Name: using fluorescent proteins to monitor glycosome dynamics in the african trypanosome
Uploaded: 2014-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome at JoVE.com

This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.

1.-Geral Trypanosoma Pecuária <ol><li> Pesar sólidos para a preparação dos meios SDM79 (Tabela 1). </li><li> Armazenar a 4 ° C em 50 mL cónico ou um saco plástico. NOTA: Os reagentes são estáveis ​​durante pelo menos 6 meses. </li><li> Descongelar soro fetal bovino (FBS) em um banho de água a 37 ° C, e misturar periodicamente por inversão. NOTA: FBS é recebida do fornecedor, como uma solução estéril. Filtro de esterilização FBS reduz a sua capacidade para suportar o crescimento do parasita. </li><li> Uma vez que toda a garrafa é descongelada, calor inactivar soro durante 30 minutos num banho de água a 56 ° C, a mistura periodicamente para minimizar a precipitação de componentes do soro. </li><li> Descongelar a penicilina / estreptomicina (pen / strep), hemina (2 mg / ml em NaOH a 50 mM), e solução basal águia vitamina meio à temperatura ambiente. </li><li> Para uma proveta graduada de 1000 ml, adicionar 20,2 g de sólidos SDM79 (Tabela 1) para os componentes líquidos (Tabela 2) e misture bem com uma placa de agitação. </li><li> Ajustar o pH a 7,35, e perfazer o volume de 850 ml com água. </li><li> Filtrar esterilizar mídia ligando uma mangueira de vácuo para o fundo de uma garrafa de filtro. Aplicar vácuo até que a solução é filtrada. </li><li> Remover top filtro no gabinete de biossegurança e adicione 150 ml de inactivado pelo calor FBS. Remover cobertura plástica de tampa estéril e garrafa mídia selo. </li><li> Prepare mídia SDM80 da mesma maneira como SDM79 com as seguintes excepções; não adicione açúcar ou glucosamina e usar MEM sem glutamina. Em lugar de 150 ml de FBS inactivado pelo calor, adicionar 135 ml de dialisado, FBS inactivado pelo calor, e 15 mL de FBS inactivado pelo calor. </li><li> Cultura parasitas PCF em cada 25 cm2 frasco com 10 ml de meio apropriado a 27 ° C e 5% de CO 2. NOTA: As células devem ser contadas diariamente utilizando um hemocitômetro ou um citômetro de fluxo (ver secção 6) e culturas devem ser mantidas em densidades entre 1 x 10 5 e 5 x 10 6 células / ml. </li></ol> 2 Transfection de PCF Parasitas com a construção repórter fluorescente NOTA: Para seguir glicossomo dinâmica, uma proteína repórter, contendo a sequência de direccionamento de peroxissomas (PTS2) de aldolase fundido reforçado a proteína fluorescente amarela é expresso nos parasitas. A sequência que codifica a proteína de fusão foi clonado no pXS2bla 12, que contém o promotor procyclin e as regiões intergénicas de tubulina, que a recombinação homóloga no genoma directa e o gene de resistência à blasticidina para selecção. Linhas celulares de pró-cíclicos, contendo os genes que codificam a polimerase de T7 e tetraciclina repressor (PF29-13) são transformadas com a construção de direccionamento, pXS2: PTS2eYFP. <ol><li> Prepare cytomix misturando os componentes listados na Tabela 3. Filtre esterilizar e armazenar a RT. </li><li> DNA de plasmídeo linearizado com Mlu I, pipetando 10 mL de ADN (1 mg / mL), tampão de enzima de restrição de 5 ul, 33 ul de água, e 2 μ; L de enzima Mlu I para um tubo de microcentrífuga. Incubar a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Purifica-se a digestão de restrição por adição de um volume de tampão de ligação com a enzima de restrição digest. Misturar tampão de ligação e DNA digerido com vórtex. Resumidamente, centrifugar para recolher a amostra no fundo do tubo. </li><li> Inserir uma coluna de ADN de ligação para um tubo de recolha de 2 ml, e a transferência de ADN digerido / ligante solução tampão à coluna. </li><li> Centrifugar por 10.000 xg por 1 min. Após a centrifugação, descartar filtrado do tubo de coleta e retornar a coluna para o tubo de coleta. </li><li> Adicionar 700 ul de tampão de lavagem SPW e centrifugar a 10000 xg durante 1 min. </li><li> Filtrado Descarte de tubo de coleta, retornar a coluna de tubo de coleta e repetir SPW etapa de lavagem e centrifugação. </li><li> Descartar filtrado, coluna de retorno ao tubo de recolha, e centrifugar coluna vazio durante 3 minutos a 10000 xg para remover o etanol residual. </li><li> Em uma cabine de segurança biológica, jogue fora collection tubo e lugar da coluna em um tubo de microcentrífuga estéril. </li><li> Para eluir o ADN, adicionar 25 ul de água estéril para coluna e incuba-se à temperatura ambiente durante 2 min. Centrifuga-se a 10000 xg durante 1 min. </li><li> Adicionar mais 25 ul de