Colheita de órgãos-alvo vestibulares sob condições fisiológicas durante a labirintectomia

Aqui, descrevemos uma técnica para a coleta de órgãos-alvo vestibulares humanos sob condições fisiológicas durante a labirintectomia e sua análise usando imunocoloração.

O ouvido interno humano vivo é difícil de estudar porque está envolto em um osso denso da cápsula ótica que limita o acesso ao tecido biológico. Os métodos tradicionais de histopatologia do osso temporal dependem de protocolos de descalcificação longos e caros que levam de 9 a 10 meses e reduzem os tipos de análise de tecido possíveis devido à degradação do RNA. Há uma necessidade crítica de desenvolver métodos para acessar o tecido fresco do ouvido interno humano para entender melhor as doenças otológicas, como a doença de Ménière, em nível celular e molecular. Este artigo descreve uma técnica para a coleta de órgãos-alvo vestibulares humanos de um doador vivo em condições fisiológicas. Um indivíduo com doença de Ménière e 'ataques de gotas' refratários à injeção intratimpânica de gentamicina foi submetido à labirintectomia. Uma mastoidectomia tradicional foi realizada pela primeira vez, e os canais semicirculares horizontais e superiores (CEC) foram identificados. A cavidade mastóidea foi preenchida com uma solução salina balanceada para que o labirinto pudesse ser aberto em condições mais fisiológicas para preservar a integridade celular. Um endoscópio de zero grau com um sistema de irrigação por bainha de limpeza de lentes foi usado para visualizar a cavidade mastóidea submersa, e uma broca de diamante de 2 mm foi usada para esqueletizar e abrir os CCEs horizontais e superiores, seguidos pelo vestíbulo. As ampolas e a porção dos ductos do canal para os CECs superior e lateral foram colhidas. O utrículo foi colhido de forma semelhante. O tecido colhido foi imediatamente colocado em um tampão gelado e, em seguida, fixado por uma hora em paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS). O tecido foi enxaguado várias vezes em 1x PBS e armazenado por 48 h a 4 °C. As amostras de tecido foram submetidas à imunomarcação com uma combinação de anticorpos primários contra tenascina-C (cálice), oncomodulina (células ciliadas estreolares), calretinina (cálice e células ciliadas tipo II), proteína 2 da vesícula sináptica (fibras eferentes e botões), β-tubulina 1 (cálice e botões aferentes), seguida de incubação com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo. As amostras de tecido foram então enxaguadas e montadas para exame de microscopia confocal. As imagens revelaram a presença de células ciliadas ampulares e maculares e estruturas neurais. Este protocolo demonstra que é possível colher tecido da orelha interna humana intacto e de alta qualidade de doadores vivos e pode fornecer uma ferramenta importante para o estudo da doença otológica.

O ouvido interno humano vivo é difícil de estudar devido à sua localização dentro do osso da cápsula ótica densa do osso temporal. Consequentemente, o acesso ao tecido interno humano tem sido limitado e os pesquisadores confiaram principalmente na colheita de tecido post-mortem. A histopatologia post-mortem do osso temporal (TBH) tem sido uma ferramenta crítica para a compreensão da doença otológica humana há mais de 100 anos ^1,2,3. O tecido para TBH é preparado pela colheita post-mortem do osso temporal, um longo processo de descalcificação e preparação do tecido (9-10 meses), seguido de coloração de hematoxilina e eosina. Embora o TBH continue sendo uma ferramenta essencial para revelar novas informações sobre o ouvido interno humano saudável e doente, longos tempos post-mortem e métodos longos e severos de processamento de tecidos limitam sua utilidade para certos fins, necessitando de métodos adjuvantes para estudar o tecido do ouvido interno humano. A ressonância magnética de alta resolução pode visualizar órgãos da orelha interna, mas não tem resolução suficiente para visualizar estruturas em nível celular ou molecular ^4,5. Devido a esses desafios, muitas doenças do ouvido interno humano permanecem pouco compreendidas.

