ייצור חיסון פטרייתי של מיקוריזה ארבוסקולרית (AM) והערכה פנוטיפית של סימביוזה של אורז ו-AM בתנאי מלח

מאמר זה מתאר פרוטוקול ליצירת חיסון פטריות מיקוריזה ארבוסקולר (AM) כדי לחקור סבילות מוגברת למלח באורז.

אורז (Oryza sativa L.) הוא גידול מזון חיוני ליותר ממחצית מאוכלוסיית העולם. עם זאת, צמיחתו מושפעת קשות מקרקעות מלוחות, המהוות אתגר משמעותי לייצור יבולים ברחבי העולם. הוכח כי פטריות מיקוריזה ארבוסקולריות (AM), היוצרות קשרים סימביוטיים הדדיים עם למעלה מ-90% מהצמחים החקלאיים ו-80% ממיני הצמחים היבשתיים, משפרות את הסבילות למלח של צמחי אורז. פטריות AM הן סימביונטים מחויבים שאינם יכולים להשלים את מחזור חייהם ללא שורש מארח. לכן, ניצול יעיל של צמחים לייצור חיסון פטרייתי AM הוא חיוני לקידום המחקר בתחום זה. במחקר זה, אנו מציגים סדרה של שיטות חזקות המתחילות ביצירת חיסון חול המכיל נבגים של Rhizophagus irregularis באמצעות Allium tuberosum L. שיטות אלה כוללות חיסון שתילי אורז בחיסון החול, ניתוח פנוטיפ הגידול של אורז מיקוריזה וכימות רמות ההתיישבות הפטרייתית באמצעות צביעה כחולה של טריפן תחת לחץ מלח. גישות אלו יכולות לייצר ביעילות חיסון פטרייתי AM לחקירה נוספת כיצד סימביוזה AM משפרת את סבילות המליחות של אורז.

קרקע מלוחה מהווה מכשול משמעותי לייצור יבולים ברחבי העולם ^1,2,3. מחקרים אחרונים מצביעים על כך שעד 50% מהאדמות המעובדות יושפלו עד 2050 עקב המלחה⁴. קרקעות המושפעות ממלח גורמות בעיקר לרעילות בצמחים עקב הצטברות יוני נתרן (Na⁺) וכלוריד (Cl⁻) ברקמות הצמח. יונים אלה, השולטים בקרקעות מלוחות, הם גם המזיקים ביותר לצמחים ^5,6,7. לדוגמה, נתרן מעכב פעילויות אנזימים ציטוזוליות רבות⁸. מתח מלח משפיע גם על יעילות הפוטוסינתזה וגורם לשינויים ברעילות יונית, לחץ אוסמוטי ומבנה דופן התא, מה שמוביל ביחד להצטברות של מיני חמצן תגובתיים (ROS)9,10,11,12,13.

סימביוזה של מיקוריזה ארבוסקולרית (AM) היא קשר אנדוסימביוטי בין פטריות ממשפחת Glomeromycota ושורשי צמחים, שהתפתחו לפני כ-400-450 מיליון שנה עם הופעתם של צמחי יבשה מוקדמים^14,15. למעלה מ-80% מצמחי כלי הדם יכולים להתיישב על ידי פטריות AM¹⁶. מערכת יחסים הדדית זו משפרת את ספיגת חומרי המזון של הצמחים מהאדמה, ובכך משפרת את הצמיחה ואת עמידות העקה 17,18,19,20. לדוגמה, במהלך עקת מלח, פטריות AM יכולות לשמור על איזון יונים ולעזור לשפר את זמינות המים והחומרים המזינים, פעילות נוגדת חמצון, יעילות פוטוסינתטית וייצור מטבוליט משני לצמחים 2,21,22,23. בנוסף, סימביוזה AM מונעת ספיגה מוגזמת של Na+ והובלה מהשורשים לנצרים, ומקדמת ספיגה של קטיונים חיוניים כגון K⁺, Mg²⁺ ו-Ca²⁺. תהליך זה מגדיל את יחס Mg²⁺/Na⁺ או K⁺/Na⁺ בצמחים בתנאי מלח 23,24,25,26,27,28,29.