água estéril na capa de biossegurança coluna e incuba-se à temperatura ambiente durante 2 min. </li><li> Centrifugar a 10.000 velocidade xg por 1 min. </li><li> Numa câmara de biossegurança transferir todo o volume de ADN para um novo tubo de microcentrifuga estéril. Nota: Esta etapa evita a contaminação da tampa aberta durante a centrifugação. </li><li> Adicionar o ADN purificada estéril,, linearizado (10 ng) a 400 ul de cytomix esterilizada por filtração. </li><li> Contagem de células, como descrito na seção 6 e colher 5 x10 7 a 10 8 células por centrifugação a 800 xg por 15 minutos em temperatura ambiente. </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 450 ul de ADN + cytomix usando uma pipeta de 1 ml serológico. </li><li> Solução de transferência contendo ce<html> lls, ADN, e cytomix para uma cuvete estéril 4 milímetros lacuna e lugar da cuvete na câmara de electroporação. </li><li> Selecione &quot;decaimento exponencial&quot; e digitar manualmente as seguintes configurações: Tensão: 1,5 kV, capacitância: 25 mF, Resistance: Ω, e Cuvette: 4 mm. Pressione pulso. Uma vez que o impulso está completa, remover cuvete da câmara de electroporação e retornar para o armário de biossegurança. </li><li> Para um novo frasco estéril, pipeta 10 ml de SDM79. Transferência das células transformadas para o balão com 10 ml de SDM79. </li><li> Incubar SEM selecção de drogas durante 24 horas a 27 ° C, 5% de CO 2. Após 24 horas, adicionar G418 (15 mg / mL), higromicina (50 ug / ml), e blasticidina (10 ug / ml). Passar 1 ml de células transformadas com droga em 9 ml de SDM79 com droga. </li><li> Analise as células diariamente conforme descrito nas seções 6 e 7 Quando as células são fluorescentes, e chegaram a uma densidade celular de 1 x 10 7 / ml, fazer stabilates para armazenamento de longo prazo (3,1-3,3). </li></ol>ve_title &quot;&gt; 3. Fazer Stabilates <ol><li> Para fazer com que meios de congelação, adicionar um volume igual de glicerol a 100% e para cytomix filtro de esterilização. </li><li> Adicionar 200 ul de meio de congelação a 800 ul de células (1 x 10 7) em um frasco de congelação, misturar suavemente por inversão e lugar entre duas prateleiras de esferovite e congelar a -80 ° C. </li><li> Uma vez congelado (~ 24 horas), as células de transferência para nitrogênio líquido. NOTA: É importante mover em células LN 2, após 24 h, como um armazenamento mais longo à temperatura de -80 ° C, leva a uma diminuição da viabilidade celular. </li></ol> 4. Stocks descongelamento congelados <ol><li> Remover o frasco congelado de -80 ° C e descongelamento à temperatura ambiente durante cerca de 10 min. </li><li> Pipetar 9 ml de SDM79 com droga para um novo frasco estéril. Adicionar células descongeladas para este balão. Passa células 1:10, adicionando 1 ml desta cultura a 9 ml de SDM79 em um novo frasco (concentração final de 1 x 10 5 / ml). </li><li> Antes de as células atingirem uma densidade de 10 7 / ml, começam citómetro definire ensaios de diluição. </li></ol> 5. Setup Cytometer <ol><li> Ligue o citômetro de fluxo e abrir o programa cflow Plus. NOTA: Antes de executar quaisquer amostras, os fluidos devem ser backflushed e enxaguado acordo com os passos 5,2-5,7. </li><li> Substitua o tubo de água nanopura em que o gole é armazenado com um tubo vazio. </li><li> Selecione o botão &quot;fluxo reverso&quot;. </li><li> Depois de retrolavagem é completa, remova o tubo de microcentrífuga de gole e descarte. </li><li> Colocar um novo tubo de microcentrifuga contendo 1 ml de água nova nanopura na sorvo. </li><li> Selecione um novo poço no programa cflow. Em &quot;Limites Run&quot; definir o tempo de 2 min. Em &quot;Fluidics&quot;, selecione &quot;rápido&quot; e &quot;Run&quot;. </li><li> Uma vez que o limite de tempo de 2 min é completa, clique no botão &quot;Apagar dados de exemplo&quot;. </li></ol> 6. contagem celular usando citômetro de fluxo <ol><li> Substituir a água com a amostra a ser contadas. Defina &quot;Limites Executar &quot;para 30 segundos,&quot; Fluidics &quot;para&quot; rápida &quot;e selecione&quot; Executar &quot;. </li><li> Após o prazo de 30 seg é completa, cflow mais irá fornecer os eventos / l em &quot;Last Run&quot;. Contagem Repita para cada cultura. NOTA: Antes de células chegar a 1 x 10 7 células / ml, prossiga com ensaio de diluição. As células devem ser interrompido após um ensaio de diluição for concluída. Células cultivadas por períodos mais longos perdem a capacidade de responder às condições ambientais. </li></ol> 7 Fluorescência de medição usando citômetro de fluxo <ol><li> Para avaliar a fluorescência, definir &quot;limites Run&quot; para 10 mil eventos e &quot;Fluidos&quot; para &quot;lento&quot;. Selecione &quot;Definir limite&quot;. Em &quot;Threshold Primária&quot;, selecione &quot;permanentemente eliminar eventos do&quot;, &quot;FSC-H&quot; (na caixa drop-down) e entre menos de 30.000. Clique em &quot;Aplicar&quot; e depois em &quot;fechar&quot;. </li><li> Selecione o220; &quot;botão em uma das novas janelas de plotagem e selecione&quot; Histograma FSC-A &quot;A partir da lista drop-down, selecione&quot; FL1-A &quot;. NOTA: medidas FL1-A fluorescência no comprimento de onda de 530 nm. </li><li> Selecione &quot;Run&quot; e repita para todas as culturas. </li><li> Executar a solução de limpeza através da linha de fluidos durante 2 min e água durante 2 min. </li></ol> 8. Diluição Ensaios <ol><li> Passar as células a uma densidade de 1 x 10 5 células / ml em 3 ml de SDM79 num balão de cultura de 2 25 cm e medir a fluorescência imediatamente após a passagem e, em seguida, em 3 horas e 24 horas. </li></ol> Análise dos dados do 9 <ol><li> Selecione &quot;Analisar&quot; guia sobre cflow Plus. </li><li> Clique no botão &quot;Histograma&quot; em &quot;Fazer uma nova trama.&quot; Selecionar &quot;FSC-A&quot; e uma lista drop-down aparecerá. Selecione o canal &quot;FL1-A.&quot; </li><li> Realce um bem para analisar. Selecione o botão &quot;Gate&quot;, e desenhar manualmente uma portapara a população de interesse. </li><li> Fluxo Plus fornecerá celular &quot;Contagem&quot; dentro desse portão e &quot;% dessa trama&quot;. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Glicossomos são, dinâmico, organelas essenciais específicos do parasita. Os processos que regulam a biogênese, manutenção, proliferação e remodelação dessas organelas provavelmente incluem alvos de medicamentos que poderiam ser exploradas para fins terapêuticos. Apesar do elevado potencial de abundância de tais alvos de drogas, o campo de glicossomo biogênese ficou para trás o estudo de processos similares em outros organismos, predominantemente, devido à falta de um sistema tratável, de alto rendimento para o acompanhamento rápidas dinâmicas, respostas, organelas em células vivas. Sistemas repórter fluorescentes organelo têm sido utilizados para estudar a dinâmica de organelos nos eucariotas superiores, tais como leveduras, fungos, plantas e mamíferos 23-25. Geramos uma cepa transgênica de parasitas PCF que expressam PTS2eYFP que é direcionado para amadurecer glicossomos, produzindo organelas fluorescentes. Alterações na composição glicossomo pode ser monitorizado através de seguinte fluorescência celular. Usando este sistema, temos verificado que as condições ambientais, nomeadamente glicose, regular glicossomo composição 12. Em contraste com os métodos de microscopia frequentemente usados ​​para estudar a dinâmica de organelas em parasitas kinetoplastides, este sistema repórter oferece um método pelo qual a tela rapidamente compostos e condições que influenciam a dinâmica global glicossomo. No entanto, as mudanças na fluorescência refletir mudanças nas composições globais de organelas. Outros experimentos bioquímicos e microscópicos são necessários para definir as diferenças moleculares específicas entre populações de células que apresentam diferentes intensidades de fluorescência. Nós identificamos uma série de etapas críticas nos ensaios de remodelação. Curiosamente, verificou-se que quando as células são cultivadas por períodos mais longos (mais de duas passagens), o seu comportamento em resposta a alterações ambientais é imprevisível. Após a cultura prolongada, as células passaram de alta densidade em fresco mEDIA, exibem um aumento temporário da população fraca, o que indica que eles ainda são capazes de remodelar glicossomos, mas morre após 24 horas. Também encontramos situações em que nenhum remodelação e observado. A razão para este comportamento é completamente conhecida, mas verificou-se que quando as células são tratadas como descrito aqui (que limita o número de transferências para duas culturas e manter abaixo de 1 x 10 7 / ml), glicossomo remodelação é reprodutível. Quando as células não são mais sensíveis às condições ambientais, retransforming células com o plasmídeo repórter-constructo normalmente remédios esta situação. Embora este sistema foi usado para estudar o comportamento em glicossomo tripanossomas africanos, ele também pode ser adoptada para o estudo de organelos em outros parasitas através da fusão de proteínas fluorescentes a sequências de aminoácidos que a proteína directa localização para outros compartimentos celulares.

