Name: methods to assess subcellular compartments of muscle in c. elegans
Uploaded: 2014-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
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This work was supported by a grant from the US National Institutes of Health National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (AR-054342) to NJS. CJG was funded by a Doctoral training studentship funded by the University of Nottingham. JJB was funded by an MRC Doctoral training award (J500495). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. Cepas, Cultura, e de Microscopia <ol><li> Manipular e manter cepas de C. elegans como descrito anteriormente 19. As estirpes estão disponíveis a partir do Centro de Genética Caenorhabditis (CGC). NOTA: As estirpes utilizadas nestas experiências foram CB5600 (ccIs4251 (Pmyo-3 :: Ngfp-lacZ; Pmyo-3 :: Mtgfp) eu; o-8 (e1489 IV)) com proteínas de fusão GFP localizadas para mitocôndrias e núcleos; PJ727 (jls01 (mio-3 :: GFP, rol-6 (su1006)); unc-54 :: lacZ V) com proteínas de fusão GFP localizadas ao aparato contrátil e PD55 (ccIs55 (sup-7 (ST5); unc- 54 :: lacZ) V) com proteínas de fusão β-galactosidase localizadas para o citosol. </li><li> Experimentos de ARNi completos como anteriormente descritos para as experiências com várias gerações de ARNi 13 e ARNi obter bactérias a partir da sequência verificada biblioteca ORF-RNAi construído por Marc Vidal et al. 12. </li><li> Construir cepas contendo &lt;em&gt; CCIs 4251, jls01 ou CCIs 55 usando técnicas convencionais 20. Use esses transgenes para criar uma tensão para avaliar a estrutura da rede mitocondrial, organização miosina ou o estado de Proteostase, respectivamente. Atravesse as tensões em um mutante procura em um desses compartimentos sub-celulares em cada animal é desejado. </li><li> Usar o inibidor de PtdIns-3-quinase, LY-294002 (LY) como previamente descrito 21. Resumidamente, adicionar LY-294002 numa concentração final de 160 uM em cima de placas de OP50-semeado secos NGM. </li><li> Capturar todas as imagens usando um filtro de GFP para experiências baseadas em GFP e um microscópio com um filtro passa-triplo que permite imagens de canais vermelho, verde e azul, simultaneamente, para a avaliação do potencial de membrana vivo com C 32 H 32 Cl 2 N 2 O, vulgarmente comercializado como MitoTracker Red CMXRos. Realizar análise de imagem e figura preparação em software de processamento de imagem. </li></ol><ol><li> Um mínimo de 1 dia antes necessário, fazer tampão M9 - 22,04 mM KH 2 PO 4, 42,27 mM Na 2 HPO 4, NaCl mM 85,56 (concentrações finais), e esterilizar em autoclave. Uma vez arrefecida a 45 ° C, adicionar estéril MgSO 4 a 1 mM após a autoclavagem para evitar a precipitação 22. Permitir que a M9-se arrefecer a 4 ° C, e alíquota em tubos de 50 ml. </li><li> No dia da experiência, adicionar 3 ml de tampão M9 para uma única placa 9 cm, com elevados números de larvas L1. Lava-se a placa várias vezes por aspiração do líquido M9 e pipetagem contra a superfície do agar com a placa mantida num ângulo. </li><li> Lavar os L1 do a partir da placa e, em seguida, transferir o M9 para um tubo de ensaio de 10 ml usando uma pipeta. </li><li> Deixar durante 2,5 min para permitir que a maior adulto e posteriores animais fase larval a cair para o fundo do tubo de teste e os animais L1 menores permanecem perto do top do tampão M9. </li><li> Remover os melhores 500 ul de M9 no tubo de ensaio usando uma pipeta. Em seguida, pipetar as larvas M9 contendo L1 para uma nova placa NGM semeado com 500 mL OP50 sob um escopo dissecar. </li><li> Normalmente, o objectivo de transferir ~ 200-300 larvas L1 por placa. Monitorar diariamente das placas idade adulta e, se necessário, pegar os animais para novas placas NGM OP50 para evitar fonte de alimento OP50 sendo consumido. NOTA: Este é geralmente 1-3 gotas de M9 usando uma pipeta P1000, embora varie, dependendo, em grande medida o número de L1 do na placa original. </li><li> Se estudos prospectivos em animais individuais são desejados, uma vez que os animais atingem a idade adulta, pegar animais individuais para separar placas NGM semeados. Transferência animais cada 24-48 horas para separar os animais de larvas. </li></ol> 3. Movimento Ensaios 19 <ol><li> Um mínimo de 2 horas antes do início da experimentação, remover uma alíquota de 50 ml de M9 e deixar equilibrar à temperatura ambienteratura. </li><li> Escolha um único animal adulto em tampão M9 50 mL em uma lâmina de microscópio. </li><li> Contar o número de curvas do corpo esquerda e para a direita na 10 seg, onde uma curva para a esquerda e uma direita é igual a um acidente vascular cerebral. </li><li> Repetir a contagem de acidentes vasculares cerebrais do corpo para se obter um total de pelo menos 5 medições a partir do qual podem ser tomadas em média. Multiplique esses números por seis a dar a taxa de movimento por min. </li><li> Com uma pipeta, transferir o animal de volta para a placa de Petri. Este método permite a medição temporal do movimento ao longo de todo o tempo de vida em C. elegan s. </li></ol><img alt="A Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: ensaios Movimento. Uma vez que os vermes são colhidos em buffer, uma para a esquerda (A) e um para a direita (B) curva são somados para dar um movimento completo(Acidente vascular cerebral). 4. Imagem de mitocondriais Redes e Sarcômeros em Wall Corpo Muscle <ol><li> NOTA: O mesmo protocolo aplica-se para a imagem latente, tanto da mitocôndria e sarcômeros. </li><li> Sincronize vermes como descrito anteriormente (Seção 1) e crescer para 48-60 horas a 20 ° C, quando eles vão chegar na idade adulta jovem. </li><li> Escolha 20 worms (representativas da placa) das placas em 20 l M9 em uma lâmina de microscópio. </li><li> Aplique uma lamínula e proceder à imagem usando um microscópio de fluorescência sob um filtro GFP (460-500 nm, a luz azul de excitação) em 40X. </li></ol> 5. Avaliação do Potencial de Membrana usando uma In Vivo Ensaio de Acumulação com MitoTracker Red CMXRos (C 32 H 32 Cl 2 N 2 O) <ol><li> Sincronizar CB5600 (Secção 1), todas marcadas com GFP na mitocôndria de músculos, e crescer até à idade adulta precoce em NGM contendo OP50 para 48-60 hr a 20 ° C. </li><li> Adicionar 100 ul de DMSO para a alíquota de 50 ug de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O para produzir uma solução stock de 940,692 uM. </li><li> Tomar 1 ml da solução de estoque 940,692 pM e ressuspender em 199 ul M9 para criar uma solução de trabalho de 4,70 uM (4,70346 uM). Prepare esta em marrom tubos de 1,5 ml, porque C 32 H 32 Cl 2 N 2 O é fotossensível. </li><li> Preparar alíquotas de 20 mL da solução 4,70 mM (20 vermes adultos por 20 l alíquota) de trabalho. </li><li> Escolher 20 animais adultos em 20 ul de 4,70 uM C 32 H 32 Cl 2 N 2 O em castanhos os tubos de 1,5 ml. Incubar a 20 ° C durante 1 hora. </li><li> Após a incubação de 1 hora, adicionar 1 ml M9 para os marrons tubos de 1,5 ml contendo os vermes, centrifugar a 2000 xg por 10 segundos e, em seguida, remover o sobrenadante. Repita esta etapa de lavagem antes de ressuspender a pellet verme e transferir os restantes 20 μl (contendo os vermes) para um slide para a imagem latente. </li><li> Tome imagens da mitocôndria com 40X de ampliação usando um filtro de passagem de triplo que permite a visualização de ambos os canais vermelho, azul e verde simultaneamente. Imagiologia utilizando o filtro de passagem tripla mostra a co-localização de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O com GFP localizada a mitocôndria que aparecem como laranja. </li><li> Tendo tomado uma imagem da mitocôndria alaranjado, foto-branquear o animal por 10 segundos usando a luz de comprimento de onda 540/25 nm em configurações máximas com todos os filtros removidos. Isto irá branquear a vermelho dentro das mitocôndrias e revelar a GFP mitocondrial só para confirmar co-localização em mitocôndrias musculares. </li></ol> 6. Avaliação da degradação da proteína muscular em C. elegans <ol><li> Sincronize PD55s (ou qualquer tensão contendo o transgene lacZ) sobre a placas NGM semeado com OP50 (Seção 1). Crescer para a idade adulta em 48-60 horas a 20 ° C. </li><li> Escolha 20 vermes adultos em 20 mL DDH 2 O em uma lâmina de microscópio. Tenha cuidado para tentar pegar apenas o verme, e não todas as bactérias com a picareta. Rotular a lâmina de microscópio a lápis. </li><li> Colocar no exsicador durante 30 min para secar e rachar a cutícula dos animais. Assegurar uma boa vedação em exsicador com massa em torno do selo. </li><li> Verifique a dessecação tem sido eficaz no âmbito de um escopo de dissecação (Figura 2). </li><li> Submerge a lâmina de microscópio em acetona gelada durante 3,5 min, em seguida, deixar a lâmina de microscópio sobre uma toalha de papel à temperatura ambiente durante 15 min para permitir que a acetona no slide a evaporar-se. Neste ponto descongelar o tampão de X-gal e à oxidação e permitir equilibrar à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar 2 mL X-gal para 100 mL de buffer oxidação e vortex suavemente para garantir isso é homogênea. Esta é a mistura principal tampão X-gal / oxidação. </li><li> Adicionar 20 ml da mistura principal tampão X-gal / oxidação para cada oárea riginal de 20 vermes. Inspecione sob um escopo dissecar para garantir a mistura principal cobre completamente todos os animais totalmente. Incline a lâmina de microscópio para mover o mix mestre sobre as áreas onde os animais não são cobertos. </li><li> Colocar a lâmina do microscópio numa câmara de humidade durante 1-2,5 h a 20 ° C. Animais imagem quando uma cor azul escuro está presente nos músculos da parede do corpo dos animais controle. Avaliar animais controle sob um escopo dissecar cada 15 minutos para determinar quando os animais deve ser trabalhada. </li></ol><img alt="A Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: Avaliação da degradação da proteína muscular utilizando ensaios β-galactosidase. (A) Os animais que contêm um transgene lacZ são colhidos a partir das placas de Petri de 20 ul ddH2O numa lâmina de microscópio (B). Os animais são dessecada e tornar-se fraturado <strong&gt; (C). Os animais são, em seguida, lavou-se em acetona (D). Uma vez que a acetona evapora a mistura principal tampão X-gal / oxidação é adicionado (E). O desenvolvimento da cor azul em animais de controlo é avaliada a intervalos de 15 min (FL) a partir de t = 0 min (F), até que uma cor azul escuro é obtida através do comprimento dos animais (L). Imagens de vermes são tomadas com ampliação de 2.5X na AE e 8X em FL. Aproxima C, D, F, G e L são 4X a ampliação original.