אורז (Oryza sativa L.), גידול מזון חיוני ליותר ממחצית מאוכלוסיית העולם, שייך למשפחת Gramineae (Poaceae) והוא רגיש מאוד לעקת מלח³⁰. מחקרים הדגישו גם את תפקידן של פטריות AM בשיפור הסבילות ללחץ מלח באורז 31,32,33. לדוגמה, פטריית AM Claroideoglomus etunicatum משפרת את יעילות הקיבוע של CO₂ של אורז (Oryza sativa L. cv. Puntal) תחת לחץ מלח³¹. יתר על כן, הביטוי של גנים מרכזיים של טרנספורטר אורז הקשורים לקיבוע נתרן ואקואולרי ומחזור Na+ מהקלעים לשורשים משופר בצמחים שעברו מושבות AM תחת עקת מלח³². בנוסף, מפעלי אורז הרמה המחוסנים ב-Glomus etunicatum מציגים יכולת פוטוסינתטית משופרת, ייצור אוסמוליט מוגבר, פוטנציאל אוסמוטי משופר ותפוקת תבואה גדולה יותר בתנאים מלוחים³³. המחקר הקודם שלנו הראה גם שאורז מיקוריזה (Oryza sativaL. cv. Nipponbare) הפגין צמיחה טובה יותר של יורה ורבייה, יחס K⁺/Na⁺ גבוה משמעותית ביורה, ויכולת ניקוי משופרת של מיני חמצן תגובתיים (ROS) עקב סימביוזה^{AM 34}. כל הממצאים הללו מדגימים את ההשפעה החיובית של סימביוזה AM על סבילות למלח באורז באמצעות גישות פנומיות. עם זאת, שיטות הניסוי לא פורסמו בפורמט וידאו.

פטריות AM הן סימביונטים מחויבים הדורשים שורש מארח כדי להשלים את מחזור החיים שלהם, מה שהופך את השימוש בצמחים לייצור חיסון פטרייתי AM חיוני להתקדמות המחקר³⁵. מערכת ייצור מבוססת מצע, שבה מגדלים פטריות AM במצעים כמו ורמיקוליט או חול ונבגים נאספים לחיסון³⁶, מציעה פתרון חסכוני לייצור חיסון פטרייתי AM בקנה מידה גדול. היעילות של ייצור הנבגים תלויה בתאימות הצמח ובצמיחה, המשפיעים על קולוניזציה והתפשטות פטריות^37,38. עם זאת, שיטה זו לרוב גוזלת זמן, כאשר גישות מסורתיות לוקחות עד 120 יום ומניבות ייצור נבגים נמוך. שיפורים אחרונים צמצמו את תקופת הייצור ל-90 יום תוך שימוש בתירס כצמח המארח בתנאי תאורת LED³⁹. עם זאת, מוצגת שיטה חזקה ליצירת חיסון חול המכיל נבגים של Rhizophagus irregularis באמצעות Allium tuberosum L. תוך 10 שבועות. ניתן להשתמש בחיסון חול זה כדי לנתח את פנוטיפ הצמיחה של אורז מיקוריזה ולכמת את רמות ההתיישבות הפטרייתית באמצעות צביעה כחולה טריפן תחת לחץ מלח. גישות אלו מייצרות ביעילות חיסון פטרייתי AM לחקירה נוספת כיצד סימביוזה AM משפרת את סובלנות המליחות של אורז.

פרטי הריאגנטים והציוד המשמש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. יצירת חיסון חול המכיל נבגים של Rhizophagus irregularis באמצעות Allium tuberosum L.

1. שוטפים חול במי ברז ומבצעים חיטוי.
2. מוסיפים 2/3 מהחול לסיר (קוטר עליון 14.7 ס"מ, קוטר תחתון 11.5 ס"מ, גובה 13 ס"מ). הוסף 1,000 נבגים של פטריות AM Rhizophagus irregularis. מכסים בשכבה דקה של חול. מוסיפים 30 זרעי עירית שום (Allium tuberosum L.) ומכסים את הזרעים בחול.
3. מגדלים את עירית השום בתא במחזור יום/לילה של 16 שעות/8 שעות בטמפרטורה של 23.5 מעלות צלזיוס (55% לחות יחסית). במהלך השבוע הראשון (שבוע לאחר החיסון, wpi), מכסים את עירית השום בנייר אלומינה כדי לחסום את האור ולהשקות אותם שלוש פעמים בשבוע.
4. החל מ-2 wpi, דשן את עירית השום פעמיים בשבוע עם תמיסת הוגלנד בחצי חוזק של 80 מ"ל המכילה 25 מיקרומטר KH₂PO₄. דשן פעם בשבוע עם 80 מ"ל מים.
5. לאחר 10 שבועות, קצרו את שורשי עירית השום לצביעה כחולה של טריפן כדי להעריך את רמת ההתיישבות הפטרייתית. אם רמת ההתיישבות עולה על 70%, הפסיקו להשקות את עירית השום עד שהחול יבש (כ -5 שבועות). הכניסו את כל חיסון החול לשקית ניילון ואחסנו אותו במקרר בחום של 4 מעלות צלזיוס.