Trypanosoma brucei causa a doença do sono Africano em seres humanos e uma doença debilitante, nagana, em bovinos. As drogas utilizadas no tratamento das referidas doenças são antiquado e extremamente tóxico, as vacinas não estão disponíveis, e o potencial para o desenvolvimento de resistência às drogas necessita da busca de novos alvos de medicamentos 1. Durante seu ciclo de vida, T. brucei, alterna entre um inseto vetor e hospedeiro mamífero; dois hosts que se apresentam muito diferentes ambientes em que o parasita deve sobreviver. Uma série de alterações metabólicas e morfológicas ocorrer como o parasita está exposta a diferentes condições ambientais. Algumas das mudanças mais dramáticas são observadas em microcorpos específicas do parasita único delimitado por membrana, denominado glicossomos 13. Os níveis de glicose são relativamente elevados (~ 5 mm) na corrente sanguínea e parasitas na corrente sanguínea (BSF) gerar ATP exclusivamente através wh glicólisemetabolismo mitocondrial ile é reprimida 14. Ao contrário de outros eucariotas, em que a glicólise ocorre no citoplasma, T. brucei compartimenta a maioria das enzimas glicolíticas em glicossomos 14,15. Os parasitas são absorvidos pela mosca tsé-tsé durante a farinha de sangue e experimentar uma queda em glicose, que cai para níveis indetectáveis ​​dentro de 15 min de ser ingerido pela mosca. O metabolismo de inseto, forma procíclicos (PCF), parasitas é mais flexível e glicose, bem como aminoácidos, tais como prolina, pode ser usado na síntese de ATP 16-18. Estudos proteômicos comparativos revelam mudanças de ciclo de vida dependentes em glicosomal e proteínas mitocondriais com proteínas glicolíticas aumentou em parasitas na corrente sanguínea e proteínas mitocondriais envolvidos no ciclo TCA e cadeia respiratória 13,19. Enquanto muitos estudos têm-se centrado sobre as diferenças entre BSF e glicossomos PCF, pouco se sabe sobre as mudanças no glicossomos PCF que ocorrem em resposta aos envmudanças ironmental. No intestino posterior da mosca, os níveis de glicose estão baixos com aumentos transitórios durante uma alimentação 20. Na maioria dos estudos in vitro, parasitas PCF são cultivadas em meios contendo glicose. No entanto, estudos recentes têm demonstrado que mudanças no metabolismo PCF significativamente em resposta à glicose disponibilidade 17. Na ausência da glucose, a absorção de prolina e prolina aumento da actividade de desidrogenase 18. Esta mudança no metabolismo mitocondrial é provavelmente acompanhada por uma alteração na morfologia e composição glicossomo, no entanto, isto não foi avaliado directamente. Electron e microscopia de fluorescência são técnicas comuns usadas para estudar a dinâmica glicossomo em T. brucei 2,21-24. Estes protocolos são o tempo e trabalho intensivo, caro e difícil de adaptar-se a estudos em tempo real e os protocolos de alto rendimento. Para superar esta limitação, um sistema repórter fluorescente organelo-used para estudar organelos em sistemas de mamífero e de levedura foi modificada para utilização em T. brucei 12. Sistemas repórter fluorescente-organelas têm sido amplamente utilizados em eucariotos superiores, tais como fungos, plantas e células de mamíferos 25-27. Em tais sistemas, uma proteína fluorescente é fundido com uma sequência de aminoácidos que tem como alvo a proteína de organelos específicos. A degradação ou a síntese das proteínas-alvo é medida por meio de fluorescência e as mudanças na composição do organelo são reflectidas pelas alterações na fluorescência celular. Quando a grelha de leitura aberta de maior proteína fluorescente amarela (EYFP) é fundido a uma sequência de direccionamento peroxissomal tipo II (PTS2) 12, a proteína é importado para PTS2eYFP, glicossomos maduros importação-competente e fluorescência podem ser monitorizadas por meio de citometria de fluxo. As variações na composição glicossomo são refletidas por mudanças na fluorescência celular. Este sistema pode auxiliar no resolVing os mecanismos que regulam as mudanças induzidas pelo ambiente em glicossomo composição. Este manuscrito descreve a geração de um sistema repórter em glicossomo PCF parasitas em conjunção com citometria de fluxo para controlar a dinâmica glicossomo em tempo real em parasitas vivos e fornece um exemplo de como ele foi usado para seguir alterações na composição glicossomo em resposta a diferentes ambientes. Em resumo, glicossomo composição é influenciada pela concentração de glucose extracelular e a passagem de culturas em fase logarítmica em meio fresco provoca mudanças na composição glicossomo. Este sistema pode ser modificado para estudar o comportamento dinâmico de outros organelos nos tripanossomas e outros parasitas.

