迷路切除术中生理条件下前庭终末器官的收获

在这里，我们描述了一种在迷路切除术期间在生理条件下采集人类前庭末器官的技术，并使用免疫染色对其进行分析。

活着的人类内耳研究具有挑战性，因为它被包裹在致密的耳囊骨中，限制了对生物组织的接触。传统的颞骨组织病理学方法依赖于漫长、昂贵的脱钙方案，这些方案需要 9-10 个月，并且由于 RNA 降解而减少了可能的组织分析类型。迫切需要开发获取新鲜人类内耳组织的方法，以便在细胞和分子水平上更好地了解耳科疾病，例如梅尼埃病。本文描述了一种在生理条件下从活体供体采集人前庭末末器官的技术。一名患有梅尼埃病和鼓室内庆大霉素注射难治性“滴剂发作”的个体接受了迷路切除术。首先进行传统的乳突切除术，并确定水平半规管和上半规管 （SCC）。乳突腔充满平衡盐溶液，以便迷路可以在更生理条件下打开，以保持细胞完整性。 使用与晶状体清洁鞘冲洗系统拟合的零度内窥镜来观察浸没的乳突腔，并使用 2 mm 金刚石毛刺将水平和上 SCC 骨架化并打开，然后是前庭。收获了用于上 SCC 和外侧 SCC 的壶腹和部分管管。椭圆囊也同样收获。将收获的组织立即置于冰冷的缓冲液中，然后在 4% 多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中固定 1 小时。将组织在 1x PBS 中冲洗数次，并在 4 °C 下储存 48 小时。 组织样本使用抗 tenascin-C （花萼）、肿瘤调节蛋白 （纹状毛细胞）、钙调蛋白 （花萼和 II 型毛细胞）、突触囊泡蛋白 2 （传出纤维和钮扣）、β-微管蛋白 1 （花萼和传入钮扣） 的一抗进行免疫染色，然后与荧光团偶联的二抗孵育。然后冲洗组织样本并封片以进行共聚焦显微镜检查。图像揭示了壶腹和黄斑毛细胞和神经结构的存在。该方案表明，可以从活体供体中收获完整、高质量的人类内耳组织，并可能为耳科疾病的研究提供重要工具。

活着的人类内耳由于位于颞骨致密的耳囊骨内，因此研究起来具有挑战性。因此，对人体内部组织的获取受到限制，研究人员主要依赖于死后组织采集。100 多年来，死后颞骨组织病理学 （TBH） 一直是了解人类耳科疾病的重要工具 ^1,2,3。TBH 的组织是通过死后收获颞骨、漫长（9-10 个月）的脱钙和组织制备过程，然后是苏木精和伊红染色来制备的。虽然 TBH 仍将是揭示有关健康和患病人类内耳新信息的重要工具，但漫长的死后时间和漫长而苛刻的组织处理方法限制了其在某些目的上的用途，因此需要辅助方法来研究人类内耳组织。高分辨率磁共振成像可以可视化内耳器官，但缺乏足够的分辨率来查看细胞或分子水平的结构 ^4,5。由于这些挑战，许多人类内耳疾病仍然知之甚少。

另一种方法是在手术过程中收集内耳组织。在迷路切除术或经迷路前庭神经鞘瘤切除术期间，有意牺牲内耳组织。在经迷路前庭神经鞘瘤切除术期间从患者身上采集的椭圆囊已用于表征前庭毛细胞形态 ^6,7,8 和研究毛细胞再生 ^9,10。最近，已经开发出使用经耳道方法从器官捐献者那里采集内耳器官的技术，该方法可用于通过加宽的椭圆形窗口切除椭圆囊和可能的其他前庭末器官，组织创伤最小^11,12。使用这种技术，已经可以表征人椭圆囊的单细胞转录组谱¹³。然而，这些技术在收获过程中会使内耳器官暴露在非生理条件下。具体来说，内耳器官可能会暴露在没有外淋巴液和浸没在生理盐水冲洗中，其离子组成与外淋巴液有很大不同。此外，即使手术显微镜的最大放大倍率，脱水的膜迷路也难以观察，这使得无创手术夹层具有挑战性。机械损伤可能会进一步损伤组织，我们的轶事经验表明，由于机械损伤和细胞变性，手术组织的免疫染色质量往往不足。需要新技术来无创伤地采集人类内耳组织用于生物学研究，这可能会阐明对人类内耳疾病知之甚少。在这里，我们描述了一种水下技术，用于在迷路切除术期间在更多生理条件下收集人类前庭终末器官，并使用免疫染色对其进行分析。

