Uma adaptação barata de um reator de micro-ondas comercial para síntese de peptídeos em fase sólida

Um aparelho simples, barato e novo para realizar sínteses de peptídeos em fase sólida em um reator de micro-ondas comercial é apresentado.

Um aparelho caseiro para realizar a síntese de peptídeos em fase sólida (SPPS), auxiliado por irradiação e aquecimento por micro-ondas, é apresentado. Em contraste com os vasos de reação SPPS convencionais, que drenam solventes e subprodutos por meio de uma frita localizada no fundo do recipiente, o aparelho apresentado emprega um tubo de dispersão gasosa sob vácuo para remover solventes, subprodutos e reagentes em excesso. O mesmo tubo de dispersão de gás fornece agitação de gás nitrogênio dos grânulos SPPS durante as etapas de reação de acoplamento e desproteção. O aquecimento por microondas é benéfico para acoplamentos SPPS de resíduos estericamente impedidos, como o ácido alfa-aminoisobutírico (Aib), um resíduo de aminoácido alfa, alfa-dialquilado. Este aparelho caseiro tem sido usado para preparar, por meio de métodos manuais de Fmoc SPPS, peptídeos heptâmeros e octaméricos dominados pelo resíduo de Aib, que é notoriamente difícil de acoplar em condições padrão de temperatura ambiente e reagentes. Além disso, os reatores SPPS de micro-ondas comerciais típicos são dedicados exclusivamente à síntese de SPPS, tornando-os inacessíveis a usuários não SPPS. Em contraste, o aparelho apresentado preserva a versatilidade do reator de micro-ondas para aceleração convencional de reações químicas em micro-ondas, pois o aparelho é trivialmente removido do reator de micro-ondas comercial.

A introdução de Merrifield da síntese de peptídeos em fase sólida SPPS na década de 1960 revolucionou as sínteses peptídicas e químicas e foi justamente recompensada com o Prêmio Nobel de Química ^1,2. Nas décadas subsequentes, muitos pesquisadores refinaram as técnicas originais de Merrifield, levando a duas alternativas que dominam as práticas de SPPS: à base de fluorenilmetoxicarbonila (FMOC) versus à base de terc-butil oxicarbonila (BOC)³. A clivagem final do peptídeo da resina sólida em FMOC requer um coquetel contendo ácido trifluoracético, em comparação com HF para técnicas de BOC, tornando os métodos baseados em FMOC a escolha preferida de muitos laboratórios.

Os métodos SPPS de última geração são ocasionalmente desafiados pelas sequências desejadas. Nos últimos anos, houve avanços superando algumas preocupações idiossincráticas de agregação⁴, formação de dicetopiperazina⁵ e resíduos de aminoácidos N-metilados ⁶. Em um esforço para otimizar o rendimento do acoplamento, milhares de reagentes e aditivos de acoplamento foram explorados⁷. Especificamente, a ativação do ácido carboxílico via COMU ^8,9 ou fluoretos ácidos 10,11,12, juntamente com aditivos como Oxyma ¹³ e hidroxibenzotriazol (HOBt), foram desenvolvidos para acoplamentos particularmente desafiadores, como aqueles que envolvem resíduos α,α-dialquilados.

Outros métodos não baseados em reagentes têm sido empregados para aumentar o rendimento de acoplamentos difíceis, incluindo tempos de reação estendidos, "acoplamento duplo" e aquecimento, especialmente aquecimento por micro-ondas 14,15,16. De fato, os sintetizadores de peptídeos automatizados disponíveis comercialmente que empregam aquecimento por micro-ondas estão entre as unidades de maior sucesso comercial do mercado, pois aceleram as taxas de reação, parecem melhorar a pureza final dos peptídeos e minimizar o desperdício de solvente. Infelizmente, essas unidades podem ser caras, custando mais de US$ 100.000 em alguns casos.

Nosso laboratório tem interesse na preparação de variações de peptídeos contendo o resíduo fortemente helicogênico de ácido alfa-aminoisobutírico (Aib)17,18,19. Devido ao impedimento estérico decorrente da dialquilação de seu carbono alfa, o Aib é notoriamente difícil de acoplar. Os métodos mencionados acima (fluoretos ácidos, aquecimento por microondas²⁰), bem como a química inteligente do "dipeptídeo" SPPS²¹, foram usados para adaptar o SPPS aos desafios de acoplamento de Aib. A preparação de dímeros de Aib sem resina, embora melhore o rendimento geral, requer química úmida adicional e temperaturas elevadas (50 ° C) ²¹ . Além disso, evitamos empregar fluoretos ácidos de Aib devido à natureza tóxica dos agentes fluorantes. Infelizmente, nosso laboratório não possui um sintetizador SPPS automatizado baseado em micro-ondas dedicado, com vasos de reação dedicados para a drenagem necessária dos subprodutos do SPPS. No entanto, um relatório recente do grupo de Clayden mostrando um sucesso espetacular na preparação de oligômeros baseados em Aib usando SPPS e irradiação de micro-ondas²² nos estimulou a adaptar a unidade de micro-ondas CEM Discover SP de nosso laboratório para sínteses de SPPS.