<table><tbody><tr><td>Adenosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A10781</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A15804</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>CalBiochem</td><td>1820</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>p-Aminobenzoic acid</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102569</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100x)</td><td>Sigma</td><td>B6891</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Biotin</td><td>Fisher</td><td>BP232-1</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>VWR</td><td>BDH0224</td><td>Cytomix</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>EZNA Gel Extraction kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D2500-01</td><td>DNA purifiation</td></tr><tr><td>Research grade Serum</td><td>Fisher</td><td>03-600-511</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Folic acid</td><td>ICN Biomedicals</td><td>101725</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Glucosamine HCl</td><td>ICN Biomedicals</td><td>194671</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>GIBCO</td><td>15023-021</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>CalBiochem</td><td>3520</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Acros Organics</td><td>Ac15892-0010</td><td>Freezing media</td></tr><tr><td>Graces insect cell media powder</td><td>GIBCO</td><td>11300-043</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Guanosine</td><td>Avocado Research Chemicals Ltd</td><td>A11328</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>MP Biomedicals</td><td>194025</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Fisher</td><td>BP388-100</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>MEM Amino Acids (50x)</td><td>Cellgro</td><td>25-030-CI</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>NEAA Mixture (100x)</td><td>Lonza</td><td>13-114E</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (1x) with L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>10-010-CM</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Sodium biocarbonate</td><td>Fisher</td><td>S233-500</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin Solution</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>ICN Biomedicals</td><td>102623</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic anhydrous</td><td>Fisheer</td><td>P290-212</td><td>Cytomix ingredient</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Fisher</td><td>BP392-100</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Acros Organics</td><td>56-45-1</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>Pyruvic acid, sodium salt</td><td>Acros Organics</td><td>113-24-6</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Taurine</td><td>TCI America</td><td>A0295</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Acros Organics</td><td>72-19-5</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>ICN Biomedicals</td><td>103183</td><td>SDM79 Ingredient</td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Cycle Pure kit</td><td>Omega Biotek</td><td>D6492-02</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>Binding buffer</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR041</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>SPW wash buffer</td><td>Omega Biotek</td><td>PDR045</td><td>DNA purification</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Biorad</td><td>165-2660</td><td>Trypanosome transformation</td></tr><tr><td>4 mm Electroporation cuvettes</td><td>VWR</td><td></td><td>Trypanosome transformation</td></tr></tbody></table>

