Produção de inóculo fúngico micorrízico arbuscular (MA) e avaliação fenotípica da simbiose de arroz e micorrizas arbusculares em condições salinas

Este artigo descreve um protocolo para geração de inóculo de fungos micorrízicos arbusculares (AM) para investigar a tolerância ao estresse salino aumentado por AM em arroz.

O arroz (Oryza sativa L.) é uma cultura alimentar vital para mais da metade da população global. No entanto, seu crescimento é severamente impactado por solos salinos, que representam um desafio significativo para a produção agrícola em todo o mundo. Os fungos micorrízicos arbusculares (AM), que formam relações simbióticas mutualísticas com mais de 90% das plantas agrícolas e 80% das espécies de plantas terrestres, demonstraram aumentar a tolerância ao sal das plantas de arroz. Os fungos de micorrizas arbusculares são simbiontes obrigatórios que não podem completar seu ciclo de vida sem uma raiz hospedeira. Portanto, a utilização eficaz de plantas para produzir inóculo fúngico de micorrizas arbusculares é crucial para o avanço da pesquisa neste campo. Neste estudo, apresentamos uma série de métodos robustos que começam com a geração de inóculo de areia contendo esporos de Rhizophagus irregularis usando Allium tuberosum L. Esses métodos incluem a inoculação de mudas de arroz com o inóculo de areia, a análise do fenótipo de crescimento do arroz micorrízico e a quantificação dos níveis de colonização fúngica usando coloração azul de tripano sob estresse salino. Essas abordagens podem gerar eficientemente inóculo fúngico de micorrizas arbusculares para uma investigação mais aprofundada sobre como a simbiose de micorrizas arbusculares aumenta a tolerância à salinidade do arroz.

O solo salino é um obstáculo significativo para a produção agrícola em todo o mundo ^1,2,3. Estudos recentes indicam que até 50% das terras cultivadas serão degradadas até 2050 devido à salinização⁴. Os solos afetados pelo sal causam principalmente toxicidade nas plantas devido ao acúmulo de íons sódio (Na⁺) e cloreto (Cl⁻) nos tecidos vegetais. Esses íons, que dominam os solos salinos, também são os mais prejudiciais às plantas ^5,6,7. Por exemplo, o sódio inibe muitas atividades enzimáticas citosólicas⁸. O estresse salino também afeta a eficiência fotossintética e induz mudanças na toxicidade iônica, pressão osmótica e estrutura da parede celular, levando coletivamente ao acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} .

A simbiose micorrízica arbuscular (AM) é uma associação endossimbiótica entre fungos do filo Glomeromycota e raízes de plantas, que evoluiu aproximadamente 400-450 milhões de anos atrás com o surgimento das primeiras plantas terrestres^14,15. Mais de 80% das plantas vasculares podem ser colonizadas por fungos de micorrizas arbusculares¹⁶. Essa relação mutualística aumenta a absorção de nutrientes das plantas do solo, melhorando assim o crescimento e a tolerância ao estresse 17,18,19,20. Por exemplo, durante o estresse salino, os fungos de micorrizas arbusculares podem manter o equilíbrio iônico e ajudar a aumentar a disponibilidade de água e nutrientes, atividade antioxidante, eficiência fotossintética e produção de metabólitos secundários para plantas 2,21,22,23. Além disso, a simbiose AM evita a absorção excessiva de Na+ e o transporte das raízes para os brotos, promovendo a absorção de cátions essenciais, como K⁺, Mg²⁺ e Ca²⁺. Este processo aumenta a relação Mg²⁺/Na⁺ ou K⁺/Na⁺ em plantas sob condições salinas 23,24,25,26,27,28,29.

O arroz (Oryza sativa L.), uma cultura alimentar crucial para mais da metade da população global, pertence à família Gramineae (Poaceae) e é altamente suscetível ao estresse salino³⁰. Estudos também destacaram o papel dos fungos de micorrizas arbusculares no aumento da tolerância ao estresse salino no arroz 31,32,33. Por exemplo, o fungo AM Claroideoglomus etunicatum melhora a eficiência de fixação de CO₂ do arroz (Oryza sativa L. cv. Puntal) sob estresse salino³¹. Além disso, a expressão de genes-chave transportadores de arroz associados ao sequestro vacuolar de sódio e à recirculação de Na+ da parte aérea para as raízes é aumentada em plantas colonizadas por AM sob estresse salino³². Além disso, as plantas de arroz de terras altas inoculadas com Glomus etunicatum apresentam maior capacidade fotossintética, elevada produção de osmólitos, melhor potencial osmótico e maior rendimento de grãos em condições salinas³³. Nossa pesquisa anterior também demonstrou que o arroz micorrízico (Oryza sativaL. cv. Nipponbare) exibiu melhor crescimento reprodutivo e reprodutivo, uma relação K⁺/Na⁺ notavelmente maior na parte aérea e melhor capacidade de eliminação de espécies reativas de oxigênio (ROS) devido à simbiose de AM³⁴. Todos esses achados demonstram o impacto positivo da simbiose AM na tolerância ao estresse salino no arroz por meio de abordagens fenômicas. No entanto, os métodos experimentais não foram publicados em formato de vídeo.