2. מכתים כחולים טריפן לבדיקת רמת ההתיישבות הפטרייתית

1. יש לדגור על חתיכות שורש למשך 30 דקות בטמפרטורה של >90 מעלות צלזיוס ב-10% KOH. הסר את ה-KOH.
2. שוטפים את חתיכות השורש במים מזוקקים כפול (ddH₂O) שלוש פעמים.
3. דגרו על חתיכות השורש עם 0.3 M HCl למשך 15 דקות עד שעתיים. הסר את ה-HCl.
4. מוסיפים 1 מ"ל של 0.1% טריפן כחול ודוגרים על הדגימות למשך 8 דקות בטמפרטורה של >90 מעלות צלזיוס.
5. שוטפים את חתיכות השורש עם 50% גליצרול חומצי. מעבירים 10 חתיכות שורש לשקופיות ומוסיפים טיפה של 50% גליצרול חומצי.
6. אטמו את הכיסויים והחליקו עם לק.
7. בחן 10 שדות ראייה של כל שורש תחת מיקרוסקופ כדי לתעד את נוכחותם של מבנים פטרייתיים. חשב את רמת ההתיישבות הפטרייתית באחוזים.
   הערה: 50% גליצרול חומצי: יש להכין על ידי ערבוב של גליצרול ו-0.3 M HCl ביחס של 1:1. 0.1% טריפן כחול: ממיסים 100 מ"ג טריפן כחול בתערובת של 2:1:1 חומצה לקטית, גליצרול ו-ddH₂O.

3. חיסון שתילי אורז עם חיסון חול וטיפול במתח מלח

1. הסר את הקליפה (הקליפה) מזרעי האורז.
2. עקרו את הזרעים עם 70% אתנול (EtOH) למשך 4 דקות ו -30 שניות.
3. מניחים את זרעי האורז בצינור צנטריפוגה. מוסיפים אקונומיקה 3% (מוכן עם dH₂O סטרילי) ומנערים למשך 30 דקות.
4. הסר את האקונומיקה ושטוף את הזרעים עם dH_{סטרילי 2}O 3-4 פעמים בתוך מכסה המנוע הלמינר.
5. מגדלים את הזרעים במדיום Murashige-Skoog (1/2 MS) בעל חצי חוזק המכיל 0.8% אגר ב-30 מעלות צלזיוס בחושך למשך 5 ימים.
6. מגדלים את שתילי האורז במחזור יום/לילה של 12 שעות בטמפרטורה של 30/28 מעלות צלזיוס ו-70% לחות אוויר למשך יומיים.
7. העבירו את שתילי האורז לצינורות פלסטיק המכילים חול מעוקר. הוסף ללא חיסון (מדומה) או 5 מ"ל של חיסון חול המכיל נבגים של Rhizophagus irregularis (Ri).
8. השקה את צמחי האורז ב-dH₂O 7 ימים בשבוע בשבוע הראשון לאחר החיסון. דשן את הצמחים כל יומיים בתמיסת הוגלנד בחצי חוזק המכילה 25 מיקרומטר של KH₂PO₄.
9. לאחר 5 שבועות לאחר החיסון (wpi), יש לטפל באצווה אחת ב-150 מ"מ של NaCl (מצב מלוח) ולהשאיר את האצווה השנייה ללא NaCl (מצב שאינו מלוח).
   1. למצב שאינו מלוח, יש להשקות את הצמחים בתמיסת הוגלנד בחצי חוזק המכילה 25 מיקרומטר של KH₂PO₄ ביום שלישי ובמים למשך שאר השבוע.
   2. לתנאי המלח, השקה את הצמחים בתמיסת הוגלנד בחצי חוזק המכילה 25 מיקרומטר של KH₂PO₄ ביום שלישי, עם 150 מ"מ של NaCl בימים שני, רביעי ושישי, ועם מים בשאר השבוע.
10. ב-8 wpi, קצרו את הצמחים כדי למדוד את משקלם הטרי. מכניסים את הצמחים לתנור של 70 מעלות למשך יומיים כדי למדוד את המשקל היבש. נתח את רמת ההתיישבות הפטרייתית על ידי צביעה כחולה טריפאן.