The authors have nothing to disclose.

Estes métodos permitem a exploração do músculo do macrophysiology de movimento para identificação de defeitos subcelulares que são suficientes para causar um defeito movimento. Quando combinados estes métodos permitem a análise detalhada do músculo. O conhecimento adquirido permite que mais testes de hipóteses orientada para o músculo que pertencem a fisiologia geral, fisiopatologia e envelhecimento. Movimento Ensaios Um defeito movimento indica uma perturbação da função neuromuscular normal. Isto pode ser específico para nervos ou músculos ou que pode ser comum entre os vários tecidos. As fases mais difíceis de completar ensaios movimento está selecionando vermes que são representativas da população e / ou o tratamento, e também garantir que o experimentador não ferir o animal em cima de transferência para M9. É importante ter um tamanho de amostra grande para se obter uma avaliação representativa e precisa do movimento. Quando o ensaio altamente canetaefeitos etrant, por exemplo, como freqüentemente visto em mutantes, uma amostra de dez animais cada avaliado para o movimento dez vezes é suficiente para encontrar diferenças estatisticamente significativas contra o tipo selvagem. No entanto, a simplicidade dos ensaios de circulação e facilidade de cultura de C. elegans significa que centenas de vermes podem ser rapidamente avaliado, a fim de garantir resultados quantitativamente robustos. Ao ensaiar os efeitos que aparecem presente em apenas uma parte de uma população que é importante para determinar qual a proporção da população parece ser afectada, bem como a gravidade dos defeitos nos animais mais afectados. Em tais situações, um maior número de animais deve ser avaliada, a fim de fornecer os dados mínimos para a proporção da população afetada. Frequentemente tanto de drogas e tratamentos de RNAi irá produzir defeitos graves movimento em uma pequena proporção da população. Em alguns casos, o aumento da dose do tratamento e ou o método de entrega irá aumentar a proporção de affected animais e curvas de resposta de dose de corrida pode ser útil para determinar a concentração óptima de um fármaco ou de RNAi. Uma segunda limitação de movimento neste ensaio é que os vermes são manipuladas para avaliar o movimento. Assim, os vermes são ambas estimuladas e submetido a algum grau de stress osmótico quando apanhado em líquido. O grau de stress osmótico pode ser limitada por meio M9 ou BU tampão 19, em oposição à água. Algumas dessas limitações são atenuadas medindo movimento habitual em placas utilizando sistemas de rastreamento disponíveis no mercado 34 ou plug-ins gratuitos para ImageJ 35. Medir a taxa de movimento de um animal pode fornecer informações importantes sobre a saúde geral do músculo, incluindo alterações na função que podem ser medidos ao longo da vida ea não-invasivo deste método é fundamental para futuros estudos da função muscular ao longo da vida. Imagens do aparato contrátil &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; A tensão verme usado aqui para estrutura aparato contrátil imagem foi PJ727 36 que expressa uma proteína de fusão GFP miosina que está localizada a sarcômeros dentro dos músculos da parede do corpo. O uso deste esforço permite a visualização da estrutura do sarcômero em animais vivos. Semelhante ao ensaio de movimento descrito acima, uma das principais vantagens da utilização de GFP marcada sarcómeros para avaliar estrutura sarcómero é que o método é relativamente não-invasiva e, portanto, pode ser usado para seguir prospectivamente estrutura sarcómero em animais individuais ao longo do tempo de vida. A maior dificuldade com este método é que os vermes que está sendo fotografada ainda estão vivos e, portanto, em movimento, o que torna difícil obter imagens bem focadas. Vários métodos podem ser empregues para reduzir o movimento e fazer imagiologia mais simples; estes incluem anestesiar ou paralisar os vermes e imobilização através de pressão, sucção, ou o uso de uma solução de alta viscosidade. Cada um destes métodos de immobilizção tem a desvantagem de que ele pode-se alterar a função neuromuscular. Portanto, é essencial incluir controlos não tratados na análise apropriados. Também pode ser prudente utilizar, pelo menos, dois métodos independentes de imobilização para confirmar os resultados não são devido a problemas com o método de imobilização, dependendo de como amplamente utilizado o método de imobilização é escolhido para a questão em estudo. Aqui nós usamos simples pressão da lamela sobre o worm para induzir movimento reduzida. Depois de colocar a lamela, o líquido sob a lamela irá evaporar ea lamela, consequentemente, começar a produzir mais pressão sobre os vermes, normalmente isso leva 2-5 min para produzir o suficiente movimento reduzido para permitir a fácil criação de imagens. É essencial para monitorar estreitamente os vermes após a lamela foi introduzida como a pressão irá, eventualmente, aumentar o suficiente para fazer com que os vermes para rebentar a partir de uma pressão excessiva, tipicamente 10-15 minutos após a coAlém verslip. Tampão adicional pode ser introduzido com o auxílio de uma pipeta de ponta em torno das bordas da lamela para evitar lesão por esmagamento para os vermes. Verniz de unhas pode ser usado para selar as arestas da lamela de cobertura e impedir a evaporação, embora isto evita a recuperação de animais de sob a lamela de cobertura, se desejado. Da mesma forma, a utilização de grânulos de silicone na solução pode ajudar a reduzir a quantidade de pressão que os locais de lamelas sobre os vermes. Assim como com a avaliação de movimento de um defeito, é importante considerar a penetrância do efeito. Penetrância pode ser considerado alto se 80-100% dos animais apresentam um fenótipo na placa NGM, parcial se 21-79% e de baixo se ≤20% do visor população um afeto. Para efeitos altamente penetrantes, tamanhos de amostra menores podem ser usados ​​para produzir dados quantitativos significativos sobre defeitos sarcômero. Nos casos em que o efeito tem uma penetrância baixa, selecção de animais que exibem um defeito claro movimento em resposta a drogaou tratamento de RNAi pode ser útil no ensaio de defeitos sarcômero na maioria dos animais afectados pelo tratamento. No entanto, não é necessariamente o caso em que a extensão do efeito do tratamento em circulação e da estrutura subcelular é o mesmo. Assim, pode ser desejável para examinar a extensão dos defeitos presentes numa grande população, por exemplo, 100 animais. Isto permite a compreensão da distribuição de defeitos ao longo de uma população. Também pode ser desejável para examinar a extensão do defeito nos animais mais severamente afectados e / ou examinar a correlação entre a extensão da defeito sarcómero e extensão de defeito movimento. As dificuldades potenciais de lado, este método é mais rápido e mais fácil do que outros métodos de avaliação da estrutura do sarcômero. Esta velocidade e facilidade, no entanto, sujeita a uma limitação fundamental, sarcômeros contêm proteínas de fusão GFP não são inteiramente normal 37 e, portanto, a avaliação de sarcômeros interrompido deve ser confirmado utilizando métodos mais intensivos em trabalho adicionais.Estes métodos incluem o uso de luz polarizada 38, phalloidin coloração 39 e 40 de imunofluorescência indireta. Destes métodos, apenas a luz polarizada é relativamente não invasiva; os outros métodos requerem fixação e, por conseguinte, não pode ser utilizado em estudos prospectivos de animais individuais, e elas só podem ser usadas para confirmar, atravessar seccionalmente, os resultados de tais estudos. Imagens de mitocondriais Networks A estirpe sem-fim utilizado para as experiências de imagiologia mitocondriais foi CB5600 7 que expressa uma proteína de fusão de GFP localizada na mitocôndria e uma GFP β-galactosidase proteína de fusão localizada para os núcleos, tanto nos músculos da parede do corpo. Tal como acontece com o uso de PJ727 para sarcômeros de imagem, o uso desta estirpe permite a visualização da estrutura de rede mitocondrial em animais vivos. Assim, esta estirpe pode ser utilizada para avaliar alterações dinâmicas que ocorrem, por exemplo, reduzida mitochondrial fusão e / ou aumento de fissão mitocondrial 41. Além disso, como para sarcômeros de imagem, a maior dificuldade com este método é que os vermes sendo fotografada ainda estão vivas e em movimento, o que torna difícil obter imagens bem focadas. Embora vários métodos, como discutido em maior detalhe acima, pode ser empregue para reduzir o movimento, as mitocôndrias parecem ser particularmente sensíveis a intervenções que induzem a circulação reduzida. Por exemplo, o mais geralmente usado anestésicos