该协议是在约翰霍普金斯大学医学院 （IRB00203441） 机构审查委员会 （IRB） 的批准下制定的，并符合使用人体组织和潜在传染性材料的机构政策。在迷路切除术期间进行组织收集，这是顽固性 Ménière 病伴跌落发作的标准临床护理的一部分。

1. 迷路切除术和组织采集

1. 获得当地机构审查委员会 （IRB） 委员会的批准，审查使用人类和传染性材料的机构政策，并在使用本方案之前获得组织捐献的同意。在外科迷路切除术或经迷路入路进入内耳道期间进行组织采集，这是标准临床护理的一部分。
2. 让患者做好准备。
   1. 在麻醉诱导前，与麻醉团队讨论避免长效麻痹的方法，以便监测面神经。
   2. 诱导全身麻醉后，为患者插管并将手术台旋转 180°。放置面神经监测电极并确保术前预防性使用抗生素。
   3. 将 1% 利多卡因和 1：100,000 肾上腺素注射到外耳道和耳后区域。使用 betadine 以标准方式准备耳朵。
3. 使用 #15 刀片在耳后皱襞后 1 cm 处创建一个标准的（5-6 cm）耳后曲线切口。
4. 提起耳后软组织。
   1. 识别颞筋膜上部，并将耳后皮瓣向前抬高至耳道。
   2. 创建一个标准的 7 形骨膜切口，将骨膜向前抬高，直到确定 Henle 的脊柱和骨性耳道。放置自我训练牵开器。
5. 进行乳突切除术。
   1. 进行完全乳突切除术，识别上部的被盖，后方识别乙状窦，并向前稀释外耳道。
   2. 识别水平半规管和砧骨的短突。
      注意：不应将乳突放入碟形，以确保它仍然是能够容纳液体用于水下组织收集的容器。
6. 识别半规管 （SC）。
   1. 在手术显微镜（2-4 倍放大倍率）下，使用 3 毫米粗金刚石毛刺去除上 SC 外侧的迷路周围气室、弓下气室和后 SC 后面的迷路后气室，向上延伸到总管。
7. 浸没迷宫。
   1. 将乳突腔浸入平衡盐溶液 （BSS） 中，并使用带有晶状体清洁鞘冲洗系统的零度内窥镜观察迷路。
   2. 使用晶状体清洁鞘冲洗系统用 BSS 冲洗乳突腔，洗去血液并改善迷路的可视化。
8. 蓝线' SCs。
   1. 在乳突腔中保持足够的 BSS 水平并使用内窥镜进行可视化的同时，使用 3 毫米金刚石毛刺对所有三个半规管进行“蓝线”，方法是小心地钻掉耳囊骨，直到半规管在用内窥镜观察时显示为蓝色线。
   2. 使用冲洗系统用 BSS 溶液间歇性冲洗血液并实现充分的可视化，如图 1 所示。
9. 收获 SC 壶腹。
   1. 在 BSS 下，进入外侧半规管的圆顶并向前移动，直到确定其壶腹。进入上 SC 并沿着它向内侧靠近其壶腹，壶腹可以用上 SC 的壶腹收获。急剧切割外侧 SC 管以方便移除。
   2. 使用 Rosen 针将水平和上 SC 壶腹从嵴上抬起，并将传入纤维与上皮细胞和膜迷路分开。然后，移除这些结构。
   3. 横切后 SC 的圆顶，并沿着它向下和向前到其壶腹。同样，收获后 SC 壶腹并将所有组织置于冰上的 BSS 中。
10. 收获黄斑。
    1. 去除水平和后 SC 壶腹之间的骨头以暴露前庭。椭圆囊的膜壁会随着壶腹的切除而被撕裂。只要保持液平面，黄斑就会保持向前附着;抬高并移除它。
    2. 球囊位于球形凹槽内;急剧抬高并将其从凹槽中取出。同样，将组织样品置于冰上的 BSS 中。
11. 在收获后 1 小时内将冰上的组织样本从手术室运送到实验室进行固定。