Os fungos de micorrizas arbusculares são simbiontes obrigatórios que requerem uma raiz hospedeira para completar seu ciclo de vida, tornando o uso de plantas para produzir inóculo fúngico de micorrizas arbusculares crucial para o progresso da pesquisa³⁵. Um sistema de produção baseado em substrato, onde os fungos de micorrizas arbusculares são cultivados em substratos como vermiculita ou areia e os esporos são coletados para o inóculo³⁶, oferece uma solução econômica para a produção de inóculo fúngico de micorrizas arbusculares em larga escala. A eficiência da produção de esporos depende da compatibilidade e do crescimento das plantas, que afetam a colonização e propagação de fungos^37,38. No entanto, esse método costuma ser demorado, com abordagens tradicionais levando até 120 dias e produzindo baixa produção de esporos. Melhorias recentes reduziram o período de produção para 90 dias usando milho como planta hospedeira sob condições de luz LED³⁹. No entanto, um método robusto é apresentado para gerar inóculo de areia contendo esporos de Rhizophagus irregularis usando Allium tuberosum L. dentro de 10 semanas. Este inóculo de areia pode ser usado para analisar o fenótipo de crescimento do arroz micorrízico e quantificar os níveis de colonização fúngica usando coloração com azul de tripano sob estresse salino. Essas abordagens geram eficientemente inóculo fúngico de micorrizas arbusculares para uma investigação mais aprofundada sobre como a simbiose de micorrizas arbusculares aumenta a tolerância à salinidade do arroz.

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Geração de inóculo de areia contendo esporos de Rhizophagus irregularis usando Allium tuberosum L.

1. Lave a areia com água da torneira e autoclave-a.
2. Adicione 2/3 da areia a uma panela (diâmetro superior 14,7 cm, diâmetro inferior 11,5 cm, altura 13 cm). Adicione 1.000 esporos do fungo de micorrizas arbusculares Rhizophagus irregularis. Cubra com uma fina camada de areia. Adicione 30 sementes de cebolinha de alho (Allium tuberosum L.) e cubra as sementes com areia.
3. Cultive a cebolinha na câmara com um ciclo dia/noite de 16 h/8 h a 23,5 °C (55% de umidade relativa). Durante a primeira semana (1 semana após a inoculação, wpi), cubra a cebolinha com papel de alumina para bloquear a luz e regue-a três vezes por semana.
4. A partir de 2 wpi, fertilize a cebolinha duas vezes por semana com 80 mL de solução Hoagland de meia força contendo 25 μM KH₂PO₄. Fertilize uma vez por semana com 80 mL de água.
5. Após 10 semanas, colha as raízes da cebolinha para coloração azul tripano para avaliar o nível de colonização fúngica. Se o nível de colonização exceder 70%, pare de regar a cebolinha até que a areia esteja seca (cerca de 5 semanas). Coloque todo o inóculo de areia em um saco plástico e guarde-o na geladeira a 4 °C.

2. Coloração azul de tripano para verificar o nível de colonização fúngica

1. Incube pedaços de raiz por 30 min a >90 °C em 10% de KOH. Remova o KOH.
2. Enxágue os pedaços da raiz com água bidestilada (ddH₂O) três vezes.
3. Incube os pedaços de raiz com HCl 0,3 M por 15 min a 2 h. Remova o HCl.
4. Adicione 1 mL de azul de tripano a 0,1% e incube as amostras por 8 min a >90 °C.
5. Lave os pedaços da raiz com glicerol ácido a 50%. Transfira 10 pedaços de raiz para lâminas e adicione uma gota de glicerol ácido a 50%.
6. Sele as lamínulas e deslize com esmalte.
7. Examine 10 campos de visão de cada raiz ao microscópio para registrar a presença de estruturas fúngicas. Calcule o nível de colonização fúngica como uma porcentagem.
   NOTA: 50% de glicerol ácido: Prepare misturando glicerol e HCl 0,3 M na proporção de 1:1. 0,1% de azul de tripano: Dissolva 100 mg de azul de tripano em uma mistura de ácido lático 2:1:1, glicerol e ddH₂O.

