&gt;, leva a recuperação deficiente e aumento da mortalidade. Nós utilizado no modelo de pequena incisão, discreta entre as costelas que oferecem carga mínima. Os animais recuperar muito rapidamente após a cirurgia e não apresentam defeitos ou cura perturbado. O espaço inter-costal inferior é tomado como ponto de referência. Considerando isso, o acesso adequado e diferenciado para o lugar ligadura para crônico e isquemia / reperfusão modelo, não levanta problemas sérios. A ligadura si representa o passo mais crítico. A artéria coronária descendente esquerda é difícil de ser visualizada, e muitas vezes precisa ser vinculado sem vista. Por isso, alguns pontos de referência anatômicos são apontados para ajudar o cirurgião a realizar a ligação correta. Para o modelo de enfarte crónico, a ligadura é colocada no meio do lado ventral do coração, entre a aurícula e o vértice, acima do fim da veia principal anterior (Figura 2B). A eficiência pode ser controencheram visualizando a aparência da cor cinzenta nas áreas afectadas. Se a área enfartada aparece anterior e não inclui a parede posterior, um novo fio de sutura pode ser colocado à esquerda do primeiro fio de sutura. A principal raiz do LAD é sempre visível sob a orelha 18 e, portanto, não apresenta graves problemas em detectar esta parte. No entanto, a aurícula apresenta o maior risco de sangramento e precisa ser tratado com cuidado. O procedimento é limitada pela existência de equipamento adequado. Um sistema de anestesia adequada ventilador e para os pequenos animais são caros e requerem conexões com sistema de gás e ventilação da sala. Além disso, uma supervisão rigorosa dos animais é necessária na primeira semana após o procedimento para detectar a possível clínica. Para examinar a função cardíaca durante o experimento, de alta resolução ultra-som, complexo do sistema de perfusão Langendorf, ou pequenas medições cateter intraventricular são necessários, involving altos custos e conhecimentos adicionais. Considerando-se o enfarte do miocárdio, não há métodos alternativos disponíveis para reproduzir a complexidade dos acontecimentos in vitro. Dependendo do ponto de interesse, ex vivo de perfusão de coração isolado no sistema de Langendorff fornece informações sobre a contratilidade, a função cardíaca e viabilidade miocárdica em resposta a diferentes estímulos ou drogas. No entanto, exclui todas as interferências de componentes do sangue e do sistema imunitário, e não é indicado para estudos de longo-de remodelação e cicatrização após infarto do miocárdio. Depois de realizado o procedimento de enfarte do miocárdio, todos os outros análise funcional pode ser realizada, como medições da pressão intraventricular, ultra-som (sistemas de ultra-som pequeno animal) ou isolado do coração de Langendorff-perfusão. Além disso, todas as análises biológicas e moleculares podem ser realizados para identificar células, proteínas, mRNAs, microARNs, GEnes ou outros biomarcadores, que podem ser utilizados como alvos terapêuticos para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento de enfarte do miocárdio.