זרימת העבודה שלב אחר שלב מוצגת באיור 1. ב-10 שבועות לאחר החיסון (wpi), מבנים פטרייתיים כמו שלפוחיות ונבגים, האופייניים לשלב המאוחר ולסימביוזה של AM, נצפו בבירור בתוך שורשי עירית השום (איור 2A). רמות הקורים התוך-רדיקליים, ארבוסקולה, שלפוחית, קורים אקסטרה-רדיקליים ונבגים היו 80%, 47%, 63%, 4% ו-1%, בהתאמה, מה שמעיד על התקדמות התפתחות פטרייתית בתוך שורשי עירית השום. לכן, רמת הקולוניזציה הכוללת הגיעה ל-80% (איור 2C). תוצאות אלה הצביעו על כך שהקשר הסימביוטי בין עירית שום לפטריות AM הוקם בהצלחה וכי פטריות AM הצליחו להשלים את מחזור החיים שלהן ולייצר נבגים נוספים. באמצעות חיסון החול שנוצר מהסימביוזה בין עירית שום לפטריות AM, צמחי האורז יושבו בהצלחה על ידי פטריות AM. ב-8 wpi, שלפוחיות ונבגים נצפו בתוך שורשי האורז (איור 2D), ורמות הקורים התוך-רדיקליים, ארבוסקולה, שלפוחית, קורים אקסטרה-רדיקליים, נבגים וסך כל המבנים הפטרייתיים היו 91%, 82%, 95%, 46%, 2% ו-93%, בהתאמה (איור 2E). לאחר מכן גידלו צמחי אורז ללא (מדומה) או עם חיסון חול זה במשך 5 שבועות ולאחר מכן טופלו ללא או עם תמיסת מלח (150 מ"מ של NaCl) למשך 3 שבועות. צמחי מיקוריזה הראו פחות קצות להבים נבולים מאשר צמחים מדומים תחת עקת מלח (איור 2F). בתנאים לא מלוחים, צמחי אורז מיקוריזה הראו ביומסה גבוהה יותר של יורה מאשר צמחים מדומים (איור 2G). תחת עקת מלח, הביומסה של הנבטים של צמחים מדומים הצטמצמה מאוד, בעוד שצמחי מיקוריזה שמרו על הביומסה של הנבטים שלהם, שהייתה גבוהה פי 1.4 מזו של הצמחים המדומים (איור 2G). סימביוזה של AM לא השפיעה באופן משמעותי על ביומסה של שורש באף אחד מהתנאים (איור 2G). תוצאות אלה מצביעות על כך שסימביוזה של AM עוזרת לצמחי אורז לשמור על צמיחה טובה יותר של יורה תחת לחץ מלח. רמות ההתיישבות הפטרייתית הגיעו ל-84% ו-83% בתנאים שאינם מלוחים ומלוחים, בהתאמה, מה שמעיד על קולוניזציה מוצלחת של שורשי אורז על ידי פטריות AM. בנוסף, רמות קורים אקסטרה-רדיקליים היו גבוהות יותר תחת עקת מלח. לא נצפו הבדלים משמעותיים במבנים פטרייתיים אחרים בין תנאים שאינם מלוחים לתנאים מלוחים, מה שמרמז על כך שללחץ מלח הייתה השפעה מתונה על סימביוזה של AM (איור 2H).

