Esta técnica pode ser usada para avançar nossa compreensão da manipulação de cálcio em neurônios, e como o cálcio compartimentalizado pode regular diferentes mecanismos importantes para a função neuronal in vivo. A principal vantagem desta técnica é que ela permite imagens in vivo rápidas de maior resolução em condições fisiológicas em C.elegans que podem ser combinadas com outras ferramentas fluorescentes. Esta técnica poderia fornecer informações sobre o mecanismo de regulação da sinalização de cálcio em neurônios em muitos contextos diferentes.
Por exemplo, durante o envelhecimento, lesão neuronal e neurodegeneração. Quem demonstrará esse procedimento será Ennis Deihl, técnico de pesquisa. Kaz Knight, doutorando, e Rachel Doser, pesquisadora de pós-doutorado do meu laboratório.
Comece clonando vetores de expressão que contêm um promotor seguido por um indicador de cálcio e três UTR principais de escolha. Criar cepas transgênicas de C.elegans por microinjeção de uma mistura de DNA contendo o DNA de resgate Lin-15 plus no transgene indicador de cálcio na gônada de um dia de idade adulta C.elegans. Manter os vermes pais injetados a 20 graus Celsius até que a progênie F1 atinja a idade adulta.
Selecionar adultos transgênicos por meio da triagem para a ausência do fenótipo multivulva. Isso indica a expressão do arranjo cromossômico extra que contém o indicador de cálcio. Clonalmente passam progênie F1 adulta que não possui o fenótipo multivulva.
Realizar experimentos em gerações subsequentes das cepas transgênicas com uma expressão ótima do indicador de cálcio. Use um microscópio capaz de imagens de lapso de tempo de longo prazo. Localize o verme sob uma objetiva de baixa ampliação e, em seguida, mude para uma objetiva de alta ampliação para localizar os neurônios.
Adquira as imagens usando uma câmera ultrassensível capaz de aquisição rápida de imagens a mais de 50 FPS. Em seguida, use um filtro de emissão padrão para o indicador de cálcio. Adicione um corretor Z-drift para a aquisição de fluxos de imagem com mais de 10 segundos.
Em um tubo de cultura de vidro de 13 por 100 milímetros, prepare três mililitros de ágar 10% dissolvendo ágar de grau molecular em M9 e micro-ondas por vários segundos. Para fazer as almofadas de ágar, primeiro, prepare duas lâminas adicionando duas camadas de fita de laboratório. Em seguida, coloque uma lâmina de microscópio entre as duas lâminas.
Corte a ponta de uma pipeta de 1000 microlitros e use-a para pipetar uma pequena gota de ágar no centro da tampa. Achate o ágar pressionando outro slide para baixo em cima do ágar. Após o resfriamento, corte o ágar em um pequeno disco usando a abertura de um tubo de 10 mililitros e, em seguida, remova o ágar circundante.
Em seguida, prepare a solução de laminação de vermes dissolvendo o pó de muscimol em M9 para criar um estoque de 30 milimolares. Diluir o estoque em uma proporção de um para um com esferas de poliestireno para fazer a solução de laminação. Para posicionar o verme para obtenção de imagens, primeiro, coloque 1,6 microlitros da solução rolante no centro da almofada de ágar.
Em seguida, usando uma picareta de minhoca preferida, transfira um verme da idade desejada para a solução de rolamento na almofada de ágar. Aguarde cerca de cinco minutos para que o muscimol reduza o movimento do verme e, em seguida, solte uma tampa de 22 por 22 milímetros em cima da almofada de ágar. Para obter imagens de neuritos no cordão nervoso ventral, enrole o verme deslizando levemente a tampa.
Para montar o verme no microscópio, coloque uma gota de óleo de imersão sobre a tampa. Encontre o worm usando uma objetiva de baixa ampliação no campo brilhante. Em seguida, mude para a objetiva de 100x e localize o neurito AVA usando a iluminação do GCaMP ou mito GCaMP com o laser de imagem de 488 nanômetros.
Para imagens GCaMP in vivo, ajuste o laser de imagem nas configurações de aquisição até que a fluorescência GCaMP do manjericão esteja na faixa média da faixa dinâmica da câmera e defina o tempo de exposição para 20 milissegundos. Depois que o neurito AVA for localizado usando a fluorescência GCaMP em 100 vezes a ampliação, defina o corretor Z-drift e inicie o foco automático contínuo. Corrija manualmente o plano focal conforme necessário antes da geração de imagens.
Adquira um fluxo de imagens com 100 vezes de ampliação. Usando este protocolo, o cálcio citoplasmático foi medido com alta resolução temporal e espacial. A expressão celular específica de GCaMP6F nos interneurônios de comando glutamatérgico AVA revelou uma propagação direcional do influxo de cálcio.
A quantificação subcelular da fluorescência GCaMP6F mostrou que o início do influxo de cálcio foi retardado em uma porção do neurito localizada a apenas 10 micrômetros de distância. Além disso, estruturas dendríticas semelhantes à coluna vertebral encontradas ao longo do neurito AVA mostraram flashes na fluorescência GCaMP6F que ocorreram independentemente da ativação do neurito e não levaram à propagação do influxo de cálcio. Além disso, os níveis relativos de cálcio foram medidos nas mitocôndrias individuais em neuritos únicos usando uma cepa de verme com uma expressão específica de AVA do indicador de cálcio localizado da matriz mitocondrial mito GCaMP.
Os resultados mostraram a captação sincrônica de uma quantidade relativamente grande de cálcio em um subgrupo de mitocôndrias. Especificamente, a captação de cálcio em algumas mitocôndrias foi sincronizada, enquanto as mitocôndrias vizinhas não pareceram absorver cálcio. Da mesma forma, subgrupos de mitocôndrias mostraram rápida captação e liberação de pequenas quantidades de cálcio.
Isso também parecia ser sincrônico, mas apenas para um subconjunto de mitocôndrias. A velocidade e as manipulações finas são essenciais para posicionar os animais e manter a função neuronal. A saúde animal também é primordial.
Mesmo um pouco de fome é problemático. A parte mais difícil de aprender é a rápida orientação dos animais para microscopia confocal sem danos. Meu conselho é muita prática e bons controles.
Este protocolo poderia ser aplicado a experimentos onde o cálcio é liberado de outros locais subcelulares em neurônios, outros neurônios ou células que não sejam neurônios em C.elegans. Como esta abordagem em C.elegans deixa os animais intactos, é possível abordar questões sobre a regulação da manipulação subcelular de cálcio in vivo em neurônios únicos de um sistema nervoso completo.