O infarto do miocárdio é uma das principais causas de morte nos países industrializados. Apesar do progresso inegável de abordagens diagnósticas e terapêuticas, as doenças cardiovasculares ainda são a principal causa de mortalidade. Dada a expectativa de vida melhorou e os riscos relacionados com a vida, é esperado um aumento contínuo na incidência de doenças cardiovasculares no futuro. Por conseguinte, existe uma forte necessidade de estabelecer e validar novas abordagens para o tratamento de doenças cardiovasculares. As informações de estudos em seres humanos sofrem de suas limitações, esses estudos geralmente são insuficientes para explicar e compreender os mecanismos a nível molecular, sendo incapaz de fornecer soluções para estes graves problemas de saúde. Além disso, a pesquisa básica tem sido limitada devido à complexidade e dificuldade para reproduzir os mecanismos de doenças cardiovasculares em laboratório. Portanto, para aumentar o nosso conhecimento sobre a fisiopatologia de cardiodoenças vasculares, é essencial para validar modelos animais 1,2. No entanto, para identificar todas as cascatas de eventos moleculares envolvidos na cicatrização após enfarte do miocárdio, a análise em diferentes pontos de tempo é necessário, causando um grande número de experiências animais. Experimentos de infarto do miocárdio são muitas vezes realizadas usando modelos animais. Induzindo o infarto do miocárdio em pequenos animais 11/03 é o modelo mais adequado e eficiente empregada para investigar eventos celulares e moleculares do que as grandes modelos animais. Além disso, nenhuma outra espécie apresenta a disponibilidade das estirpes transgénicas ou como ratinhos knockout 12. Estes modelos de ratinho são altamente úteis em outras doenças, incluindo patologias cardiovasculares (tal como a aterosclerose, a restenose de stents) 13,14. Além disso, o período de gravidez de baixo e do elevado número de progênies qualificar modelos de mouse como o sistema mais atraente para estudar mecanismos moleculares de infa miocárdiorction 12. No entanto, o tamanho do coração nos ratos espera alta precisão da manipulação durante a microcirurgia. Ensinar esse pessoal de cirurgia qualificados e especializados é um demorado e processo intensivo de trabalho. Portanto, aqui apresentamos um procedimento de microcirurgia detalhada, incluindo dicas e truques para orientar os colaboradores, mesmo com qualificações médias, como estudantes ou técnicos para executar o modelo de infarto do miocárdio complexo em camundongos. Inicialmente, a intubação é realizada por meio de uma pequena cânula, sem utilizar a traqueotomia. A incisão torácica está localizado na área intercostal, evitando lesões de nervuras ou / e do tecido circundante. Esta sub-passo é altamente relevante para assegurar a recuperação e cura de 15 rápido. A ligadura é feita diferencial para modelos de isquemia crônica e isquemia / reperfusão, para uma elevada taxa de sobrevivência, mantendo um tamanho significativo infarto. Nossa experiência mostra that usando sutura de seda garante uma reprodutibilidade maior em comparação com crio lesões 16. Em conclusão, o método aqui descrito é aplicável em ambos os modelos de isquémia crónica e isquemia / reperfusão, em animais de pequeno porte. As dicas e truques apresentados neste procedimento são destinadas a permitir que o pessoal com qualificação ainda baixa ou média para aplicá-lo em pequenos modelos animais.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZ/X9</td><td></td></tr><tr><td>Mouse ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730043</td><td>Model Minient 845</td></tr><tr><td>Dual Anesthesia System (Tabletop Version)</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Selfcontained isofluranebased anesthesia unit for use on lab tables, with a compact 8&quot; x 11&quot; footprint.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Intubation cannula</td><td>Harvard Apparatus</td><td>732737</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST, Germany</td><td>9119700</td><td>standard tip curved 0.17 mm x 0.1 mm</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST, Germany</td><td>9146011</td><td>straight</td></tr><tr><td>Vannas scissor</td><td>Aesculap, Germany</td><td>OC 498 R</td><td></td></tr><tr><td>Retractors</td><td>FST, Germany</td><td>1820010</td><td>2.5mm wide</td></tr><tr><td>Retractors</td><td>FST, Germany</td><td>1820011</td><td>5 mm wide</td></tr><tr><td>Wire handles</td><td>FST, Germany</td><td>1820005</td><td>&amp;nbsp;10 cm</td></tr><tr><td>Wire handles</td><td>FST, Germany</td><td>1820006</td><td>&amp;nbsp;14 cm</td></tr><tr><td>Ketamine 10%</td><td>CEVA, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 2%</td><td>Medistar, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bepanthene eye and nose cream</td><td>Bayer, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon tube</td><td>IFK Isofluor, Germany</td><td>custommade&amp;nbsp; product</td><td>diameter 500 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>section thickness 100 &amp;micro;m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>polytetrafluorethylene catheter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PROLENE Suture 6/0&amp;nbsp;</td><td>ETHICON</td><td>8707H</td><td>polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC1, 13 mm, 3/8 Circle</td></tr><tr><td>7/0 Silk</td><td>Seraflex</td><td>IC 1005171Z</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasound&amp;nbsp;</td><td>Vevo, Canada</td><td>770 Vevo</td><td></td></tr></tbody></table>