Uma abordagem alternativa é colher o tecido do ouvido interno durante a cirurgia. Durante a labirintectomia ou ressecção do schwannoma vestibular translabiríntico, os tecidos da orelha interna são intencionalmente sacrificados. Utrículos colhidos de pacientes durante a ressecção translabiríntica de schwannoma vestibular têm sido usados para caracterizar a morfologia das células ciliadas vestibulares ^6,7,8 e estudar a regeneração das células ciliadas ^9,10. Mais recentemente, foram desenvolvidas técnicas para captar órgãos da orelha interna de doadores de órgãos usando uma abordagem transcanal que pode ser usada para remover o utrículo e potencialmente outros órgãos terminais vestibulares através de uma janela oval alargada com trauma tecidual mínimo^11,12. Utilizando essa técnica, foi possível caracterizar perfis transcriptômicos de célula única para o utrículo humano¹³. No entanto, essas técnicas expõem os órgãos da orelha interna a condições não fisiológicas durante a colheita. Especificamente, os órgãos do ouvido interno podem ser expostos à ausência de líquido perilinfático e submersão na irrigação normal com soro fisiológico, que tem uma composição iônica substancialmente diferente do líquido perilinfático. Além disso, o labirinto membranoso desidratado é difícil de visualizar, mesmo com ampliação máxima do microscópio cirúrgico, o que torna a dissecção cirúrgica atraumática desafiadora. O trauma mecânico pode danificar ainda mais o tecido, e nossa experiência anedótica sugere que o tecido cirúrgico é frequentemente de qualidade insuficiente de imunocoloração devido a danos mecânicos e degeneração celular. Há necessidade de novas técnicas para coletar atraumaticamente o tecido da orelha interna humana para estudos biológicos que possam elucidar doenças da orelha interna humana mal compreendidas. Aqui descrevemos uma técnica subaquática para a colheita de órgãos-alvo vestibulares humanos sob condições mais fisiológicas durante a labirintectomia e sua análise usando imunocoloração.

Este protocolo foi desenvolvido com a aprovação do conselho de revisão institucional (IRB) da Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins (IRB00203441) e de acordo com as políticas institucionais para o uso de tecido humano e material potencialmente infeccioso. A coleta de tecido foi realizada durante a labirintectomia, que faz parte do tratamento clínico padrão para a doença de Ménière recalcitrante com ataques de queda.

1. Labirintectomia e colheita de tecidos

1. Obtenha a aprovação do conselho do conselho de revisão institucional local (IRB), revise as políticas institucionais para o uso de material humano e infeccioso e obtenha consentimento para doação de tecidos antes de utilizar este protocolo. Realize a coleta de tecido durante a labirintectomia cirúrgica ou abordagem translabiríntica do canal auditivo interno, que faz parte do tratamento clínico padrão.
2. Prepare o paciente.
   1. Antes da indução da anestesia, discuta com a equipe de anestesia como evitar paralisia de ação prolongada para que o nervo facial possa ser monitorado.
   2. Uma vez induzida a anestesia geral, intubar o paciente e girar a mesa cirúrgica 180°. Coloque os eletrodos de monitoramento do nervo facial e certifique-se de que a profilaxia antibiótica pré-operatória seja administrada.
   3. Injetar lidocaína a 1% com epinefrina 1:100.000 no conduto auditivo externo e na área pós-auricular. Prepare a orelha da maneira padrão usando betadine.
3. Use uma lâmina #15 para criar uma incisão curvilínea pós-auricular padrão (5-6 cm) 1 cm posterior à prega pós-auricular.
4. Levante o tecido mole pós-auricular.
   1. Identifique a fáscia temporal superiormente e eleve o retalho cutâneo pós-auricular anteriormente em direção ao canal auditivo.
   2. Crie uma incisão periosteal padrão em forma de 7 e eleve o periósteo anteriormente até que a coluna de Henle e o canal auditivo ósseo sejam identificados. Coloque afastadores de auto-retreinamento.
5. Realize a mastoidectomia.
   1. Realize uma mastoidectomia completa, identificando o tegmen superiormente, o seio sigmóide posteriormente e afinando o conduto auditivo externo anteriormente.
   2. Identifique o canal semicircular horizontal e o processo curto da bigorna.
      NOTA: A mastóide não deve ser saucerizada para garantir que continue sendo um recipiente capaz de reter líquido para coleta de tecido subaquático.
6. Identifique os canais semicirculares (SC).
   1. Sob o microscópio cirúrgico (ampliação de 2-4x), use uma broca de diamante grossa de 3 mm para remover as células de ar perilabirínticas laterais ao SC superior, as células de ar subarqueadas e as células de ar retrolabirínticas atrás do SC posterior, estendendo-se superiormente à cruz comum.
7. Mergulhe o labirinto.
   1. Mergulhe a cavidade mastóidea em uma solução salina balanceada (BSS) e visualize o labirinto usando um endoscópio de zero grau com um sistema de irrigação por bainha de limpeza de lentes.
   2. Use o sistema de irrigação da bainha de limpeza de lentes para irrigar a cavidade mastóidea com BSS, lavando o sangue e permitindo uma melhor visualização do labirinto.
8. SCs de linha azul.
   1. Enquanto mantém um nível adequado de BSS na cavidade mastóidea e usa o endoscópio para visualização, use uma broca de diamante de 3 mm para 'linha azul' todos os três canais semicirculares, perfurando cuidadosamente o osso da cápsula ótica até que o canal semicircular apareça como uma linha azulada quando visto com o endoscópio.
   2. Irrigue intermitentemente com solução BSS usando o sistema de irrigação para lavar o sangue e obter uma visualização adequada, conforme ilustrado na Figura 1.
9. Colha ampolas SC.
   1. Sob BSS, entre na cúpula do canal semicircular lateral e siga-a anteriormente até que suas ampolas sejam identificadas. Entre no SC superior e siga-o medialmente em direção às suas ampolas, que podem ser colhidas com as ampolas do SC superior. Corte o ducto SC lateral bruscamente para facilitar a remoção.
   2. Eleve as ampolas SC horizontais e superiores da crista usando uma agulha de Rosen e separe as fibras aferentes do epitélio e do labirinto membranoso. Em seguida, remova essas estruturas.
   3. Passe a cúpula do SC posterior e siga-a inferior e anteriormente às suas ampolas. Da mesma forma, colha as ampolas SC posteriores e coloque todo o tecido da BSS no gelo.
10. Colha mácula.
    1. Remova o osso entre as ampolas SC horizontal e posterior para expor o vestíbulo. As paredes membranosas do utrículo terão sido rasgadas com a remoção das ampolas. Enquanto um nível de fluido for mantido, as máculas permanecerão presas anteriormente; eleve-o e remova-o.
    2. O sáculo fica dentro do recesso esférico; eleve bruscamente e remova-o do recesso. Da mesma forma, coloque as amostras de tecido em BSS no gelo.
11. Transporte amostras de tecido em gelo da sala de cirurgia para o laboratório para fixação dentro de 1 h após a colheita.