componentes alvo da cadeia respiratória mitocondrial e são, por conseguinte, deve ser utilizada com precaução em estudos de estrutura normal e função mitocondrial. Do mesmo modo, a maioria dos agentes paralisantes deve ser utilizada com precaução em estudos de estrutura normal e função mitocondrial, tal como a maioria dos agentes paralisantes causar menos sinal para passar através da junção neuromuscular e desnervação funcional do músculo é suficiente para induzir a fragmentação mitocondrial. Os experimentos deste estudo utilizou pressão para imobilizar animaiss, mas outros têm usado com sucesso levamisol 42, embora seja essencial para os animais imagem imediatamente. Por último, vários contaminantes bacterianos em culturas, por exemplo B. subtilis, pode induzir a fragmentação mitocondrial; Por conseguinte, é essencial incluir controlos não tratados na análise apropriados. Para efeitos altamente penetrantes, tamanhos de amostras menores podem ser utilizados para produzir os dados quantitativos sobre os defeitos significativos de rede mitocondriais. No entanto, devido à prevalência de pequenos defeitos na rede mitocondrial, este pequeno número de animais é provável que seja o dobro do número necessário para a avaliação da estrutura sarcómero. Nos casos em que o efeito tem uma penetrância baixa, a selecção de animais que apresentam claramente um defeito de movimento em resposta a tratamento medicamentoso ou ARNi podem ser úteis no ensaio de defeitos mitocondriais na maioria dos animais afectados pelo tratamento. No entanto, como mencionado acima, não é necessariamente o caso em que omedida do efeito do tratamento em circulação e da estrutura subcelular é o mesmo. Assim, pode ser desejável para examinar a extensão dos defeitos presentes numa grande população, por exemplo 150-200 animais, bem como a extensão da perturbação nos animais mais severamente afectados e da presença ou ausência de extensão da perturbação com a extensão da defeito movimento. Outras estirpes com mitocôndrias marcado por fluorescência pode ser utilizada para confirmar os resultados obtidos em CB5600, contudo, o uso de diferentes proteínas fluorescentes podem influenciar a rede de linha de base das mitocôndrias. Por exemplo, a utilização de uma proteína RFP TOMM-20 de fusão de visualizar as mitocôndrias parece provocar um aumento de fragmentação mitocondrial da linha de base versus a utilização de GFP localizada 17 para as mitocôndrias. Enquanto outros métodos tais como microscopia electrónica de imunofluorescência e pode ser utilizado para avaliar a estrutura mitocondrial, eles não permitem a avaliação in vivo da dinâmica mitocondrial, porque um passo de fixação é exigird. Outros métodos, tais como a utilização de corantes para as mitocôndrias localizadas podem ser utilizados sem fixação e, por conseguinte, também pode ser usado no lugar de utilização de GFP localizada para as mitocôndrias. Como discutido na próxima seção, o uso de tais corantes também permite a avaliação in vivo bruto da função mitocondrial. Avaliando Membrana Mitocondrial Potencial In Vivo em C. elegans Uma variedade de corantes estão disponíveis para rotulagem mitocôndrias 28. Esses corantes proporcionam um método alternativo de visualização estrutura de rede mitocondrial em C. elegans vivos. Muitos destes corantes também permitir a avaliação em bruto de funcionalidade mitocondrial in vivo, porque eles se acumulam na mitocôndria com base no potencial de membrana mitocondrial. Aqui nós usamos C 32 H 32 Cl 2 N 2 O que é ingerido através deo tracto digestivo, com alguns adicionalmente entrar no sem-fim através da cutícula por causa da permeabilização proporcionada por ser dissolvido em 0,5% de DMSO. Após a entrada na célula C 32 H 32 Cl 2 N 2 O está oxidado e sequestrado pelas mitocôndrias, onde se liga aminoácidos contendo enxofre (por exemplo, metionina e cisteína). A formação destes complexos de corante-péptido significa C 32 H 32 Cl 2 N 2 O permanece nas mitocôndrias, uma vez marcados 28. Uma dificuldade fundamental com a utilização de corantes mitocondriais é que eles vão rotular todas as mitocôndrias no animal. Por isso temos realizado rotulagem em CB5600, da mesma estirpe acima descrita para avaliação do músculo estrutura de rede mitocondrial. Usando um corante vermelho mitocondrial, uma estirpe de vermes que expressam GFP em mitocôndrias do músculo, e um filtro de passagem de tripla, que é relativamente simples para a imagem apenas mitocôndrias no músculo, encontrando mitocôndrias que são Ogama de co-localização de corante vermelho e mitocôndrias GFP rotulados. O passo mais difícil na realização desta abordagem é co-localização de imagem porque o corante é em segundos sob luz fluorescente de alta intensidade-branqueada foto. Este efeito pode ser limitada, mantendo a fluorescência de baixa potência até que o experimentador está pronto para a imagem e, em seguida, ajustando a intensidade de fluorescência em conformidade. Uma vez que se tem experiência com o uso de corantes outra abordagem é utilizar microscopia confocal com Z-stacks a imagem apenas mitocôndrias no tecido direito; as redes mitocondriais no músculo são bastante distintos em comparação com outros tecidos. Infelizmente, a incapacidade de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O para deixar mitocôndrias 28 significa que, ao contrário das técnicas de sarcômero e imagiologia mitocondrial discutido acima, não pode ser usado para seguir prospectivamente perda da função mitocondrial com o tempo, a menos que C 32 H 32 Cl 2 N 2 Oé adicionado em pontos de tempo discretos para separar populações de animais. Esta limitação pode ser ultrapassada pela utilização de corantes, tais como JC-10 que faz sair a mitocôndria após colapso do potencial 43 de membrana. As mitocôndrias também pode ser isolado a partir de C. elegans 30 para análises bioquímicas subseqüentes. Tal extracção permite a quantificação do potencial de membrana mitocondrial por quantificação da taxa de absorção do corante catiónico lipofílico utilizando citometria de fluxo ou um leitor de placa fluorescente 44. Tendo estabelecido um potencial de membrana mitocondrial prejudicada, também é possível determinar se a perda de gradiente de protões traduz-se numa perda de produção de ATP, utilizando um método à base de luciferase bioluminometric 45 sensível. Avaliando a degradação de proteínas em C. elegans A cepa verme usada aqui para avaliar a degradação da proteína muscular foi PD55, que contém uma β específica muscular-galactosidase, que é continuamente ao longo do desenvolvimento sintetizados até à idade adulta é atingido e que permanece estável no citosol para o próximo 72-96 hr 19. Assim, a medição dos níveis de β-galactosidase durante o desenvolvimento predominantemente indica o impacto das intervenções sobre a síntese do promotor miosina enquanto que a perda de β-galactosidase durante a idade adulta indica uma intervenção provocou aumento da degradação da proteína citosólica 19. O passo chave na avaliação da actividade β-galactosidase é eficaz para assegurar a dessecação. Falha eficazmente para desidratar os animais resulta em mau disposição do substrato X-gal e, portanto, pobres cor azul nos músculos da parede do corpo dos animais. Para garantir uma boa dessecação o selo do secador deve ser verificado e, a amostra deve ser verificado em 10/05 minutos de intervalo durante todo dessecação para avaliar o progresso (ou seja, a amostra de 20 l deveria ter secado dentro de 10 minutos e os restantes 20 miné assegurar a dessecação abrangente). O ensaio de β-galactosidase é um ensaio de actividade, por conseguinte, um controlo apropriado é essencial. Além disso, a coloração diminuiu de adultos em uma condição de tratamento relativamente ao controlo não prova de que está a ocorrer a degradação; pelo contrário, indica diminuição da actividade enzimática em resposta ao tratamento. Para confirmar a degradação, mais western blot de trabalho intensivo deve ser concluída contra β-galactosidase 13 e isso permite a degradação de proteínas quantificação em pequenas populações de vermes contados. Densidades banda Western blot pode ser quantificado usando ImageJ 46. Uma outra limitação deste método é que o uso de proteínas transgénicas não informar como alvos para fisiológicas de degradação e para tais respostas hipótese impulsionado western blots proteomic e / ou orientadas devem ser empregues 13. Por último, como a síntese da proteína transgénica utilizada nestes estudos é desligado no início da idade adulta 19 </sup&gt;, outros métodos deve ser utilizado quando se deseja analisar alterações na síntese de proteínas do músculo totalmente desenvolvida em C. elegans muscular; por exemplo, métodos de isótopos estáveis ​​ou radioativos.