minimal invasive surgical procedure of inducing myocardial infarction in mice

O infarto do miocárdio ainda permanece a principal causa de morte nos países ocidentais, apesar de progressos consideráveis ​​na área de desenvolvimento de stent nas últimas décadas. Para esclarecimento dos mecanismos subjacentes eo desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, a disponibilidade de modelos animais válidos são obrigatórios. Desde que nós precisamos de novos insights sobre pathomechanisms de doenças cardiovasculares sob as condições in vivo para combater infarto do miocárdio, a validade do modelo animal é um aspecto crucial. No entanto, a protecção dos animais são altamente relevantes neste contexto. Portanto, estabelecer um modelo minimamente invasiva e simples de infarto do miocárdio em ratos, o que garante uma alta reprodutibilidade ea taxa de sobrevivência dos animais. Assim, este modelos satisfaz as exigências do princípio 3R (substituição, aperfeiçoamento e redução) para experimentos com animais e assegurar a informação científica necessária para posterior desenvolvimento de estratégias terapêuticas para cardiovdoenças ascular.

O procedimento de infarto do miocárdio ocorre dentro de 25-30 min e mostra uma taxa de mortalidade de 10%. Após a cirurgia, os ratos recuperar da anestesia dentro do próximo 15 min. Sem deficiência física foi observada para o mouse operado. No entanto, há um maior risco de rotura cardíaca uma semana após enfarte do miocárdio pós-crónica, se os processos de reparação são perturbados durante a fase inflamatória. Uma vez que o coração é capaz de alterar significativamente as suas dimensões durante a bombagem, é importante que todos os corações recolhidos para ser parado na mesma posição, por exemplo, em Diastola. Isto pode ser conseguido por perfusão do coração com uma solução saturada de KCl. O aumento da concentração de K + blocos extracelulares as bombas iónicas, diminui o potencial de repouso da membrana das células cardíacas, o que resulta numa paragem cardíaca diastólica de actividade. A área de enfarte pode ser observado na análise de ultra-sons (Figura 3A, painel inferior). Em comparação ao miocárdio normal, regiões isquêmicas aparecer fino e hipocinético (Figura 3A, painel superior). Dependendo do modelo utilizado, o tamanho do enfarte serão diferentes. O modelo de enfarte crónica induz circular enfarte, transmural do vértice (Figura 3B), enquanto que a isquemia / reperfusão induz um, meio-parede fina e ao longo de todo o coração (Figura 3C). Existem muitos métodos para determinar o tamanho do enfarte. Se o objectivo é o de analisar o efeito directo na viabilidade cardíaca, uma Evans Azul / TTC coloração 18 é indicado para ser realizada pelo menos 2 horas após a reperfusão, para ser capaz de ver qualquer mudança no miocárdio. As secções podem ser analisadas imediatamente (Figura 3B, painel do meio) depois da coloração ou pode ser mantida entre as lâminas de vidro em formalina durante 2-3 dias (Figura 3C, painel do meio). A área azul representa o miocárdio normal, não afetada pela isquemia. A área vermelha representa o miocárdio viável dentro the área isquêmica (miocárdio de risco), ea área branca representa o tecido morto. Geralmente, o tamanho do enfarte é expressa como percentagem da área de risco. A cicatriz madura resultante após os processos de remodelação pode ser facilmente medido por immunohistolgy usando um passo de coloração de Gomori. Áreas azuis manchados de infartados e manchados de vermelho saudáveis ​​ventriculares (Figura 3B e C, painéis à direita) são determinados na primeira seção de cada nível até que a válvula mitral. Para evitar a variação devida à ligação de LAD em diferentes níveis, o enfarte de toda a secção é considerado e expresso como uma percentagem do volume ventricular esquerda