2. 免疫组化和成像

1. 修复样本。
   1. 在室温 （RT） 下，将组织样品置于 4% 多聚甲醛 （PFA） 中的 1x 磷酸盐缓冲盐水 （1x PBS） 中，轻轻摇动或轨道摇动 （100 rpm） 1 小时。
      注：4% PFA 溶液（共 5 mL）：625 mL 32% PFA 储备溶液 + 500 mL 10xPBS + 3875 mL ddH₂O。
2. 将组织样品转移到 1x PBS 溶液中，并在室温下轻轻摇动或眼眶摇动冲洗 3x 15 分钟（或更长时间，如有必要）。
3. 在解剖显微镜下在 RT 下用 1x PBS 去除多余的结缔组织。
4. 对样品进行脱钙。
   1. 将组织样品转移到 1x PBS 溶液中的 5% 乙二胺四乙酸 （EDTA） 中，以清除感觉上皮细胞中的细小骨碎屑和耳石。在 RT 下孵育 15-30 分钟，轻轻摇动或眼眶摇动。
5. 同样，将组织样品转移到 1x PBS 溶液中，并在室温下轻轻摇动或眼眶摇动冲洗 3x 15 分钟（或更长时间，如有必要）。
6. 向每个样品中加入 125-200 mL 的 2x 封闭缓冲液 （2x BB），并在 RT 下孵育 1.5-5 小时或在 4 °C 下过夜 （ON）。 在恒定的轨道摇动下运行孵育。
   注：2x 封闭缓冲液 （2x BB）：1 g 牛血清白蛋白 （BSA） 溶于最多 5 mL 补充有 0.5% Triton X-100 的 1x PBS 中。BSA 用作非特异性抗原结合位点的封闭剂。
7. 使用一抗染色。
   1. 将 120-150 mL 溶解在 1x BB 中的一抗组合施加至所需稀释度。应用 1：200 稀释度 （2.5 μg/mL） 的兔抗肌苷-C 抗体、1：200 稀释度 （2.5 μg/mL） 的山羊抗肿瘤调节蛋白抗体、1：300 稀释度 （2.2 μg/mL） 的小鼠抗钙蛋白和 1：1000 稀释度 （1 μg/mL） 的 DAPI。然后，在轻轻的轨道摇动下将样品（覆盖）转移到 4 °C（冰箱或冷藏室）进行 ON 孵育。
      注意：1x BB：混合等体积的 2x BB 和 1x PBS，补充有 0.5% Triton X-100。
8. 在 1x PBS 溶液中冲洗组织样品，3x 15 分钟（或更长时间，如有必要），在 RT 下轻轻摇动。
9. 使用二抗染色。
   1. 应用 120-150 mL 荧光团偶联的二抗组合，溶于 1：2000 稀释度 （1 μg/mL） 的 1x BB 中。应用 488 nm 偶联的抗兔二抗、568 nm 抗小鼠二抗和 647 nm 抗山羊二抗。
   2. 然后，将样品（覆盖）在 RT 中轻轻摇动孵育 1.5-2 小时（或在 4 °C 下开启）。
10. 在 1x PBS 溶液中冲洗组织样品，3x 15 分钟（或更长时间，如有必要），在 RT 下轻轻摇动。
11. 进行显微解剖和安装。
    1. 在解剖显微镜下，从感觉前庭上皮细胞周围去除多余的组织和膜。使用 70% 乙醇清洁玻璃组织学载玻片表面，风干，然后滴入 55 mL 适当的封固剂。
    2. 将感觉组织样品转移到封固剂中。使用细镊子轻轻地定位样品，使毛束面朝上在封固剂中。
    3. 将适当尺寸的盖玻片轻轻放在含有样品的封固剂上，尽量限制气泡。确保盖玻片具有共聚焦显微镜所需的 #1.5 厚度等级。
    4. 将载玻片放在黑暗区域（例如，工作台抽屉）以让封固介质凝固。使用透明指甲油将盖玻片密封在载玻片上，并在黑暗区域干燥，然后再用共聚焦显微镜检查。之后，将密封的载玻片存放在 4° 的黑暗中（载玻片文件夹的载玻片盒）直至成像。
12. 使用放大倍率为 40 倍至 100 倍、488 nm 和 657 nm 通道的共聚焦显微镜对标本进行成像。

使用这种技术，以最小的创伤完整地收获了人椭圆囊以及外侧和上半规管壶腹（图 2）。如图 2 所示，壶腹可以用膜导管的大部分来收获。用抗 tenascin-C（细胞外基质蛋白）和抗肿瘤调节蛋白（小白蛋白家族的小钙结合蛋白）进行免疫荧光标记显示完整的 1 型前庭毛细胞（图 3）。毛细胞密度为每 10,000 μm⁸² 个。这些结果表明，该技术可用于收获人类内耳组织，对神经上皮的创伤最小。