איור 1: זרימת עבודה צעד-אחר-צעד. (A) חיסון החול הוכן באמצעות השלבים הבאים: שלב 1: שכבה של כותנה הונחה בתחתית הסיר, ו-2/3 של חול מעוקר נוסף לסיר. כ-1000-2000 נבגי Rhizophagus irregularis פוזרו באופן שווה באמצעות קצות חתוכים, ואז כוסו ב-1/3 הנותרים של חול מעוקר. שלושים זרעי Allium tuberosum L. היו מפוזרים באופן שווה על פני החול, וכוסו בנייר אלומינה כדי לחסום את האור. הצמחים הודגרו בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס למשך שבוע. שלב 2: הזרעים גודלו במשך 10 שבועות בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס עם מחזור אור / חושך של 16/8, ואז ההשקיה הופסקה. נבדקה רמת הקולוניזציה של השורשים. שלב 3: החולות יובשו באוויר, נאספו 15 שבועות לאחר החיסון (wpi), ערבבו היטב ואוחסנו במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. (B) זרעי אורז נבטו בקופסת המגנטה. שלבים 1 ו-2: זרעי אורז עוקרו ב-70% אתנול למשך 4 דקות ו-30 שניות, ואתנול הוחלף ב-3% נתרן פרכלורט. הזרעים ניערו במשך 30 דקות ולאחר מכן נשטפו במים מעוקרים חמש פעמים. הזרעים נבטו על 1/2 מדיום Murashige ו-Skoog (MS) עם 0.8% אגר במשך 5 ימים בחושך ב-30 מעלות צלזיוס ויומיים באור (מחזור יום/לילה של 12/12 שעות ב-30/28 מעלות צלזיוס). שלב 3: שתילי האורז הועברו^{ביום ה -7} ~ 10. (ג) חיסון וטיפול במי מלח. שלב 1: שתילי האורז הושתלו בצינורות פלסטיק המכילים חול מעוקר ללא (מדומה) או עם חיסון חול של 5 מ"ל המכיל נבגי Rhizophagus irregularis (Ri). הצמחים גודלו בתא גידול עם מחזור יום/לילה של 12 שעות ב-30/28 מעלות צלזיוס, והצמחים גודלו פעמיים בשבוע עם חצי תמיסת הוגלנד עם 25 מיקרומטר פוספט (Pi). שלב 2: ב-5 wpi, הצמחים המיקוריזה והמדומים חולקו לשתי קבוצות. קבוצה אחת טופלה ב-150 מ"מ של נתרן כלורי (NaCl) (מצב מלוח), והקבוצה השנייה גודלה בתנאים שאינם מלוחים. שלב 3: ב -8 wpi נאספו כל הצמחים, ואז הופרדו הקלעים והשורשים כדי להעריך את המשקל הטרי והמשקל היבש. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: הפנוטיפ של Allium tuberosum L. (עירית שום), O. sativa L. japonica cv. Nipponbare (אורז) ו-Rhizophagus irregularis (פטריות AM). (A) תצלום של שורשי עירית שום מיקוריזה ב-10 wpi. (B) תצלום של צמחי עירית שום מיקוריזה ב-10 wpi. (C) רמת קולוניזציה פטרייתית של שורשי עירית שום. (D) תצלום של שורשי אורז מיקוריזה ב-8 wpi. (E) רמת קולוניזציה פטרייתית של שורשי אורז. (F) הפנוטיפ של צמחי אורז מדומים ומיקוריזה תחת עקת מלח. (G) המשקל היבש של צמחי אורז מדומים ומיקוריזה תחת עקה לא מלוחה ומלח, ו-(H) רמת ההתיישבות הפטרייתית של שורשי אורז מיקוריזה תחת עקת מלח ב-8 wpi. ב-(A-C), עירית השום חוסנה ב-200 נבגים של פטריות AM (R. irregularis, Ri), שגודלו בתנאי 25 מיקרומטר פוספט, ונקטפו 10 שבועות לאחר החיסון (wpi). בפאנלים (D) ו-(E), צמחי אורז חוסנו ב-5 מ"ל של חיסון חול שמקורו בסימביוזה בין עירית שום לפטריות AM (Rhizophagus irregularis, Ri), שגודלו בתנאי 25 מיקרומטר פוספט, ונקטפו 8 שבועות לאחר החיסון (wpi). בפאנל (F), צמחי אורז גודלו ללא (מדומה) או עם חיסון חול המכיל פטריות AM (R. irregularis, Ri) במשך 5 שבועות, ולאחר מכן טופלו בתמיסת מלח (150 מ"מ של NaCl) למשך 3 שבועות. השורשים הוכתמו בכחול טריפן בלוחות (A) ו-(D). בפאנלים אלה, נבגים מסומנים על ידי ראשי חץ לבנים, שלפוחיות על ידי חיצים לבנים, וקורים אקסטרה-רדיקליים על ידי חיצים שחורים. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר בפאנלים (A) ו-(D); 1 ס"מ בלוח (B); ו -10 ס"מ בלוח (F). קיצורים: int hyphae, קורים תוך-רדיקליים; קורים חיצוניים, קורים אקסטרה-רדיקליים. שגיאת התקן חושבה מ-3-4 שכפולים ביולוגיים. אותיות שונות מצביעות על הבדלים מובהקים בין הטיפולים (p < 0.05, ANOVA דו-כיווני ואחריו הבדלים פחות משמעותיים מבחן פוסט הוק). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ישנם מספר טיפים לגבי הכנה ושימוש בחיסון חול. ראשית, מניסיוננו, רמת ההתיישבות של עירית שום צריכה להיות גבוהה מ-70% (איור 2C). אחרת, החיסון הבא על צמחים אחרים, כמו למשל עגבנייה ואורז, לא יגיע בהצלחה ליותר מ-50% לאחר 7 שבועות לאחר החיסון (wpi) (איור 2E). שנית, יש לייבש היטב את חיסון החול באוויר לפני האחסון ולשמור בתוך שקית ניילון נקייה במקרר כדי למנוע ממנו להירטב שוב (שלב 1.5). אחרת, איכות חיסון החול תידרדר. שלישית, ניתן לאחסן את חיסון החול במקרר כ-10 חודשים ללא בעיות. רביעית, יש לערבב היטב את חיסון החול על ידי ניעור שקית האחסון לפני הוספתו לעציץ כדי לחסן צמחים אחרים (שלב 3.7).