Primeiro, investigamos o acessório comercialmente disponível da CEM para converter o reator de micro-ondas em uma unidade manual de micro-ondas²³. Além do custo, este acessório exigiria o compromisso de nossa unidade de micro-ondas apenas com SPPS manual. Outros usuários de laboratório não teriam mais acesso aos excelentes recursos da unidade de micro-ondas. Portanto, a implementação do acessório comercial foi considerada inaceitável em nosso caso.

Em vez disso, montamos, por meio de componentes comparativamente baratos, um aparelho para realizar SPPS assistido por micro-ondas na escala milimolar. O protocolo abaixo descreve o uso de componentes simples e comparativamente baratos para efetuar SPPS manual assistido por micro-ondas.

1. Monte o aparelho (Figura 1)

NOTA: Todos os componentes para montagem do aparelho encontram-se na Tabela de Materiais.

1. Monte a saída de vácuo.
   1. Conecte 2" de tubo de Teflon de 1/8" ao lado direito do "T" (Figura 1, Parte rotulada como "1") feito de etileno tetrafluoretileno (ETFE).
   2. Conecte o tubo de Teflon de 1/8" a uma válvula (Figura 1, Parte rotulada como "2") feita de ETFE.
   3. Conecte 100 cm de tubo de Teflon ao outro lado da válvula (Figura 1, Parte rotulada como "2").
   4. Insira este tubo através da abertura de 1/8" de uma rolha de borracha e use esta rolha para tampar um frasco Erlenmeyer armado lateralmente (Figura 1A, Parte rotulada como "8") conectado ao vácuo (casa ou bomba modesta).
2. Monte a entrada de gás nitrogênio.
   1. Conecte 2" de tubo de Teflon de 1/8" ao lado esquerdo do ETFE "Tee" (Figura 1, Parte rotulada como "1").
   2. Conecte o tubo de Teflon de 1/8" a uma válvula ETFE (Figura 1, Parte rotulada como "3").
   3. Conecte 100 cm de tubo de Teflon de 1/8" ao outro lado da válvula EFTE (Figura 1, Parte rotulada como "3").
   4. Passe a extremidade do tubo de Teflon de 1/8" através de uma rolha de borracha e use esta rolha para conectar a um tubo tygon conectado a um cilindro de nitrogênio equipado com um regulador (Figura 1A, Parte rotulada como "7").
   5. Com a válvula de agulha do regulador fechada, use a válvula de diafragma do regulador (Figura 1A, Parte rotulada como "7"). para atingir uma pressão de 5-10 psi.
3. Monte o aspirador/borbulhador.
   1. Conecte a haste do "T" (Figura 1, Parte rotulada como "1") a um comprimento de 100 cm de tubo de Teflon de 1/8" OD.
   2. Insira este tubo através de um micro-septo (Figura 1, Parte rotulada como "6") previamente perfurado com uma agulha.
   3. Insira a tubulação totalmente em um tubo de dispersão de gás. Use o microsepto para formar uma vedação entre o tubo de dispersão de gás (Figura 1, Parte rotulada como "4") e o tubo de Teflon.
   4. Insira o tubo de dispersão de gás no vaso de reação do tubo de ensaio (Figura 1, Parte rotulada como "5")., e coloque o tubo de ensaio em seu suporte (Ilustrado na Figura 1B), que é externo ao reator de microondas.
      NOTA: Durante as reações químicas, o tubo de ensaio será inserido no reator de micro-ondas. Durante a adição de soluções de reação e lavagens com solvente, o tubo de ensaio é mantido externamente ao reator de micro-ondas.
4. Conecte o atenuador de vaso aberto ao reator de micro-ondas. O aparelho deve agora estar pronto para uso.