2. Imuno-histoquímica e imagem

1. Corrija a amostra.
   1. Coloque a amostra de tecido em paraformaldeído (PFA) a 4% em solução salina tamponada com fosfato 1x (1x PBS) à temperatura ambiente (RT) com balanço suave ou agitação orbital (100 rpm) por 1 h.
      NOTA: Solução de PFA a 4% (para 5 mL no total): 625 mL de solução estoque de PFA a 32% + 500 mL de 10xPBS + 3875 mL de ddH₂O.
2. Transfira amostras de tecido para 1x solução PBS e enxágue 3x 15 min (ou mais, se necessário) em RT com balanço suave ou agitação orbital.
3. Remova o excesso de tecido conjuntivo sob o microscópio de dissecação em 1x PBS na RT.
4. Descalcifique a amostra.
   1. Transfira amostras de tecido para ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) a 5% em 1x solução de PBS para limpar o epitélio sensorial de detritos ósseos finos e otocônias. Execute a incubação por 15-30 min em RT, com balanço suave ou agitação orbital.
5. Novamente, transfira amostras de tecido para 1x solução PBS e enxágue 3x 15 min (ou mais, se necessário) em RT com balanço suave ou agitação orbital.
6. Aplique 125-200 mL de tampão de bloqueio 2x (2x BB) em cada amostra e incube por 1,5-5 h em RT ou durante a noite (ON) a 4 ° C. Execute a incubação sob constante agitação orbital.
   NOTA: 2x Tampão bloqueador (2x BB): 1 g de albumina de soro bovino (BSA) dissolvido em até 5 mL de 1x PBS suplementado com 0,5% de Triton X-100. O BSA serve como agente de bloqueio para locais de ligação de antígenos não específicos.
7. Corar usando anticorpos primários.
   1. Aplique 120-150 mL de uma combinação de anticorpos primários dissolvidos em 1x BB na diluição desejada. Aplique anticorpos anti-tenascina-C de coelho na diluição de 1:200 (2,5 μg/mL), anticorpos anti-oncomodulina de cabra na diluição de 1:200 (2,5 μg/mL), anticalretinina de camundongo na diluição de 1:300 (2,2 μg/mL) e DAPI na diluição de 1:1000 (1 μg/mL). Em seguida, transferir a amostra (coberta) para 4 °C (frigorífico ou câmara frigorífica) sob agitação orbital suave para incubação ON.
      NOTA: 1x BB: Misture o mesmo volume de 2x BB e 1x PBS suplementado com 0,5% de Triton X-100.
8. Enxágue as amostras de tecido em 1x solução PBS, 3x 15 min (ou mais, se necessário), em RT com um balanço suave.
9. Corar usando anticorpo secundário.
   1. Aplique 120-150 mL de uma combinação de anticorpos secundários conjugados com fluoróforo dissolvidos em 1x BB na diluição de 1:2000 (1 μg/mL). Aplique anticorpo secundário anti-coelho conjugado de 488 nm, anticorpo secundário anti-camundongo de 568 nm e anticorpo secundário anti-cabra de 647 nm.
   2. Em seguida, incubar a amostra (coberta) em RT sob agitação orbital suave por 1,5-2 h (ou ON a 4 °C).
10. Enxágue as amostras de tecido em 1x solução PBS, 3x 15 min (ou mais, se necessário), em RT com um balanço suave.
11. Realize a microdissecção e montagem.
    1. Sob o microscópio de dissecação, remova o excesso de tecido e membranas ao redor do epitélio vestibular sensorial. Use etanol a 70% para limpar a superfície de uma lâmina de histologia de vidro, seque ao ar e aplique uma gota de 55 mL do meio de montagem apropriado.
    2. Transfira as amostras de tecido sensorial para o meio de montagem. Use uma pinça fina para orientar suavemente as amostras com o feixe de cabelo voltado para cima no meio de montagem.