O músculo é um tecido multifuncional, bem apreciado por seu papel na locomoção, sustentação postural e metabolismo. O desenvolvimento ea manutenção do músculo saudável requer a coordenação de vários processos celulares e componentes. Ou através de dano ou doença, a desregulação pode ocorrer, o que resulta na estrutura muscular alterada e / ou função. Declínio associado à idade na função muscular apresenta um encargo significativo para os orçamentos de saúde no mundo ocidental, uma vez que a massa muscular de 1,2 e, particularmente, força e resistência muscular 3-5 são negativamente correlacionados com a mortalidade. A medição de aspectos relacionados com a deterioração da função muscular, tais como a função mitocondrial alterada ou sarcômero interrupção, pode permitir uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes desenvolvimento muscular global e saúde. Elegans C aenorhabditis (C. elegans) é uma microscópicas bes nematóidest conhecido, pois foi o primeiro organismo multicelular a ter todo o seu genoma sequenciado 6, a primeira a ter genes silenciados usando RNAi 7, eo único a ter suas metazoan toda linhagem celular 8 e 9 de neuroanatomia determinado. C. elegans foi proposto pela primeira vez como um modelo para o estudo do controle genético do comportamento em 1974 por Sydney Brenner 10 e da importância deste trabalho e posterior foi reconhecida com o primeiro dos três prêmios Nobel concedidos a C. elegans pesquisadores. Cerca de 35% dos genes de C. elegans identificaram ortólogos em seres humanos, com C. elegans ser um organismo chave usada para compreender o controle genético do desenvolvimento muscular 11. Quase todos os genes no genoma C. elegans pode ser derrubado por meio de RNAi 7,12. Assim, derrubando genes no músculo totalmente desenvolvido, componentes genéticos contribuindo para a regulamento da saúde muscular pode ser investigada com relativa simplicidade 13. A capacidade combinada de usar RNAi, mutantes, e compostos químicos torna C. elegans um sistema premier para explorar a regulação genética 7,14,15 da estrutura e função muscular com 16 anos de idade e em modelos de doenças 17. O impacto de knockdown do gene, mutação, e / ou exposição a compostos químicos sobre a estrutura e / ou função do músculo pode ser medido através de vários aspectos. Aqui, descrevemos brevemente técnicas simples para avaliar C. elegans estrutura e função do músculo, muitos dos quais podem ser utilizados em estudos prospectivos de saúde muscular. O desenvolvimento da proteína verde fluorescente (GFP) 18 permitiu a visualização de ambos a localização de proteínas específicas e a estrutura geral de organelos em C. elegans. Aqui explicamos como GFP expressa especicamente dentro do corpo da parede muscular mitocôndrias, núcleos, ou sarcómeros pode ser utilizado para determinar se a distrofia destas estruturas sub-celular está presente. Como a estrutura não é sempre um substituto confiável para a função, nós também explicar como o uso de corantes catiônicos in vivo permite a avaliação do potencial de membrana mitocondrial prejudicada dentro do músculo. Quando os corantes são usados ​​em combinação com GFP, eles permitem o estudo da estrutura e funcionamento de uma forma temporal, durante toda a vida. Por último, nós também explicar como homeostase proteínas dentro do músculo pode ser avaliado e como todas essas medidas pode ser usado para correlacionar as mudanças na saúde músculo animal inteiro através da utilização de ensaios de movimento. Estas técnicas, combinadas com knockdown gene, mutações, e / ou compostos químicos proporcionam um poderoso arsenal para o estudo de como os genes ou compostos específicos influenciar a saúde do músculo in vivo. Os paralelos na estrutura, metabolismo e função do músculo bruta entre C. elegans emamíferos significa C. elegans é um organismo modelo excelente para a compreensão da regulação do músculo em organismos superiores, incluindo os seres humanos.