לגבי צביעה כחולה של טריפאן, יש לחתוך את השורשים לחתיכות באורך של כ- 1-1.5 ס"מ לצביעה כך שניתן יהיה להכתים את מבנה הפטרייה בצורה הומוגנית בכחול טריפן (שלב 2.1). כדי לייצג במדויק את רמת ההתיישבות המיקוריזה של שורש, יש להתבונן בעשרה שדות ראייה במרווחים כמעט שווים מקצה אחד של השורש לקצה השני (שלב 2.7).

לגבי טיפול במתח מלח על אורז מדומה ומיקוריזה, הזמן לעיקור זרעי אורז באלכוהול חייב להיות מדויק; אחרת, זה ישפיע על קצב הנביטה של האורז (שלב 3.2). מכיוון שחול משמש כמצע הגידול, חשוב לוודא שהאורז יקבל מספיק מים לאורך כל תהליך הגידול. אחרת, האורז עלול לחוות בצורת ולחץ מלח גבוה בו זמנית, מה שמקשה על הערכה מדויקת של תוצאות הגידול (שלבים 3.8-3.9).

על ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן להבחין בסבילות מוגברת למלח בזן האורז Nipponbare. עם זאת, לא ידוע אם ניתן להשתמש בטיפול זה בעקת מלח גם כדי לצפות בסבילות ללחץ מלח מוגבר ב-AM בזני אורז אחרים. אם לא, ניתן לשנות כמה שלבים, כגון שימוש בחיסון חול נוסף, התחלת טיפול בעקת מלח לאחר 5 wpi, הגדלת פרק הזמן לעקת מלח או השקיה מחדש של הצמחים לאחר עקת מלח.

פטריות AM הן סימביונטים מחויבים הזקוקים לשורשי מארח כדי להשלים את מחזור החיים שלהם, מה שהופך את ייצור החיסון הצמחי לחיוני למחקר³⁵. מערכות מבוססות מצע, שבהן פטריות גדלות בחומרים כמו ורמיקוליט או חול, מציעות דרך חסכונית לייצר חיסון בקנה מידה גדול. עם זאת, שיטות מסורתיות יכולות להימשך עד 120 יום ולהניב מספרי נבגים נמוכים 36,37,38. שיפורים אחרונים צמצמו זאת ל-90 יום באמצעות תירס תחת אור LED³⁹. כאן, מוצגת שיטה ליצירת נבגי Rhizophagus irregularis בחול באמצעות Allium tuberosum L. תוך 10 שבועות בלבד. ניתן להשתמש בחיסון זה כדי לחקור צמיחת אורז, קולוניזציה של פטריות וסבילות למליחות, ומספק כלי יעיל לחקר סימביוזה של AM.

המחברים מצהירים שאין להם ניגודי אינטרסים.

אנו מודים ליון-שין צ'ן שהקים את המערכת לחקירת עמידות מוגברת למלח באורז, וקאי-צ'יה צ'אנג הקים את המערכת ליצירת חיסון חול. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה, טייוואן (NSTC 113-2326-B-002 -008 -MY3).