3. Inoculação de mudas de arroz com inóculo de areia e tratamento por estresse salino

1. Remova a casca (casca) das sementes de arroz.
2. Esterilize as sementes com etanol 70% (EtOH) por 4 min e 30 s.
3. Coloque as sementes de arroz em um tubo de centrífuga. Adicione 3% de água sanitária (preparado com dH_{estéril 2}O) e agite por 30 min.
4. Remova o alvejante e lave as sementes com dH₂O estéril 3-4 vezes dentro da capela de fluxo laminar.
5. Cultive as sementes em meio Murashige-Skoog (1/2 MS) contendo 0,8% de ágar a 30 °C no escuro por 5 dias.
6. Cultive as mudas de arroz com um ciclo dia/noite de 12 horas a 30/28 °C e 70% de umidade do ar por 2 dias.
7. Transfira as mudas de arroz para tubos de plástico contendo areia esterilizada. Adicionar nenhum inóculo (simulado) ou 5 ml de inóculo de areia contendo esporos de Rhizophagus irregularis (Ri).
8. Regue as plantas de arroz com dH₂O 7 dias por semana durante a primeira semana após a inoculação. Fertilize as plantas a cada dois dias com uma solução de Hoagland de meia força contendo 25 μM de KH₂PO₄.
9. Às 5 semanas após a inoculação (wpi), trate um lote com 150 mM de NaCl (condição salina) e deixe o outro lote sem NaCl (condição não salina).
   1. Para a condição não salina, regue as plantas com solução de Hoagland de meia força contendo 25 μM de KH₂PO₄ na terça-feira e com água pelo resto da semana.
   2. Para a condição salina, regue as plantas com solução de Hoagland de meia força contendo 25 μM de KH₂PO₄ na terça-feira, com 150 mM de NaCl na segunda, quarta e sexta-feira e com água pelo resto da semana.
10. A 8 wpi, colha as plantas para medir seu peso fresco. Coloque as plantas em um forno a 70 °C por 2 dias para medir o peso seco. Analise o nível de colonização fúngica pela coloração com azul de tripano.

O fluxo de trabalho passo a passo é mostrado na Figura 1. Às 10 semanas pós-inoculação (wpi), estruturas fúngicas como vesículas e esporos, que são características do estágio tardio e da simbiose de micorrizas arbusculares, foram claramente observadas dentro das raízes da cebolinha (Figura 2A). Os níveis de hifas intrarradicais, arbúsculos, vesículas, hifas extrarradicais e esporos foram de 80%, 47%, 63%, 4% e 1%, respectivamente, indicando a progressão do desenvolvimento fúngico dentro das raízes da cebolinha. Portanto, o nível de colonização total atingiu 80% (Figura 2C). Esses resultados indicaram que a relação simbiótica entre cebolinha de alho e fungos de micorrizas arbusculares foi estabelecida com sucesso e que os fungos de micorrizas arbusculares foram capazes de completar seu ciclo de vida e gerar mais esporos. Utilizando o inóculo de areia gerado a partir da simbiose entre cebolinha e fungos de micorrizas arbusculares, as plantas de arroz foram colonizadas com sucesso por fungos de micorrizas arbusculares. Aos 8 wpi, vesículas e esporos foram observados dentro das raízes do arroz (Figura 2D), e os níveis de hifas intrarradicais, arbúsculos, vesículas, hifas extrarradicais, esporos e estruturas fúngicas totais foram de 91%, 82%, 95%, 46%, 2% e 93%, respectivamente (Figura 2E). Em seguida, as plantas de arroz foram cultivadas sem (simulado) ou com este inóculo de areia por 5 semanas e depois tratadas sem ou com solução salina (150 mM de NaCl) por 3 semanas. As plantas micorrízicas exibiram menos pontas de lâminas murchas do que as plantas simuladas sob estresse salino (Figura 2F). Em condições não salinas, as plantas de arroz micorrízico apresentaram maior biomassa da parte aérea do que as simuladas (Figura 2G). Sob estresse salino, a biomassa da parte aérea das plantas simuladas foi severamente reduzida, enquanto as plantas micorrízicas mantiveram sua biomassa da parte aérea, que foi 1,4 vezes maior do que a das plantas simuladas (Figura 2G). A simbiose de AM não afetou significativamente a biomassa radicular em nenhuma das condições ( Figura 2G ). Esses resultados sugerem que a simbiose de micorrizas arbusculares ajuda as plantas de arroz a sustentar um melhor crescimento da parte aérea sob estresse salino. Os níveis de colonização fúngica atingiram 84% e 83% em condições não salinas e salinas, respectivamente, indicando colonização bem-sucedida de raízes de arroz por fungos de micorrizas arbusculares. Além disso, os níveis de hifas extra-radicais foram maiores sob estresse salino. Não foram observadas diferenças significativas em outras estruturas fúngicas entre as condições não salinas e salinas, sugerindo que o estresse salino teve um impacto leve na simbiose AM (Figura 2H).