<table><tbody><tr><td>MitoTracker Red CMXRos (C&lt;sub&gt;32&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;32&lt;/sub&gt;Cl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Invitrogen</td><td>M-7512</td><td>Red mitochondrial dye which accumulates based on a negative membrane potential</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>67-63-5</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>BDH</td><td>301584L</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M-7506</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy Slides</td><td>Starfrost</td><td>K220</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy Cover Slips</td><td>VW2 International</td><td>631-0124</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorph Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB74031</td><td></td></tr><tr><td>Dessicator</td><td>Nalgene</td><td>D2672</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Microscope</td><td>Nikon</td><td>H600L</td><td>Nikon H600L microscope with proprietary software</td></tr><tr><td>Nikon Camera</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi1</td><td>Nikon Digital Sight DS-Fi1 digital camera&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Ax10</td><td>Zeiss AX10 microscope with an Axiocam MRC digital camera and Axiovision LE software and a triple-pass filter</td></tr><tr><td>Plates 9 cm</td><td>Starstedt</td><td>82-1473</td><td></td></tr><tr><td>Plates 6 cm</td><td>Gosselin</td><td>BP53-01</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Ferrocyanide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14459-95-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7601-54-9</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl &amp;beta;-D-galactopyranoside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7240-90-6&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-dimethylformamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>68-12-2&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

methods to assess subcellular compartments of muscle in c. elegans

O músculo é um tecido dinâmico que responde a mudanças na alimentação, exercício e estado de doença. A perda de massa muscular e função com a doença ea idade são encargos significativos para a saúde pública. Atualmente, entender pouco sobre a regulação genética da saúde muscular com a doença ou idade. O nemátodo C. elegans é um modelo estabelecido para a compreensão da regulação genômica dos processos biológicos de interesse. Os músculos da parede do corpo deste verme apresentar um elevado grau de homologia com os músculos de espécies de metazoários mais elevados. Desde C. elegans é um organismo transparente, a localização de GFP para mitocôndrias e sarcómeros permite a visualização de estas estruturas in vivo. Similarmente, a alimentação de animais corantes catiónicos, que se acumulam com base na existência de um potencial de membrana mitocondrial, permite a avaliação da função mitocondrial in vivo. Estes métodos, bem como a avaliação de homeosta proteína muscularsis, são combinados com avaliação da função muscular animal inteiro, sob a forma de ensaios de movimento, para permitir a correlação de defeitos sub-celulares com medidas funcionais de desempenho muscular. Assim, C. elegans fornece uma plataforma poderosa para avaliar o impacto das mutações do gene, o knockdown, e / ou compostos químicos sobre a estrutura e função musculares. Por último, como a GFP, corantes catiónicos, e ensaios de circulação são avaliadas de forma não invasiva, estudos prospectivos da estrutura e função do músculo pode ser conduzida ao longo de todo o curso da vida e, actualmente, esta não pode ser facilmente investigada in vivo em qualquer outro organismo.