2. Prepare reagentes

1. Preparar soluções de aminoácidos FMOC. Para escala de 0,100 mmol, prepare 0,2 M FMOC-AA-OH em DMF. Cada ciclo de acoplamento usará 2,5 mL das soluções de aminoácidos.
2. Preparar o reagente de acoplamento diisopropilcarbodiimida (DIC). Prepare 1,0 M DIC em DMF. Cada acoplamento utilizará 1,0 mL de solução DIC.
3. Prepare a solução aditiva Oxyma Pure. Prepare oxima 0,5 M em DMF. Cada acoplamento utilizará 1,0 mL de solução de oxima.
4. Prepare a solução de desproteção. Prepare a solução de morfolina/DMF a 20% v/v. Cada corrida de desproteção requer 7 mL de solução. Execute duas execuções de desproteção para cada desproteção de fmoc.

3. Preparação da resina peptídica

1. Meça a massa apropriada de resina SPPS Wang, malha 100-200, poliestireno reticulado com 1% de divinilbenzeno e coloque a resina seca no vaso de reação do tubo de ensaio. Por exemplo, para uma síntese em escala de 0,100 mmol, uma resina com carga de 0,500 mmol ^g-1 exigiria 200 mg de resina.
2. Adicione 3 mL de solvente DMF à resina e inche a resina à temperatura ambiente por 15 min. Para esta etapa, certifique-se de que o suprimento de gás nitrogênio esteja "ligado/aberto" para agitação e que a válvula de vácuo (Figura 1, rotulada como "2") esteja "desligada/fechada". Use a válvula de agulha do suprimento de nitrogênio (Figura 1A, rotulada 7) para obter um borbulhamento suave dentro da solução.
   NOTA: Esta configuração deve ser apropriada para todas as agitações posteriores do gás nitrogênio.
3. Após 15 min de inchaço da resina, aspire o solvente DMF sob vácuo: feche a válvula N₂ (Figura 1, rotulada como "3"). Abra a válvula para vácuo (Figura 1, rotulada como "2") e aspire o solvente DMF. Quando o solvente estiver quase removido, abra a válvula N₂ (Figura 1, rotulada como "3").
4. Repita as etapas 3.2 e 3.3 2 vezes para inchar totalmente a resina.

4. Remoção de FMOC

NOTA: As resinas estão disponíveis pré-carregadas com uma variedade de aminoácidos protegidos por FMOC pré-carregados como resíduos C-terminal. Portanto, a remoção do FMOC geralmente é o primeiro passo após o inchaço da resina.

1. Com o vaso de reação do tubo de ensaio externo ao reator de micro-ondas e a válvula de vácuo (Figura 1, rotulada como "2") fechada, adicione 7 mL de 20% de piperidina/DMF ou 20% de morfolina/DMF diretamente no tubo de ensaio.
2. Ligue a válvula de nitrogênio (Figura 1, rotulada como "3") para agitar os grânulos.
   NOTA: As resinas SPPS estão disponíveis pré-carregadas com o resíduo C-terminal, protegidas por FMOC.
3. Insira o tubo de ensaio contendo os grânulos no reator de micro-ondas através do atenuador de "vaso aberto" (Figura 1B, porta metálica do reator).
4. Aqueça a 90 °C por 2 min usando o micro-ondas no modo dinâmico: defina a meta de temperatura para 90 °C, potência de 50 W, tempo de espera = 2.0 min (consulte o Supplemental File 1 para obter um relatório sobre a desproteção dentro do micro-ondas). Monitore a temperatura através do sensor infravermelho do micro-ondas; O micro-ondas reduzirá a potência para manter a temperatura de reação.
5. Remova o tubo de ensaio que contém as esferas do reator de micro-ondas.
6. Aspire a solução de DMF e os subprodutos da reação sob vácuo: feche a válvula N₂ (Figura 1, rotulada como "3"). Abra a válvula para vácuo (Figura 1, identificada como "2"). Quando a solução estiver quase removida, abra a válvula N₂ (Figura 1, identificada como "3").
7. Feche a válvula de vácuo (Figura 1, identificada como "2"). Adicione 3 mL de DMF para enxaguar o tubo de ensaio e o tubo de dispersão de gás.
8. Aspirar lavagem com solvente DMF sob vácuo: feche a válvula N₂ (Figura 1, rotulada como "3"). Abra a válvula para vácuo (Figura 1, identificada como "2"). Quando a solução estiver quase removida, abra a válvula N₂ (Figura 1, identificada como "3").
9. Repita as etapas 4.7 e 4.8 duas vezes, para um total de três lavagens com solvente DMF.
10. Repita as etapas de remoção do FMOC 4.1-4.9 para um total de duas etapas sucessivas de desproteção.