total. Um volume de enfarte de 15-20% no modelo de enfarte crónico e de 10-15% após o modelo de isquemia / reperfusão pode ser alcançado. Além disso, o modelo de enfarte crónica vai induzir uma dilatação acentuada, não observado no modelo de isquemia / reperfusão (Figura 3B e C righpainel de t). Procedimentos de coloração convencionais podem ser usados, tais como: coloração CD31 usado para revelar a angiogénese (vermelho, Figura 4A) ou coloração com actina de músculo liso para determinar miofibroblastos (verdes, a Figura 4B). Coloração por fluorescência dupla também pode ser aplicado para identificar diferentes moléculas alvo na área de enfarte, visto que a ausência de cardiomiócitos não dá nenhuma de auto-imunofluorescência (Figura 4C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig1.jpg" /> Figura 1: Incisão medial e inserção da cânula da intubação (A). A visualização estereomicroscopia da cânula de metal através da transparência do tecido (B). Os anéis traqueais (setas azuis) e da cânula (seta preta) são apontados. A incisão intercostal, para o mo enfarte crónicadel ea ligadura de LAD (C). A ligadura está localizado no meio do coração (entre a aurícula e do vértice, preto no painel inferior), tomando como referência a extremidade do veia (esquemático em azul, painel inferior). Ambos os ramos da artéria deve ser ligado (vermelho no painel inferior). A cor cinza indica a área infartada e ele aparece na parte inferior metade do coração (painel inferior direito). A ligadura para o modelo de isquemia / reperfusão é feita sob a aurícula, a ligação do corpo principal de LAD (vermelho no painel inferior) ao longo de um tubo de silicone (lado direito) (D). A cor cinza indica a área de infarto, que está presente no coração de todo (painel inferior direito). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52197/52197fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig2.jpg" /> Figura 2: </strong&gt; Os selos de sutura a incisão torácica costelas se as suturas medial estão posicionadas segundo um ângulo de 90 ° em ambas crónica (A) e de isquemia / reperfusão modelo (B, painel esquerdo) imagiologia in vivo de nervuras de sutura. (C, painel esquerdo ), sutura muscular (C, painel do meio) e sutura da pele (C, painel direito). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52197/52197fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig3.jpg" /> Figura 3: As imagens ecocardiográficas. Imagens de normal (A, painel superior) e áreas enfartadas (A, painel inferior), são adquiridos no eixo comprido (longitudinais, painéis esquerdos) ou no eixo curto (transversal, painéis direitos) .. Enfarte induzida por ligadura crónica(B) e por uma isquemia h seguida de reperfusão (C). Evans Blue / TTC coloração permite a identificação de perfusão (azul) / áreas não perfundidos bem como a viabilidade (vermelho) / (branco) miocárdio morto (B, C, painéis de média). Uma etapa de coloração de Gomori permite a identificação de áreas infartadas (azul), e os diferencia as regiões normais (vermelho) (B, C, painéis à direita). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52197/52197fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52197/52197fig4.jpg" /> Figura 4: Diferentes colorações podem ser realizadas em área de infarto, tal como descrito para CD31 neo-angiogénese (A, vermelho, setas simples), ou de actina do músculo liso para miofibroblastos (B g;reen, setas simples), bem como coloração dupla (C, CD31-vermelho / verde-actina de músculo liso), contrastadas com DAPI para núcleos (azul). Miofibroblastos podem ser diferenciadas facilmente a partir de células musculares lisas de artérias pequenas ou grandes, que são sempre acompanhados por uma camada endotelial (C, setas). Setas duplas apontar o autofluorescência eritrócitos. Escala das barras 50 um.