Movimento ensaios de quantificação Defeitos Movimento Declínio Movimento é um bom preditor de mortalidade em C. elegans 16, com a diminuição das taxas indicando problemas com o sistema neuromuscular. Alterações na circulação, tal como avaliado por ensaios de movimento, pode resultar de ARNi contra um gene específico ou tratamento da toxicodependência (Figuras 3-5) ou em animais mutantes 13, 23. Um declínio no movimento pode resultar de desenvolvimento alterado por exemplo, após batida de desenvolvimento para baixo de genes de transporte de elétrons que codificam complexo I, III, IV ou V 24. Adicionalmente, as intervenções específicas podem ser testados em adultos apenas C. elegans, a fim de investigar o efeito sobre a fisiologia pós-desenvolvimento. Por exemplo, os animais tratados com o ARNi contra unc-112, que codifica o ortólogo de C. elegans Kindlin-1, que está localizada a integrina contendocomplexos de fixação muscular (Figuras 3 e 4), ou gás-1, que codifica um componente do complexo I da cadeia de transporte de elétrons (Figura 4), ​​apresentar uma redução progressiva no movimento contra o controle 48-72 horas pós-vida adulta. Isto pode ser indicativo de problemas com a fisiologia muscular. De igual modo, uma perda de movimento 24-72 horas é observado em resposta ao tratamento de adultos normalmente desenvolvidos com o tratamento com o inibidor de PI3K LY-294002 (Figura 5). Também é possível testar o efeito de um segundo tratamento de RNAi, mutação, ou de uma droga no restabelecimento da circulação em animais que exibem uma redução do movimento em resposta a uma intervenção inicial. Por exemplo, unc- 112 mutantes exibem uma redução quantificáveis ​​em circulação em comparação com animais de tipo selvagem que é atenuado na presença de uma segunda mutação no dim-1 13. Assim, ensaios de movimento pode identificar ambas as intervenções que alteram neuromuscudesenvolvimento lar e / ou função, bem como aquelas que melhoram e / ou restaurar a função neuromuscular. Avaliação da Perturbação sarcômero Tendo identificado um defeito movimento, é muitas vezes desejável para determinar se a causa do defeito movimento pode ser explicado por problemas dentro de nervos, músculo, ou ambos. Sarcômeros são os complexos multi-protéicos dentro do músculo que permitem a contração e, assim, forçar a geração e movimento. Por animais que expressam proteínas de fusão utilizando miosina GFP localizadas ao aparelho contráctil, o grau de perturbação de filamentos de miosina e sarcómeros pode ser observado relativamente não invasiva e prospectivamente em animais individuais através do desenvolvimento e / ou a idade adulta. Do tipo selvagem animais exibir sarcômeros dispostos que aparecem como várias linhas verdes retas paralelas dentro de cada músculo-parede do corpo (Figura 3). A ruptura de estas matrizes normais pode ser relativamente menor comsarcômeros dispostos aparecem para mesclar ao invés de permanecer em paralelo. Este fenótipo, visível com unc-112 RNAi em t = 24 h ou 48 h (Figura 3), é comparável a Z-linha de transmissão de sítios de ligação à actina muscular em mamíferos. Do mesmo modo, as pequenas porções das matrizes podem entrar em colapso ou eles podem desaparecer completamente, tais como o tratamento com unc-112 RNAi em t = 48 h ou t = 72 h (Figura 3). A presença de defeitos sarcômero no interior do músculo de animais que exibem um defeito de circulação (Figura 3) é suficiente para explicar o defeito movimento, mas não necessariamente excluir outros problemas com o músculo, nervo, e / ou em outros tecidos em resposta a uma intervenção . Avaliação da Estrutura mitocondrial Rede Na presença de um defeito movimento é por vezes desejável para examinar músculo para outros defeitos que podem causar ou contribuir para o movimento defect. As mitocôndrias fornecer a maior parte da energia celular e declina em movimento pode ser o resultado da disposição de ATP reduzida, reduzindo a energia disponível para a contracção muscular. Assim, a estrutura da mitocôndria podem ser examinados para anormalidades. É importante que não se anestesiar os animais com azida de sódio, uma vez que induz a fragmentação rápida mitocondrial; animais nestas experiências foram imobilizados pela pressão aplicada pelo deslizamento da tampa. Dentro do tipo selvagem C. elegans muscular da parede do corpo, as mitocôndrias estão contidas dentro de redes organizadas (Figura 4) e existem mitocôndrias e funcionam como um retículo 25. O rompimento da rede de mitocôndrias apresenta como fragmentação da rede (gás-1 RNAi, Figura 4B) 26. A fragmentação pode tornar-se grave o suficiente para que nenhuma aparência de redes organizadas permanece como o tratamento com RNAi unc-112 (Figura 4B e C) 13. Como with rupturas na estrutura do sarcômero, defeitos no músculo estrutura mitocondrial em animais que apresentam um defeito movimento pode ser suficiente para dar conta do defeito movimento, mas isso não significa necessariamente descartar outros problemas com músculos, nervos, e / ou outros tecidos. Por exemplo, UNC-112 mutantes 13 e tratamento com UNC-112 RNAi (Figuras 3 e 4) exibição ambos os sarcômeros interrompidas e rompimento da estrutura mitocondrial. Avaliação da Função Mitocondrial In Vivo O potencial de membrana mitocondrial determina a capacidade das mitocôndrias para criar a força motriz de protões do ATP e 27 geram, por conseguinte, a capacidade de avaliar o potencial de membrana mitocondrial in vivo indica a capacidade desse animal para a produção de ATP. Como rupturas estruturais mitocondriais podem ou não alterar a capacidade funcional mitocondrial, pode ser desirable para avaliar a função mitocondrial em animais que apresentam a estrutura mitocondrial alterada. C 32 H 32 Cl 2 N 2 O acumula nas mitocôndrias, de todos os tipos de células, onde um potencial de membrana está presente e manchas da mitocôndria 28 (Figura 4C). Para avaliar especificamente a função mitocondrial no músculo, pode-se usar C 32 H 32 Cl 2 N 2 O e GFP marcado mitocôndrias musculares para demonstrar os efeitos de uma intervenção especificamente sobre mitocôndrias musculares (Figura 4C). Por exemplo, a perda de potencial de membrana mitocondrial de tratamento seguinte com unc-112 RNAi impede C 32 H 32 Cl 2 N 2 O entrem na matriz. As mitocôndrias, por conseguinte, apresentam pouca, se alguma coloração vermelha da mitocôndria para além da rotulagem de mitocôndrias GFP (Figura 4C). Foto-branqueamento também pode ser utilizada para confirmar que o observadomitocôndrias são aqueles especificamente no músculo (Figura 4C). Identificação de uma reduzida capacidade para produzir ATP é suficiente para dar conta de um defeito movimento observado, mas não descarta outros problemas dentro do músculo, nervo, e / ou outros tecidos. Independentemente disso, como a redução da capacidade de produção de ATP está associada com estados de doença em seres humanos 29 e 30 de envelhecimento, a identificação de um tal defeito na resposta a uma intervenção proporciona uma plataforma para o rastreio de compostos e / ou tratamentos de ARNi que melhoram a capacidade de produção de ATP e estes podem, em seguida ser mais explorado para potencial terapêutico. Avaliação da degradação de proteínas Na presença de um defeito de movimento e sarcómeros normais e mitocôndrias é por vezes desejável para examinar músculo para outros defeitos que podem causar ou contribuir para o defeito movimento. A capacidade de manter a homeostase de proteína é uma assinatura de nemmal de saúde, enquanto que uma redução na síntese de proteínas e / ou um aumento da degradação de proteínas é uma consequência do envelhecimento 31 e vários estados de doença 32,33. Portanto pode ser desejável para examinar os músculos de animais com um defeito de movimento para a homeostase proteína alterada. Isto pode ser realizado através de avaliação dos níveis de proteínas musculares citosólicas. A utilização de proteínas transgenicamente codificados permite a avaliação de Proteostase específica do músculo. Por exemplo, o uso de animais contendo β-galactosidase, fundida com uma porção N-terminal da miosina, que é sintetizado sob o controlo de um promotor da miosina e potenciador permite a avaliação do teor de proteínas do músculo citosólico 19. A presença de corante azul de tipo selvagem em adultos demonstra a presença de β-galactosidase activa e a ausência de degradação da proteína citosólica patológica. Uma perda de coloração em resposta ao tratamento sugere a degradação da proteína patológica está a ocorrer (Figura 5 </strong&gt;), Como β-galactosidase é estável durante 72-96 horas após a idade adulta em adultos de tipo selvagem 13,14,19. Por exemplo, animais de tipo selvagem não tratados exibir uma intensa mancha azul 72 h após a idade adulta, enquanto que LY-249002 animais tratados exibir uma ausência de mancha (Figura 5). Tal como acontece com defeitos na estrutura do sarcômero e função mitocondrial, a presença de degradação de proteína muscular patológico é suficiente para dar conta de um defeito movimento observado, mas não necessariamente descartar outros problemas com músculos, nervos, e / ou outros tecidos. <img alt="A Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3: (A) unc-112 RNAi provoca um defeito movimento significativo em t = 72 h (B) Avaliação da estrutura A-banda dispostas dentro do músculo da parede do corpo.. Em wt, A-bandas no músculo aparecem como linhas retas no início da vida adulta (t = 0 h) e permanecem em grande parte uniforme até além de 72 horas de vida adulta (ver zoom peso). unc-112 RNAi faz com que os sarcômeros perder arquitetura em pequenas áreas de músculo (t = 24 h), entrou em colapso e sarcômeros em falta (t = 48 h), a agregação (painel superior t = 72 horas e zoom) e perda de linearidade de sarcômeros (painel inferior t = 72 horas e zoom). Barras de escala representam 25 mM e zooms são 2.5X. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4: (A) unc-112 ou gás-1 RNAi provoca um defeito de circulação (B) Avaliação da estrutura mitocondrial dentro do músculo da parede do corpo.. As mitocôndrias no músculo aparecer linhas retas como em rede na idade adulta jovem (em peso). O tratamento dos animais com unc-112 resulta em RNAi mitochondrfragmentação ial como observado anteriormente entre 24 horas e 72 horas da vida adulta (zooms e flecha) 13. Da mesma forma, RNAi contra gás -1 resulta em fragmentação das redes mitocondriais como observado anteriormente 26. Estes estão presentes como pequenas lacunas na rede mitocondrial em t = 24 horas e progresso para a desorganização generalizada a 72 hr (ver zoom e flecha). (C) Avaliação do potencial de membrana mitocondrial in vivo. Em animais também contendo GFP localizada a mitocôndria, C 32 H 32 Cl 2 N 2 O acumula na mitocôndria do músculo da parede do corpo e aparece laranja sob um filtro de passagem de triplo da vida adulta (t = 0 horas) até 72 horas após a idade adulta. O tratamento com unc-112 RNAi provoca uma perda progressiva do potencial de membrana, conforme mostrado em 72 h onde as mitocôndrias restantes mostram menos acumulação de C 32 H 32 Cl 2 N 2 O em peso vs. Fotodegradação de 10 sec usando alvejantes 540/25 nm luz vermelha do MitoTracker e revela a GFP localizada mitocôndrias musculares (+ Foto lixívia). Barras de escala representam 25 mm e zooms são 2.5X. <img alt="A Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52043/52043fig5highres.jpg" width="600" /> Figura 5: (A) O tratamento com LY-294002 animais induz um defeito de movimento (B) Avaliação da degradação de proteínas utilizando um ensaio de β-galactosidase.. Idade sincronizado em peso larvas L1 são cultivadas para a idade adulta a 20 ° C (t = 0 h) antes de transferir para NGM semeada com OP50 (controlo de peso) ou NGM semeada com LY-294002 (tratamento com inibidor de PI3K) durante 24 horas a 20 ° C . Em A, cerca de 20-30 animais estão manchadas de atividade β-galactosidase (azul) em t = 0 horas e após 24 horas, 48 ​​horas e 72 horas.