    3. Coloque suavemente uma lamínula de tamanho apropriado no meio de montagem que contém as amostras, tentando limitar as bolhas de ar. Certifique-se de que a lamínula seja do grau de espessura #1.5 necessário para microscopia confocal.
    4. Coloque as corrediças em uma área escura (por exemplo, uma gaveta de bancada) para deixar o meio de montagem endurecer. Sele a lamínula na lâmina com esmalte transparente e deixe secar em uma área escura antes de examiná-la com o microscópio confocal. Em seguida, guarde as lâminas seladas no escuro (caixa de lâminas da pasta de slides) a 4° até a geração de imagens.
12. Use um microscópio confocal com ampliação de 40x-100x com canais de 488 nm e 657 nm para obter imagens da amostra.

Usando essa técnica, o utrículo humano e as ampolas do canal lateral e superior foram colhidos intactos com trauma mínimo (Figura 2). Como pode ser visto na Figura 2, as ampolas podem ser colhidas com uma porção substancial do ducto membranoso. A marcação imunofluorescente com antitenascina-C (proteína da matriz extracelular) e anti-oncomodulina (pequena proteína ligadora de cálcio da família das proteínas parvalbumina) mostrou células ciliadas vestibulares tipo 1 intactas (Figura 3). A densidade de células ciliadas foi de 82 por 10.000 μm². Esses resultados demonstram a utilidade dessa técnica para a coleta de tecido da orelha interna humana com trauma mínimo no neuroepitélio.

Figura 1: Ilustração da configuração cirúrgica. Ilustração do conjunto cirúrgico: A cavidade mastóidea esquerda é mostrada com os canais semicirculares lateral, superior e posterior. A cavidade mastóidea é submersa em solução salina balanceada e um endoscópio de zero grau é usado para visualizar a cavidade mastóidea, enquanto uma broca de diamante é usada para abrir o labirinto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Labirinto membranoso. O utrículo humano colhido e as ampolas do canal lateral e (B) superior foram colhidas sob um estereomicroscópio de luz com aumento de 5x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Utrículo. Projeções de intensidade máxima de marcação imunofluorescente do utrículo humano com ampliação de 40x tiradas com um microscópio confocal. As fendas sinápticas do cálice são marcadas com anticorpos anti-tenascina-C (verde). As células vestibulares do tipo 1 são coradas com anti-oncomodulina (vermelho). Barra de escala: 50 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Este artigo descreve uma nova técnica para a coleta subaquática de órgãos terminais vestibulares em BSS usando endoscópios e sua análise usando imagens imunofluorescentes. Aqui, demonstramos a colheita de órgãos-alvo vestibulares intactos com células ciliadas vestibulares intactas e qualidade de tecido suficiente para uma imunomarcação bem-sucedida. A densidade de células ciliadas em nosso espécime foi semelhante àquelas obtidas em outros estudos de doadores de órgãos vivos¹³. Até onde sabemos, este é o primeiro relato de uma técnica subaquática para captação de órgãos-alvo vestibulares que permite a manutenção de condições quase fisiológicas. Tratava-se de uma adaptação de uma técnica subaquática para reparo de deiscência do canal semicircular superior que utiliza BSS para manter as condições fisiológicas enquanto o labirinto é aberto para tamponamento^14,15.