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Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimal procedimento cirúrgico invasivo de induzir Infarto do Miocárdio em Ratos

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

minimal-invasive-surgical-procedure-inducing-myocardial-infarction

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

27.5K visualizações.  RWTH Aachen University, Germany. A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

Vídeo: Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Coronary Artery Ligation and Intramyocardial Injection in a Murine Model of Infarction

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling. 
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy. 
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed. 
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.

Numerous genetic manipulations and/or intramyocardial injections of genes, proteins, cells, and/or biomaterials are superimposed upon the dimension of time in studies of acute ischemia/ reperfusion injury and chronic remodeling in mice. This video illustrates the microsurgical procedures for ischemia/reperfusion, permanent coronary artery ligation, and intramyocardial injection studies.

Ligadura da artéria coronária e injeção intramiocárdica em um modelo murino de infarto

Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo.  With the advent of genetic modifications to ...

Medicina

Modified Technique for Coronary Artery Ligation in Mice

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI we need better knowledge about pathophysiology of myocardial ischemia. This knowledge may be valuable to define new therapeutic targets for innovative cardiovascular therapies4. Experimental MI model in mice is an increasingly popular small-animal model in preclinical research in which MI is induced by means of permanent or temporary ligation of left coronary artery (LCA)5. In this video, we describe the step-by-step method of how to induce experimental MI in mice.
The animal is first anesthetized with 2% isoflurane. The unconscious mouse is then intubated and connected to a ventilator for artificial ventilation. The left chest is shaved and 1.5 cm incision along mid-axillary line is made in the skin. The left pectoralis major muscle is bluntly dissociated until the ribs are exposed. The muscle layers are pulled aside and fixed with an eyelid-retractor. After these preparations, left thoracotomy is performed between the third and fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The proximal segment of LCA artery is then ligated with a 7-0 ethilon suture which typically induces an infarct size ~40% of left ventricle. At the end, the chest is closed and the animals receive postoperative analgesia (Temgesic, 0.3 mg/50 ml, ip). The animals are kept in a warm cage until spontaneous recovery.

The surgical procedure used to induce experimental myocardial infarction in mice begins with left thoracotomy between the third and the fourth ribs in order to visualize the anterior surface of the heart and left lung. The left coronary artery is ligated, the chest is closed and the mouse is allowed to recover spontaneously.

Técnica modificada para ligação da artéria coronária em ratos

Myocardial infarction (MI) is one of the most important causes of mortality in humans1-3. In order to improve morbidity and mortality in patients with MI ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms at work during MI and developing effective therapeutic approaches requires methodology to reproducibly simulate the clinical incidence and reflect the pathophysiological changes associated with MI. Here, we describe a surgical method to induce MI in mouse models that can be used for short-term ischemia-reperfusion (I/R) injury as well as permanent ligation. The major advantage of this method is to facilitate location of the left anterior descending artery (LAD) to allow for accurate ligation of this artery to induce ischemia in the left ventricle of the mouse heart. Accurate positioning of the ligature on the LAD increases reproducibility of infarct size and thus produces more reliable results. Greater precision in placement of the ligature will improve the standard surgical approaches to simulate MI in mice, thus reducing the number of experimental animals necessary for statistically relevant studies and improving our understanding of the mechanisms producing cardiac dysfunction following MI. This mouse model of MI is also useful for the preclinical testing of treatments targeting myocardial damage following MI.

We introduce a surgical method to induce experimental ischemia/reperfusion (I/R) injury to simulate myocardial infarction (MI) in mouse models that allows for more clarity in positioning of the ligation on the left anterior descending artery (LAD) to increase the reproducibility of MI experiments in mice.

Um modelo murino de isquemia-reperfusão, através da ligadura da artéria Descendente Anterior Esquerda

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that MicroCT provides quantitative high-resolution three-dimensional (3D) anatomical data non-destructively and longitudinally. Most importantly, with the development of a novel preclinical iodinated contrast agent called eXIA160, functional and metabolic assessment of the heart became possible. However, prior to the advent of commercial MicroCT scanners equipped with X-ray flat-panel detector technology and easy-to-use cardio-respiratory gating, preclinical studies of cardiovascular disease (CVD) in small animals required a MicroCT technologist with advanced skills, and thus were impractical for widespread implementation. The goal of this work is to provide a practical guide to the use of the high-speed Quantum FX MicroCT system for comprehensive determination of myocardial global and regional function along with assessment of myocardial perfusion, metabolism and viability in healthy mice and in a cardiac ischemia mouse model induced by permanent occlusion of the left anterior descending coronary artery (LAD).