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Métodos para avaliar os compartimentos subcelulares do músculo em C. elegans | Biologia | Vídeo

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

O músculo esquelético é essencial para a locomoção e é a principal loja de proteína dos corpos. Medidas de saúde musculares dentro de C. elegans são descritos. Mudanças potenciais na estrutura e função muscular são avaliados usando GFP localizada e corantes catiônicos.

Métodos para avaliar Subcelulares Compartimentos de músculo em<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

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16.5K visualizações.  University of Nottingham.  O músculo esquelético é essencial para a locomoção e é a principal loja de proteína dos corpos. Medidas de saúde musculares dentro de C. elegans são descritos. Mudanças potenciais na estrutura e função muscular são avaliados usando GFP localizada e corantes catiônicos. 

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In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Bioquímica

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the lumen and basolateral membranes contacting each other and/or the extracellular matrix. How this distinctive membrane asymmetry is established and maintained during organ morphogenesis is still an unresolved question of cell biology. This protocol describes the C. elegans intestine as a&#160;model for the analysis of polarized membrane biogenesis during tube morphogenesis, with emphasis on apical membrane and lumen biogenesis. The C. elegans twenty-cell single-layered intestinal epithelium is arranged into a simple bilaterally symmetrical tube, permitting analysis on a single-cell level. Membrane polarization occurs concomitantly with polarized cell division and migration during early embryogenesis, but de novo polarized membrane biogenesis continues throughout larval growth, when cells no longer proliferate and move. The latter setting allows one to separate subcellular changes that simultaneously mediate these different polarizing processes, difficult to distinguish in most polarity models. Apical-, basolateral membrane-, junctional-, cytoskeletal- and endomembrane components can be labeled and tracked throughout development by GFP fusion proteins, or assessed by in situ antibody staining. Together with the organism&#39;s genetic versatility, the C. elegans intestine thus provides a unique in vivo model for the visual, developmental, and molecular genetic analysis of polarized membrane and tube biogenesis. The specific methods (all standard) described here include how to: label intestinal subcellular components by antibody staining; analyze genes involved in polarized membrane biogenesis by loss-of-function studies adapted to the typically essential tubulogenesis genes; assess polarity defects during different developmental stages; interpret phenotypes by epifluorescence, differential interference contrast (DIC) and confocal microscopy; quantify visual defects. This protocol can be adapted to analyze any of the often highly conserved molecules involved in epithelial polarity, membrane biogenesis, tube and lumen morphogenesis.