图 1：手术设置图示。 手术设置图示：左侧乳突腔与外半规管、上半规管和后半规管一起显示。将乳突腔浸没在平衡盐溶液中，使用零度内窥镜观察乳突腔，同时使用金刚石钻头打开迷宫。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：膜迷宫。 在 5 倍放大倍率的光学立体显微镜下收获的 （A） 人椭圆囊和外侧囊和 （B） 上管壶腹。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：椭圆囊。 用共聚焦显微镜以 40 倍放大倍率拍摄人椭圆囊免疫荧光标记的最大强度投影。花萼突触裂用抗 tenascin-C 抗体（绿色）标记。1 型前庭细胞用抗肿瘤调节蛋白（红色）染色。比例尺：50 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

本文介绍了一种使用内窥镜在 BSS 中水下采集前庭末器官并使用免疫荧光成像进行分析的新技术。在这里，我们展示了收获具有完整前庭毛细胞和足够组织质量的完整前庭终末器官以成功进行免疫标记。我们标本中的毛细胞密度与在其他研究中从活体器官供体获得的毛细胞密度相似¹³。据我们所知，这是用于前庭终末器官采集的水下技术的第一篇报道，该技术可以维持近乎生理条件。这是对水下技术的一种改编，用于高级半规管裂开修复，使用 BSS 来维持生理条件，同时打开迷宫进行堵塞^14,15。

这项工作扩展了以前开发的技术，用于在迷路切除术或前庭神经鞘瘤切除术中收获前庭器官 ^6,7,8 和活体器官供体^11,12。水下技术很容易适应前庭神经鞘瘤切除术，在前庭神经鞘瘤切除术中，迷路在乳突切除术后类似地打开。从活体器官捐献者那里采集前庭末梢器官是在有限的基础上通过经耳道方法进行的¹²。这种经耳道入路依赖于在前庭终末器官收获之前去除鼓膜和听小骨并加宽椭圆窗。从活体器官捐献者那里采集组织需要与移植手术团队同时在与患者床头的麻醉共享的有限空间内工作。这里介绍的技术不太可能适应活体器官捐献期间前庭末器官收获的时间和空间限制。然而，这种技术的优势在于可以轻松暴露和收获半规管的壶腹，这很难通过椭圆形窗口进行。

对人类内耳组织的研究对于阐明内耳疾病的病理生理学至关重要，其中许多疾病仍然是特发性的。例如，梅尼埃病在耳科诊所很常见，但其病因仍然未知，也没有经过验证的治疗方案^16,17。空间转录组学和免疫荧光成像等技术为揭示内耳疾病提供了一个令人兴奋的机会，到目前为止，这些技术仅在有限的基础上得到利用。收集保存的内耳器官的方法为使用更新的分子技术提供了机会，并可能为标准 TBH 提供有用的辅助手段。虽然这里描述的方法仅用于免疫荧光染色，但我们相信这种组织对于空间转录组学来说具有足够的质量。

该方案的主要局限性是它依赖于现成的手术材料。迷路切除术目前是一种不常使用的梅尼埃病治疗方法，即使是繁忙的转诊中心也可能每年只进行几次此类手术。经迷路前庭神经鞘瘤切除术更频繁;但是，这种技术可能会为已经很漫长的程序增加时间。我们估计，浸没乳突腔和在水下打开根管会使手术增加大约 30 分钟。此外，尚未进行并排分析，将使用该技术获得的组织质量与迷路切除术或前庭神经鞘瘤切除术期间的标准前庭器官收获进行比较，因为不可能使用从一个供体收获的组织进行此类分析。需要进一步的研究来确定器官收获期间的条件对显微镜和其他技术的组织质量的影响。

总之，我们描述了一种在迷路切除术期间水下收集前庭末末器官的新技术，以及它产生具有保留的前庭毛细胞和神经接触的高质量组织样本的能力。该技术允许在尽可能接近正常生理条件的环境中采集组织，并可能为研究人类内耳提供有用的工具。

作者没有什么可披露的。

我们感谢 Mohamed Lehar 对该项目的帮助。这项工作得到了美国国家耳聋和其他沟通障碍研究所 （U24DC020850） 的支持。