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

This method outlines the use of Quantum Micro-Computed Tomography (MicroCT) to assess cardiac morphology, function, perfusion, metabolism and viability with iodinated contrast agent in mice with experimentally-induced myocardial ischemia. The technique can be applied for non-destructive high-throughput longitudinal in vivo imaging of various animal models of human heart disease.

In Vivo quantitativa Avaliação da Estrutura do miocárdio, função, perfusão e viabilidade Usando Cardiac Micro-Tomografia Computadorizada

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Bioengenharia

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modelo de infarto do miocárdio murino usando ligadura permanente da artéria coronária descendente anterior esquerda

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily and highly reproducible MI induction procedure is required to obtain further insight and better understanding of the underlying pathological changes. This procedure can also be used to evaluate the effects or potency of new and promising treatments (as drugs or interventions) in acute MI, subsequent remodeling and heart failure (HF). After intubation and pre-operative preparation of the animal, an anesthetic protocol with isoflurane was performed, and the surgical procedure was conducted&#160;quickly. Using a minimally invasive approach, the left anterior descending artery (LAD) was located and occluded by a ligature. The occlusion can be performed acutely for subsequent reperfusion (ischemia/reperfusion injury). Alternatively, the vessel can be ligated permanently to investigate the development of chronic MI, remodeling or HF. Despite common pitfalls, the drop-out rates are minimal. Various treatments such as remote ischemic conditioning can be examined for their cardioprotective potential pre-, peri- and post-operatively. The post-operative recovery was quick as the anesthesia was precisely controlled and the duration of the operation was short. Post-operative analgesia was administered for three days. The minimally invasive procedure reduces the risk of infection and inflammation. Furthermore, it facilitates rapid recovery. The &#8220;working heart&#8221; measurements were performed ex vivo and enabled precise control of preload, afterload and flow. This procedure requires specific equipment and training for adequate performance. This manuscript provides a detailed step-by-step introduction for conducting these measurements.

This article presents an efficient method to perform myocardial ischemia and subsequent chronic reperfusion in rats using a minimally invasive approach. In addition, left ventricular hemodynamic function of rats is assessed by echocardiography and isolated working heart methods.&#160;

Método invasivo semi-mínimo para induzir infarto do miocárdio em ratos e a avaliação da função cardíaca por um sistema cardíaco de trabalho isolado

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...

A Modified Simple Method for Induction of Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction (MI) represents one of the leading causes of death. MI models are widely used for investigating the pathomechanisms of post-MI remodeling and evaluation of novel therapeutics. Different methods (e.g., isoproterenol treatment, cryoinjury, coronary artery ligation, etc.) have been used to induce MI. Compared with isoproterenol treatment and cryoinjury, coronary artery ligation may better reflect the ischemic response and chronic remodeling after MI. However, traditional methods for coronary ligation in mice are technically challenging. The current study describes a simple and efficient process for induction of MI in mice with readily available materials. The mouse chest skin was cut open under stable anesthesia. The heart was immediately externalized through the intercostal space after blunt separation of the pectoralis major and pectoralis minor. The left anterior descending branch (LAD) was ligated with a 6-0 suture 3 mm from its origin. Following LAD ligation, staining with 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC) indicated successful induction of MI and temporal changes of post-MI scar size. Meanwhile, survival analysis results showed overt mortality within 7 days after MI, mainly due to cardiac rupture. Moreover, post-MI echocardiographic assessment demonstrated successful induction of contractile dysfunction and ventricular remodeling. Once mastered, an MI model can be established in mice within 2-3 min with readily available materials.