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

The transparent C. elegans intestine can serve as an "in vivo tissue chamber" for studying apicobasal membrane and lumen biogenesis at the single-cell and subcellular level during multicellular tubulogenesis. This protocol describes how to combine standard labeling, loss-of-function genetic/RNAi and microscopic approaches to dissect these processes on a molecular level.

O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Biologia do Desenvolvimento

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

Comportamento

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Biologia

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo Avaliação da Dinâmica e Orientação em Caenorhabditis elegans Neurônios

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Neurociência

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein subcellular localization changes; in particular, a nuclear translocation under a heat stress condition. Proteins react correspondingly to external and internal signals. A common mechanism is to change its subcellular localization. This article describes a protocol to track protein localization that does not require an antibody, radioactive labeling, or a confocal microscope. In this article, GFP is used to tag the target protein EXL-1 in C. elegans, a member of the chloride intracellular channel proteins (CLICs) family, including mammalian CLIC4. An integrated translational exl-1::gfp transgenic line (with a promoter and a full gene sequence) was created by transformation and &#947;-radiation, and stably expresses the gene and gfp. Recent research showed that upon heat stress, not oxidative stress, EXL-1::GFP accumulates in the nucleus. Overlapping the GFP signal with both the nuclei structure and the DAPI signals confirms the EXL-1 subcellular localization changes under stress. This protocol presents two different fixation methods for DAPI staining: ethanol fixation and acetone fixation. The DAPI staining protocol presented in this article is fast and efficient and preserves both the GFP signal and the protein subcellular localization changes. This method only requires a fluorescence microscope with Nomarski, a FITC filter, and a DAPI filter. It is suitable for a small laboratory setting, undergraduate student research, high school student research, and biotechnology classrooms.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

This protocol demonstrates how to track a protein nuclear translocation under heat stress by using a green fluorescence protein (GFP) fusion protein as a marker and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. The DAPI staining protocol is fast and preserves the GFP and protein subcellular localization signals.

Detectar a localização Subcellular da proteína por marcação de proteína de fluorescência verde e 4' 6-Diamidino-2-phenylindole de coloração em Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these mechanisms is to introduce mutations in candidate genes and qualitatively describe changes in the morphology of tissues and cellular organelles. However, qualitative descriptions may not capture subtle phenotypic differences, might misrepresent phenotypic variations across individuals in a population, and are frequently assessed subjectively. Here, quantitative approaches are described to study the morphology of tissues and organelles in the nematode Caenorhabditis elegans using laser scanning confocal microscopy combined with commercially available bio-image processing software. A quantitative analysis of phenotypes affecting synapse integrity (size and integrated fluorescence levels), muscle development (muscle cell size and myosin filament length), and mitochondrial morphology (circularity and size) was performed to understand the effects of genetic mutations on these cellular structures. These quantitative approaches are not limited to the applications described here, as they could readily be used to quantitatively assess the morphology of other tissues and organelles in the nematode, as well as in other model organisms.

Quantitative Approaches for Studying Cellular Structures and Organelle Morphology in Caenorhabditis elegans

This study outlines quantitative measurements of synaptic size and localization, muscle morphology, and mitochondrial shape in C. elegans using freely available image processing tools. This approach allows future studies in&#160;C. elegans&#160;to quantitatively compare the extent of tissue and organelle structural changes as a result of genetic mutations.

Abordagens quantitativas para o estudo de estruturas celulares e morfologia organelle em Caenorhabditis elegans

Defining the cellular mechanisms underlying disease is essential for the development of novel therapeutics. A strategy frequently used to unravel these ...

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, aging, immunity, and environmental response. Critical interactions between the C. elegans host and its environment converge within the intestine, where gut microbiota concentrate. Therefore, the ability to isolate intestine tissue away from the rest of the worm is necessary to assess intestine-specific processes. This protocol describes a method for hand dissecting adult C. elegans intestines. The procedure can be performed in fluorescently labeled strains for ease or training purposes. Once the technique is perfected, intestines can be collected from unlabeled worms of any genotype. This microdissection approach allows for the simultaneous capture of host intestinal tissue and gut microbiota, a benefit to many microbiome studies. As such, downstream applications for the intestinal preparations generated by this protocol can include but are not limited to RNA isolation from intestinal cells and DNA isolation from captured microbiota. Overall, hand dissection of C. elegans intestines affords a simple and robust method to investigate critical aspects of intestine biology.

Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines

The present protocol describes a procedure for isolating intestines from adult Caenorhabditis elegans nematode worms by hand for input in genomics, proteomics, microbiome, or other assays.

Dissecção da Mão de Caenorhabditis elegans Intestinos

Comprised of only 20 cells, the Caenorhabditis elegans intestine&#160;is the nexus of many life-supporting functions, including digestion, metabolism, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Analisando a morfologia mitocondrial em C. elegans

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans During Aging

Mitochondria, important cellular organelles found in most eukaryotic cells, are major sites of energy production through aerobic respiration. Beyond this well-known role as the 'cellular powerhouse,' mitochondria are also involved in many other essential cellular processes, including the regulation of cellular metabolism, proliferation, immune signaling, and hormonal signaling. Deterioration in mitochondrial function during aging or under mitochondrial stress is often characterized by distinct changes in mitochondrial morphology and volume. The nematode C. elegans is an ideal model for studying these changes due to its transparent body and short lifespan, which facilitate live microscopy throughout its lifetime. However, even within the C. elegans field, numerous transgenic constructs and methods for mitochondrial imaging are available, each with its own limitations. Here, single-copy, matrix-localized GFP constructs are presented as a robust and reliable method for imaging mitochondrial morphology in C. elegans. This study specifically focuses on experimentally controllable factors to minimize errors and reduce variability between replicates and across studies when performing mitochondrial imaging during the aging process. Additionally, mitoMAPR is recommended as a robust method to quantify changes in mitochondrial morphology across tissue types during aging.

<meta charset="utf8"></head><body>Imagem e Quantificação da Morfologia Mitocondrial em C. elegans Durante o Envelhecimento

This protocol provides a standardized approach for imaging mitochondrial morphology in multiple tissues of C. elegans during aging.

Imagem e Quantificação da Morfologia Mitocondrial em C. elegans Durante o Envelhecimento

Mitochondria, important cellular organelles found in most eukaryotic cells, are major sites of energy production through aerobic respiration. Beyond this ...

Métodos para avaliar Subcelulares Compartimentos de músculo em

Resumo

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In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

In vivo Avaliação da Dinâmica e Orientação em Caenorhabditis elegans Neurônios

Imagem Subcelular da Manipulação Neuronal de Cálcio In Vivo

Detectar a localização Subcellular da proteína por marcação de proteína de fluorescência verde e 4' 6-Diamidino-2-phenylindole de coloração em Caenorhabditis elegans

Abordagens quantitativas para o estudo de estruturas celulares e morfologia organelle em Caenorhabditis elegans

Dissecção da Mão de Caenorhabditis elegans Intestinos

Imagem e Quantificação da Morfologia Mitocondrial em C. elegans Durante o Envelhecimento