using fluorescent proteins to monitor glycosome dynamics in the african trypanosome

Trypanosoma brucei é um parasita que causa cinetoplastida tripanossomíase humana Africano (HAT), ou doença do sono, e uma doença debilitante, nagana, em bovinos 1. Os suplentes do parasita entre na corrente sanguínea do hospedeiro mamífero eo vetor mosca tsé-tsé. A composição de muitas organelas celulares muda em resposta a essas condições extracelulares diferentes 2-5. Glicossomos peroxissomas são altamente especializados, em que muitas das enzimas envolvidas na glicólise estão compartimentados. Mudanças na composição glicossomo de uma forma de desenvolvimento e regulamentada ambientalmente 4-11. Atualmente, as técnicas mais comuns usadas para estudar glicossomo dinâmicas são microscopia eletrônica e de fluorescência; técnicas que são caros, tempo e mão de obra intensiva, e não é facilmente adaptada para análises de elevado rendimento. Para superar essas limitações, um sistema repórter fluorescente glicossomo emo que aumentou a proteína fluorescente amarela (EYFP) é fundido a uma sequência de direccionamento de peroxissoma (PTS2), que dirige a proteína de fusão para glicossomos 12, foi estabelecido. Após a importação da proteína de fusão PTS2eYFP, glicossomos se tornar fluorescente. Degradação organelo e reciclagem resulta na perda de fluorescência que pode ser medido por citometria de fluxo. Um grande número de células (5000 células / seg) podem ser analisados ​​em tempo real, sem grande preparação de amostras, tais como a fixação e montagem. Este método oferece uma maneira rápida de detectar mudanças na composição de organelas em resposta às variações das condições ambientais.