Under adequate anesthesia, the mouse heart was externalized through the intercostal space, and myocardial infarction was successfully induced by ligating the left anterior descending artery (LAD) using materials readily available in most laboratories.

Um Método Simples Modificado para Indução de Infarto do Miocárdio em Camundongos

Myocardial infarction (MI) represents one of the leading causes of death. MI models are widely used for investigating the pathomechanisms of post-MI ...

Induction of Myocardial Infarction and Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of heart reflow and induce secondary myocardial injury. A simple and reproducible model of myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury is a good tool for researchers. Here, a customizable method to create a myocardial infarction (MI) model and MIRI by precision ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD) through micromanipulation is described. Accurate and reproducible ligature positioning of the LAD helps obtain consistent results for heart injury. ST-segment changes can help to identify model accuracy. The serum level of cardiac troponin T (cTnT) is used to assess the myocardial injury, cardiac ultrasound is employed to evaluate the myocardial systolic function, and Evans-Blue/triphenyl tetrazolium chloride staining is used to measure infarct size. In general, this protocol reduces procedure duration, ensures controllable infarct size, and improves mouse survival.

Here we describe a simple and reproducible method that can induce myocardial infarction or myocardial ischemia-reperfusion injury in mice by precision ligation of the left anterior descending coronary artery through micromanipulation.

Indução de Infarto do Miocárdio e Lesão de Isquemia-Reperfusão Miocárdica em Camundongos

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of ...

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) are a promising cell source for cardiac repair after ischemic damage. However, a low grafted rate is a significant obstacle for effective cardiac tissue regeneration after transplantation. This protocol shows that multiple hiPSC-CM ultrasound-guided percutaneous injections into an MI area effectively increase cell transplantation rates. The study also describes the entire hiPSC-CM culture process, pretreatment, and ultrasound-guided percutaneous delivery methods. In addition, the use of human mitochondrial DNA help detect the absence of hiPSC-CMs in other mouse organs. Lastly, this paper describes the changes in cardiac function, angiogenesis, cell size, and apoptosis at the infarcted border zone in mice 4 weeks after cell delivery. It can be concluded that echocardiography-guided percutaneous injection of the left ventricular myocardium is a feasible, relatively invasive, satisfactory, repeatable, and effective cellular therapy.

Ultrasound-guided cell delivery around the site of myocardial infarction in mice is a safe, effective, and convenient way of cell transplantation.

Implante de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Ultrassom em Camundongos Infartados do Miocárdio

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

Left Coronary Artery Ligation: A Surgical Murine Model of Myocardial Infarction

Ischemic heart disease and subsequent myocardial infarction (MI) is one of the leading causes of mortality in the United States and around the world. In order to explore the pathophysiological changes after myocardial infarction and design future treatments, research models of MI are required. Permanent ligation of the left coronary artery (LCA) in mice is a popular model to investigate cardiac function and ventricular remodeling post MI. Here we describe a less invasive, reliable, and reproducible surgical murine MI model by permanent ligation of the LCA. Our surgical model comprises of an easily reversible general anesthesia, endotracheal intubation that does not require a tracheotomy, and a thoracotomy. Electrocardiography and troponin measurement should be performed to ensure MI. Echocardiography at day 28 after MI will discern heart function and heart failure parameters. The degree of cardiac fibrosis can be evaluated by Masson's trichrome staining and cardiac MRI. This MI model is useful for studying the pathophysiological and immunological alterations after MI.

Presented here is a surgical procedure for permanent ligation of the left coronary artery in mice. This model can be used to investigate the pathophysiology and associated inflammatory response after myocardial infarction.

Laqueadura da Artéria Coronária Esquerda: Um Modelo Murino Cirúrgico de Infarto do Miocárdio

Ischemic heart disease and subsequent myocardial infarction (MI) is one of the leading causes of mortality in the United States and around the world. In ...