Figura 1: Fluxo de trabalho passo a passo. (A) O inóculo de areia foi preparado usando as seguintes etapas: Passo 1: Uma camada de algodão foi colocada no fundo do vaso e 2/3 de areia esterilizada foi adicionada ao vaso. Cerca de 1000-2000 esporos de Rhizophagus irregularis foram espalhados uniformemente usando pontas cortadas e, em seguida, cobertos com o 1/3 restante de areia esterilizada. Trinta sementes de Allium tuberosum L. foram espalhadas uniformemente sobre a superfície da areia e cobertas com papel de alumina para bloquear a luz. As plantas foram incubadas a 23 °C por uma semana. Passo 2: As sementes foram cultivadas por 10 semanas a 23 ° C com um ciclo claro / escuro de 16/8 e, em seguida, a rega foi interrompida. O nível de colonização das raízes foi verificado. Etapa 3: As areias foram secas ao ar, coletadas 15 semanas após a inoculação (wpi), bem misturadas e armazenadas em geladeira a 4 °C. (B) As sementes de arroz foram germinadas na caixa Magenta. Etapas 1 e 2: As sementes de arroz foram esterilizadas com etanol a 70% por 4 min 30 s, e o etanol foi substituído por 3% de perclorato de sódio. As sementes foram agitadas por 30 min e depois enxaguadas com água esterilizada cinco vezes. As sementes foram germinadas em meio 1/2 Murashige e Skoog (MS) com ágar 0,8% por 5 dias no escuro a 30 °C e 2 dias sob luz (ciclo dia/noite de 12/12 h a 30/28 °C). Passo 3: As mudas de arroz foram transferidas no 7º^~10º dia. (C) Inoculação e tratamento com solução salina. Passo 1: As mudas de arroz foram transplantadas para tubos plásticos contendo areia esterilizada sem (simulado) ou com 5 mL de inóculo de areia contendo esporos de Rhizophagus irregularis (Ri). As plantas foram cultivadas em câmara de crescimento com ciclo dia/noite de 12 h a 30/28°C, e as plantas foram cultivadas duas vezes por semana com meia solução de Hoagland contendo 25 μM de fosfato (Pi). Passo 2: Aos 5 wpi, as plantas micorrízicas e simuladas foram divididas em dois grupos. Um grupo foi tratado com 150 mM de cloreto de sódio (NaCl) (condição salina) e o outro grupo foi cultivado em condições não salinas. Passo 3: Aos 8 wpi, todas as plantas foram coletadas e, em seguida, a parte aérea e as raízes foram separadas para avaliar a massa fresca e a massa seca. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: O fenótipo de Allium tuberosum L. (cebolinha de alho), O. sativa L. japonica cv. Nipponbare (arroz) e Rhizophagus irregularis (fungos de micorrizas arbusculares). (A) Fotografia de raízes de cebolinha de alho micorrízico a 10 wpi. (B) Fotografia de cebolinhas micorrízicas a 10 wpi. (C) Nível de colonização fúngica das raízes da cebolinha de alho. (D) Fotografia de raízes de arroz micorrízico a 8 wpi. (E) Nível de colonização fúngica das raízes do arroz. (F) O fenótipo de plantas de arroz simulado e micorrízico sob estresse salino. (G) A massa seca de plantas de arroz simulado e micorrízico sob estresse não salino e salino, e (H) o nível de colonização fúngica das raízes de arroz micorrízico sob estresse salino a 8 wpi. Em (A-C), cebolinhas de alho foram inoculadas com 200 esporos de fungos de micorrizas arbusculares (R. irregularis, Ri), cultivadas em condições de fosfato de 25 μM e colhidas 10 semanas pós-inoculação (wpi). Nos painéis (D) e (E), plantas de arroz foram inoculadas com 5 mL de inóculo de areia derivado da simbiose entre cebolinha e fungos de micorrizas arbusculares (Rhizophagus irregularis, Ri), cultivadas em condições de fosfato de 25 μM e colhidas 8 semanas pós-inoculação (wpi). No painel (F), as plantas de arroz foram cultivadas sem (simulado) ou com inóculo de areia contendo fungos de micorrizas arbusculares (R. irregularis, Ri) por 5 semanas, seguido de tratamento com solução salina (150 mM de NaCl) por 3 semanas. As raízes foram coradas com azul tripano nos painéis (A) e (D). Nesses painéis, os esporos são indicados por pontas de setas brancas, vesículas por setas brancas e hifas extra-radicais por setas pretas. Barras de escala: 100 μm nos painéis (A) e (D); 1 cm no painel (B); e 10 cm no painel (F). Abreviaturas: hifas int, hifas intrarradicais; hifas ext, hifas extra-radicais. O erro padrão foi calculado a partir de 3-4 repetições biológicas. Letras diferentes indicam diferenças significativas entre os tratamentos (p < 0,05, ANOVA de duas vias seguida por um teste post hoc de diferenças menos significativas). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Existem algumas dicas sobre a preparação e uso do inóculo de areia. Primeiro, de acordo com nossa experiência, o nível de colonização da cebolinha deve ser superior a 70% (Figura 2C). Caso contrário, a inoculação seguinte em outras plantas, como tomate e arroz, não atingirá com sucesso mais de 50% em 7 semanas após a inoculação (wpi) (Figura 2E). Em segundo lugar, o inóculo de areia deve ser completamente seco ao ar antes do armazenamento e mantido dentro de um saco plástico limpo na geladeira para evitar que se molhe novamente (etapa 1.5). Caso contrário, a qualidade do inóculo de areia se deteriorará. Terceiro, o inóculo de areia pode ser armazenado na geladeira por cerca de 10 meses sem problemas. Quarto, o inóculo de areia deve ser bem misturado agitando o saco de armazenamento antes de adicioná-lo ao vaso para inocular outras plantas (etapa 3.7).