Este trabalho expande técnicas anteriores desenvolvidas para a coleta de órgãos vestibulares durante a labirintectomia ou ressecção de schwannoma vestibular ^6,7,8 e de doadores de órgãos vivos^11,12. A técnica subaquática é facilmente adaptável à ressecção do schwannoma vestibular, durante a qual o labirinto é aberto de forma semelhante após uma mastoidectomia. A retirada de órgãos-alvo vestibulares de doadores vivos de órgãos tem sido realizada de forma limitada e por via transcanal¹². Essa abordagem transcanal depende da remoção da membrana timpânica e dos ossículos e do alargamento da janela oval antes da coleta do órgão-alvo vestibular. A coleta de tecidos de doadores de órgãos vivos requer trabalhar simultaneamente com a equipe de cirurgia de transplante em um espaço limitado que é compartilhado com a anestesia na cabeceira do leito do paciente. É improvável que a técnica aqui apresentada seja adaptável às restrições de tempo e espaço da coleta de órgãos-alvo vestibulares durante a doação de órgãos vivos. No entanto, essa técnica oferece a vantagem de expor e colher facilmente as ampolas dos canais semicirculares, o que seria difícil de realizar através da janela oval.

O estudo do tecido do ouvido interno humano será fundamental para elucidar a fisiopatologia dos distúrbios do ouvido interno, muitos dos quais permanecem idiopáticos. Por exemplo, a doença de Ménière é comumente encontrada em clínicas otológicas, mas sua etiologia permanece desconhecida e não há opções de tratamento comprovadas^16,17. Técnicas como transcriptômica espacial e imagem imunofluorescente oferecem uma excelente oportunidade para lançar luz sobre a doença do ouvido interno e, até agora, têm sido utilizadas apenas de forma limitada. Os métodos para colher órgãos preservados do ouvido interno oferecem uma oportunidade de usar técnicas moleculares mais recentes e podem oferecer um complemento útil ao TBH padrão. Embora o método descrito aqui tenha sido utilizado apenas para coloração imunofluorescente, acreditamos que esse tecido seria de qualidade suficiente para transcriptômica espacial.

A principal limitação deste protocolo é que ele depende de material cirúrgico prontamente disponível. Atualmente, a labirintectomia é um tratamento pouco utilizado para a doença de Ménière, e mesmo centros de referência movimentados podem realizar apenas vários desses procedimentos por ano. A ressecção do schwannoma vestibular translabiríntico é realizada com maior frequência; no entanto, essa técnica pode adicionar tempo a um procedimento já demorado. Estimamos que a submersão da cavidade mastóidea e a abertura dos canais subaquáticos adicionem cerca de 30 minutos à cirurgia. Além disso, ainda não foi realizada uma análise lado a lado comparando a qualidade do tecido obtido usando esta técnica com a coleta padrão de órgãos vestibulares durante a labirintectomia ou ressecção do schwannoma vestibular, pois não é possível realizar tal análise com tecido colhido de um doador. Mais pesquisas são necessárias para determinar o efeito das condições durante a extração de órgãos na qualidade do tecido para microscopia e outras técnicas.

Em resumo, descrevemos uma nova técnica para a colheita subaquática de órgãos terminais vestibulares durante a labirintectomia e sua capacidade de produzir amostras de tecido de alta qualidade com células ciliadas vestibulares preservadas e contatos neurais. Essa técnica permite a coleta de tecidos em um ambiente o mais próximo possível das condições fisiológicas normais e pode fornecer uma ferramenta útil para estudar o ouvido interno humano.

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecemos a Mohamed Lehar por sua ajuda neste projeto. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Surdez e Outros Distúrbios da Comunicação (U24DC020850).