Neste sistema, uma alteração dependente de glucose em glicossomo composição foi observado. Quando as células são cultivadas em meios contendo glucose, duas populações são observados; um brilhante e uma fraca (Figura 2A). Células Dim abrigar glicossomos imaturas, que não tenham importado a PTS2eYFP enquanto as células vivas abrigam uma mistura de maduros e imaturos glicossomos 12. Quando a glicose está presente na mídia, mislocalization de glicossomo proteínas é letal 15,28 e glicossomo expressão da proteína é provavelmente associada intimamente com importação. Este regulamento apertado é responsável pelo aparecimento de células dim em que glicossomo expressão da proteína é suprimida quando as células não têm capacidade suficiente de importação. Uma vez que a importação de máquinas glicossomo está totalmente montada e funcional, as células expressam glicossomo proteínas, que são importados para glicossomos, produzindo células fluorescentes. Nos meios de comunicação de glicose-esgotar, o mislocalization de glicossomo proteínas é tolerard 15, e a distribuição da população bimodal é substituído por um único pico com uma gama mais ampla de fluorescência (Figura 2B). Este sistema foi utilizado para identificar as condições que provocam alterações na composição glicossomo. Quando as culturas de alta densidade contendo ~ 10% de células dim (Figura 3A) são passados ​​para meios frescos, existe um aumento transitório na percentagem de células dim (Figura 3B). Por 24 horas. a distribuição da população original for restabelecida (Figura 3C). <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td > SDM79 Sólidos </td><td > Peso (g / l) </td></tr><tr ><td > Graças media pó de células de insectos </td><td> 2 </td></tr><tr ><td > Glicose </td><td> 1 </td></tr><tr ><td > HEPES </td><td> 8 </td></tr><tr ><td > MOPS </td><td> 5 </td></tr><tr ><td > NaHCO3 </sub&gt; </td><td> 2 </td></tr><tr ><td > Piruvato de sódio </td><td> 0,1 </td></tr><tr ><td > L-alanina </td><td> 0,2 </td></tr><tr ><td > L-Arginina </td><td> 0,1 </td></tr><tr ><td > L-Glutamina </td><td> 0,3 </td></tr><tr ><td > L-Methonine </td><td> 0,07 </td></tr><tr ><td > A L-fenilalanina </td><td> 0,08 </td></tr><tr ><td > L-prolina </td><td> 0,6 </td></tr><tr ><td > L-Serina </td><td> 0.06 </td></tr><tr ><td > L-Taurina </td><td> 0,16 </td></tr><tr ><td > L-Treonina </td><td> 0,35 </td></tr><tr ><td > L-tirosina </td><td> 0,1 </td></tr><tr ><td > A adenosina </td><td> 0,01 </td></tr><tr ><td > Guanosine </td><td> 0,01 </td></tr><tr ><td > Glucosamina </td><td> 0,05 </td></tr><tr ><td > O ácido fólico </td><td> 0.004 </td></tr><tr ><td > r-aminobenzóico </td><td> 0.002 </td></tr><tr ><td > Biotina </td&gt; <td> 0,0002 </td></tr></tbody></table> Tabela 1 SDM79 componentes sólidos. Componentes do meio sólido e a quantidade (g / l) são fornecidos. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td > SDM79 </td><td ></td></tr><tr ><td > MEM com glutamina </td><td > 600 ml </td></tr><tr ><td > Pen / Strep </td><td > 10 ml </td></tr><tr ><td > Solução de vitamina BME </td><td > 10 ml </td></tr><tr ><td > MEM solução aminoácidos </td><td > 8 ml </td></tr><tr ><td > Solução de aminoácidos não essenciais MEM </td><td > 6 ml </td></tr><tr ><td > Hemin </td><td> 3,75 </td></tr><tr ><td > Água </td><td > 162,25 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 2. SDM79 componentes líquidos. Volumes ml são dadas. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr ><td ><strong&gt; Cytomix </td><td > Por 20 ml </td></tr><tr ><td > KCl 120 mM </td><td > 1,4 ml (1 M) </td></tr><tr ><td > 0,15 mM de CaCl2 </td><td > 3 ml (1 M) </td></tr><tr ><td > 10 mM de K 2 HPO 4 </td><td > 400 ml (0,5 M) </td></tr><tr ><td > HEPES 25 mM </td><td > 500 ml (1 M) </td></tr><tr ><td > 2 mM de EDTA </td><td > 80 ml (0,5 M) </td></tr><tr ><td > 5 mM de MgCl2 </td><td > 100 ml (1 M) </td></tr><tr ><td > Água </td><td> 16.52 </td></tr></tbody></table> Tabela 3 Cytomix receita. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51647/51647fig1highres.jpg" /> Figura 1 sistema glicossomo fluorescente repórter. A) integração expressão PTS2eYFP construção. Tripanossomas PCF foram transformadas com o PXS2PTS2eYFP plasmídeo linearizado com a enzima de restrição Mlul. Esta construção integra por recombinação homóloga no locus de tubulina (cuba) e sequências de PARP (PARP) inclui o promotor que dirige a expressão constitutiva de PTS2eYFP e as sequências necessárias para o processamento de ARN. B) PTS2eYFP importação. PTS2eYFP é sintetizada no citoplasma, onde se liga o receptor solúvel, PEX7, que proporciona a proteína repórter aos glicossomos. Uma vez entregue à membrana glicossomo, a proteína é importado. Organelas maturos com importação de máquinas PTS2eYFP importação e de fluorescência, enquanto aqueles que não contêm máquinas de importação funcional permanecer fraca. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51647/51647fig2highres.jpg" /> Figura 2.-glicose dependente glicossomo composição. PCF células foram cultivadas em SDM79 (+ Glc) ou SDM80 (Glc) eanalisadas por citometria de fluxo. Os histogramas de 10.000 eventos. A) Análise de células cultivadas em SDM79 revela de forma consistente dois picos. Células fluorescentes abrigar uma mistura de organelas maduros e imaturos com células de maiores intensidades de fluorescência com glicossomos mais maduros. Em SDM79, mislocalization de glicossomo proteínas é letal e glicossomo expressão de proteínas e de importação deve ser rigidamente controlado. Isso se reflete na ausência de células com intensidades de fluorescência intermediários. B) No SDM80, o mislocalization de glicossomo proteínas é tolerado, a distribuição da população bimodal é perdida, e as células de fluorescência intermediária são observados. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" width="500" src="/files/ftp_upload/51647/51647fig3highres.jpg" /> Figura 3 glicossomo remodelação. Remodelação de glicossomos é desencadeada por passagem em meio fresco. <stRong&gt; A) Histograma de 10000 eventos na cultura de partida (~ 4 x 10 6 / ml). B) três horas após a diluição em SDM79 fresco há um aumento na proporção de células com dim glicossomos imaturas que caem dentro da porta esquerda C ) Histograma da cultura diluída após 24 hr. Após 24 horas, a distribuição da população voltou ao normal, como os glicossomos imaturos agora contêm as proteínas peroxissoma necessário importar a proteína fluorescente.