Em relação à coloração com azul de tripano, as raízes devem ser cortadas em pedaços de cerca de 1-1,5 cm de comprimento para coloração, para que a estrutura fúngica possa ser corada homogeneamente com azul de tripano (etapa 2.1). Para representar com precisão o nível de colonização micorrízica de uma raiz, deve-se observar dez campos de visão em intervalos quase iguais de uma extremidade da raiz à outra (etapa 2.7).

Em relação ao tratamento do estresse salino em arroz simulado e micorrízico, o tempo para esterilização das sementes de arroz com álcool deve ser preciso; caso contrário, afetará a taxa de germinação do arroz (etapa 3.2). Como a areia é usada como meio de cultivo, é importante garantir que o arroz receba água suficiente durante todo o processo de crescimento. Caso contrário, o arroz pode sofrer seca e alto estresse salino simultaneamente, dificultando a avaliação precisa dos resultados de crescimento (etapas 3.8-3.9).

Seguindo este protocolo, a tolerância ao estresse salino aumentada por AM pode ser observada na cultivar de arroz Nipponbare. No entanto, não se sabe se este tratamento de estresse salino também pode ser usado para observar a tolerância ao estresse salino aumentada por AM em outras cultivares de arroz. Caso contrário, algumas etapas podem ser modificadas, como usar mais inóculo de areia, iniciar o tratamento de estresse salino após 5 wpi, aumentar o período de estresse salino ou regar novamente as plantas após o estresse salino.

Os fungos de micorrizas arbusculares são simbiontes obrigatórios que precisam de raízes hospedeiras para completar seu ciclo de vida, tornando a produção de inóculo à base de plantas essencial para a pesquisa³⁵. Os sistemas baseados em substrato, onde os fungos crescem em materiais como vermiculita ou areia, oferecem uma maneira econômica de produzir inóculo em larga escala. No entanto, os métodos tradicionais podem levar até 120 dias e produzir baixo número de esporos 36,37,38. Melhorias recentes reduziram isso para 90 dias usando milho sob luz LED³⁹. Aqui, é apresentado um método para gerar esporos de Rhizophagus irregularis em areia usando Allium tuberosum L. em apenas 10 semanas. Este inóculo pode ser usado para estudar o crescimento do arroz, a colonização fúngica e a tolerância à salinidade, fornecendo uma ferramenta eficiente para a pesquisa da simbiose de micorrizas arbusculares.

Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

Reconhecemos Yun-Hsin Chen estabelecendo o sistema para investigar a tolerância ao estresse salino aprimorada por AM no arroz e Kai-Chieh Chang estabelecendo o sistema para gerar inóculo de areia. Este trabalho foi apoiado por doações do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia, Taiwan (NSTC 113-2326-B-002 -008 -MY3).