5. Acoplamento de aminoácidos FMOC

1. Coloque o recipiente de reação do tubo de ensaio em seu suporte externo ao reator de micro-ondas.
2. Adicione manualmente 2,5 mL de aminoácido FMOC 0,2 M (5x excesso molar), 1,0 mL de solução de agente de acoplamento DIC 1,0 M (10x excesso molar) e 1,0 mL de solução aditiva de oxima 0,5 M (5x excesso molar) à resina no tubo de ensaio.
3. Abra a válvula de nitrogênio (Figura 1, rotulada como "3") para obter a agitação dos grânulos.
4. Insira o tubo de ensaio contendo os grânulos no reator de micro-ondas através do atenuador de vaso aberto (Figura 1B, porta metálica do reator). Aquecer a solução a 100 °C durante 10 min. Usando o micro-ondas no modo dinâmico, defina a meta de temperatura para 100 °C, potência de 60 W, tempo de espera = 10.0 min (consulte o Supplemental File 1 para obter um relatório sobre o acoplamento dentro do micro-ondas). Monitore a temperatura através do sensor infravermelho do micro-ondas; O micro-ondas reduzirá a potência para manter a temperatura de reação.
5. Remova o tubo de ensaio que contém as esferas do reator de micro-ondas.
6. Aspire o solvente DMF e os subprodutos da reação sob vácuo: feche a válvula N₂ (Figura 1, rotulada como "3"). Abra a válvula para vácuo (Figura 1, identificada como "2"). Quando a solução estiver quase removida, abra a válvula N₂ (Figura 1, identificada como "3").
7. Feche a válvula de vácuo (Figura 1, identificada como "2"). Adicione 3 mL de DMF para enxaguar o tubo de ensaio e o tubo de dispersão de gás.
8. Aspirar lavagem com solvente DMF sob vácuo: feche a válvula N₂ (Figura 1, rotulada como "3"). Abra a válvula para vácuo (Figura 1, identificada como "2"). Quando a solução estiver quase removida, abra a válvula N₂ (Figura 1, identificada como "3").
9. Repita as etapas 5.7 e 5.8 2 vezes para um total de três lavagens com solvente DMF.

6. Repita os ciclos de peptídeos SPPS

1. Repita todas as etapas nas seções 4 (Remoção de FMOC) e 5 (Acoplamento de aminoácidos FMOC) até obter um peptídeo da sequência desejada.
   NOTA: Certifique-se de adicionar soluções de reagentes fora do reator de micro-ondas, à temperatura ambiente, diretamente no recipiente de reação do tubo de ensaio. Certifique-se também de que a agitação do nitrogênio seja iniciada antes de colocar o tubo de ensaio no reator de micro-ondas.

7. Clivagem peptídica

1. Transfira a resina para uma seringa de plástico frita.
2. Prepare um coquetel de clivagem de ácido trifluoroacético (TFA) a 95%, 2,5% de água e 2,5% de triisopropil silano (TIPS) a um volume de 1 mL / 100 mg de resina.
3. Corte o peptídeo por 2 h em temperatura ambiente com agitação contínua ou ocasional.
4. Precipite o produto peptídico em 10 mL de éter dietílico gelado.
5. Ressuspenda o pellet em uma quantidade mínima de MeCN / 0,1% de TFA aquoso e liofilize durante a noite.

Exemplos de sequências de peptídeos preparadas com nosso aparelho são mostrados na Figura 2 e na Figura 3. A Tabela 1 resume as soluções, parâmetros de micro-ondas e lavagens que empregamos. A confirmação da espectrometria de massa MALDI-TOF é mostrada nas figuras. A recuperação em massa desses peptídeos tem sido superior a 80%. Significativamente, todas essas sequências têm múltiplos acoplamentos...

O aparelho apresentado aqui invoca um método simples, novo e barato para remover solventes, excesso de reagentes e resíduos, bem como adicionar agitação de gás nitrogênio, durante SPPS assistido por micro-ondas. Em contraste com os vasos SPPS convencionais, que invocam uma frita no fundo do vaso, o aparelho apresentado invoca um tubo de dispersão de gás sob vácuo para aspirar o vaso. O vaso de reação é, portanto, um tubo de ensaio comum, que é aquecido no local recomendado p...

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Os autores agradecem o apoio das bolsas INSPIRE da Fairfield University, o apoio do Departamento de Química e Bioquímica da Fairfield University e a assistência da Dra. Dorothy Szobcynski por sua experiência no gerenciamento do laboratório. Além disso, os autores agradecem aos professores Jillian Smith-Carpenter e Aaron Van Dyke pelas discussões sobre peptídeos e síntese orgânica. Os autores agradecem o apoio do Fundo de Publicação da Faculdade de Artes e Ciências da Fairfield University.