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Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Utilizando Proteínas Fluorescentes para monitorar glicossomo Dynamics do Trypanosoma Africano

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.9K visualizações.  Clemson University Eukaryotic Pathogens Innovation Center. Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

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The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3. CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. Thus, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny are endowed with half the number of carboxyfluorescein-tagged molecules and thus each cell division can be assessed by measuring the corresponding decrease in cell fluorescence via Flow cytometry. The capacity of CFSE to label lymphocyte populations with a high fluorescent intensity of exceptionally low variance, coupled with its low cell toxicity, make it an ideal dye to measure cell division. Since it is a fluorescein-based dye it is also compatible with a broad range of other fluorochromes making it applicable to multi-color flow cytometry. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes for the purpose of monitoring up to 8 cell divisions. These labeled cells can be used both for in vitro and in vivo studies.

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. As such, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny have half the amount of fluorescence, which can thereby be used to assess cell division. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes with CFSE.

O Uso de diacetato carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE) para monitorar a proliferação de linfócitos

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

Imunologia e Infecção

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

Um Ensaio visual para o Monitor T6SS mediada Competição bacteriana

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

Utilização de<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem para monitorar a progressão da infecção pelo citomegalovírus Experimental Rato em recém-nascidos

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

De alto rendimento Gene Tagging no<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

Monitoramento da ubiquitina-proteassoma Atividade em células vivas Usando um Degron (dgn) desestabilizado Green Fluorescent Protein Protein Repórter (GFP) com base em

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Biologia

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Desenvolvimento de Sensor Baseado em pHluorin2 para pH Glicossômico em Trypanosoma brucei

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

Autor em destaque: Avanços no monitoramento do pH glicossômico em Trypanosoma brucei usando o biossensor pHluorin2

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

Medindo as alterações dinâmicas do pH glicossomal em Trypanosoma brucei vivo

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

Utilizando Proteínas Fluorescentes para monitorar glicossomo Dynamics do Trypanosoma Africano

Resumo

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Capítulos neste vídeo

O Uso de diacetato carboxifluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE) para monitorar a proliferação de linfócitos

Um Ensaio visual para o Monitor T6SS mediada Competição bacteriana

Utilização de

Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase

De alto rendimento Gene Tagging no

Monitoramento da ubiquitina-proteassoma Atividade em células vivas Usando um Degron (dgn) desestabilizado Green Fluorescent Protein Protein Repórter (GFP) com base em

Visualização do retículo endoplasmático Subdomains em células cultivadas

Medindo as alterações dinâmicas do pH glicossomal em Trypanosoma brucei vivo

Medindo as alterações dinâmicas do pH glicossomal em Trypanosoma brucei vivo

Medindo as alterações dinâmicas do pH glicossomal em Trypanosoma brucei vivo