Une adaptation peu coûteuse d’un réacteur à micro-ondes commercial pour la synthèse de peptides en phase solide

Un appareil simple, peu coûteux et novateur pour effectuer des synthèses de peptides en phase solide dans un réacteur à micro-ondes commercial est présenté.

Un appareil de fabrication artisanale pour effectuer la synthèse de peptides en phase solide (SPPS), assistée par irradiation et chauffage par micro-ondes, est présenté. Contrairement aux cuves de réaction SPPS conventionnelles, qui drainent les solvants et les sous-produits via une fritte située au fond de la cuve, l’appareil présenté utilise un tube de dispersion de gaz sous vide pour éliminer les solvants, les sous-produits et les réactifs en excès. Le même tube de dispersion de gaz fournit l’agitation gazeuse d’azote des billes SPPS pendant les étapes de réaction de couplage et de déprotection. Le chauffage par micro-ondes est bénéfique pour les couplages SPPS de résidus stériquement entravés, tels que l’acide alpha-aminoisobutyrique (Aib), un résidu d’acide aminé alpha,alpha-dialkylé. Cet appareil de fabrication artisanale a été utilisé pour préparer, via des méthodes manuelles Fmoc SPPS, des peptides heptamériques et octamériques dominés par le résidu Aib, qui est notoirement difficile à coupler dans des conditions standard de température ambiante et des réactifs. De plus, les réacteurs commerciaux SPPS à micro-ondes sont dédiés exclusivement à la synthèse SPPS, ce qui les rend inaccessibles aux utilisateurs non SPPS. En revanche, l’appareil présenté préserve la polyvalence du réacteur à micro-ondes pour l’accélération conventionnelle des réactions chimiques par micro-ondes, car l’appareil est trivialement retiré du réacteur à micro-ondes commercial.

L’introduction par Merrifield de la synthèse peptidique en phase solide SPPS dans les années 1960 a révolutionné les synthèses peptidiques et chimiques et a été récompensée à juste titre par un prix Nobel de chimie ^1,2. Au cours des décennies suivantes, de nombreux chercheurs ont affiné les techniques originales de Merrifield, ce qui a conduit à deux alternatives qui dominent les pratiques SPPS : à base de fluorénylméthoxycarbonyle (FMOC) par rapport à base de tert-butyl oxycarbonyle (BOC)³. Le clivage final du peptide à partir de la résine solide dans le FMOC nécessite un cocktail contenant de l’acide trifluoracétique, par rapport à l’HF pour les techniques BOC, ce qui fait des méthodes basées sur le FMOC le choix préféré de nombreux laboratoires.

Les méthodes SPPS de pointe sont parfois mises à l’épreuve par les séquences souhaitées. Au cours des dernières années, des progrès ont été réalisés pour surmonter certaines préoccupations idiosyncrasiques concernant l’agrégation⁴, la formation de dicétopipérazine⁵ et les résidus d’acides aminés N-méthylés ⁶. Dans le but d’optimiser le rendement du couplage, des milliers de réactifs et d’additifs de couplage ont été explorés⁷. Plus précisément, l’activation de l’acide carboxylique via COMU ^8,9 ou les fluorures acides 10,11,12, ainsi que des additifs tels que l’Oxyma¹³ et l’hydroxybenzotriazole (HOBt), ont été développées pour des couplages particulièrement difficiles tels que ceux impliquant des résidus α,α-dialkylés.

D’autres méthodes non basées sur des réactifs ont été employées pour augmenter les rendements des couplages difficiles, notamment les temps de réaction prolongés, le « double couplage » et le chauffage, en particulier le chauffage par micro-ondes 14,15,16. En effet, les synthétiseurs de peptides automatisés disponibles dans le commerce utilisant le chauffage par micro-ondes sont parmi les unités les plus réussies sur le marché car ils accélèrent les taux de réaction, semblent améliorer la pureté finale des peptides et minimisent les déchets de solvants. Malheureusement, ces unités peuvent être coûteuses, coûtant plus de 100 000 $ dans certains cas.

Notre laboratoire s’intéresse à la préparation de variations de peptides contenant le résidu fortement hélicogénique de l’acide alpha-aminoisobutryique (Aib)17,18,19. En raison de l’obstacle stérique résultant de la dialkylation de son carbone alpha, Aib est notoirement difficile à coupler. Les méthodes mentionnées ci-dessus (fluorures acides, chauffage par micro-ondes²⁰), ainsi que la chimie intelligente des « dipeptides » SPPS²¹, ont été utilisées pour adapter SPPS aux défis de couplage d’Aib. La préparation à l’élimination de la résine des dimères Aib, tout en améliorant le rendement global, nécessite une chimie humide supplémentaire et des températures élevées (50 °C)²¹. De plus, nous avons évité d’utiliser des fluorures acides d’Aib en raison de la nature toxique des agents fluorants. Malheureusement, notre laboratoire ne dispose pas d’un synthétiseur SPPS automatisé dédié aux micro-ondes, avec des récipients de réaction dédiés pour le drainage nécessaire des sous-produits SPPS. Néanmoins, un rapport récent du groupe de Clayden montrant un succès spectaculaire dans la préparation d’oligomères à base d’Aib à l’aide de SPPS et de l’irradiation par micro-ondes²² nous a incités à adapter l’unité de micro-ondes CEM Discover SP de notre laboratoire pour les synthèses SPPS.

Nous avons d’abord étudié l’accessoire disponible dans le commerce de CEM pour convertir le réacteur à micro-ondes en une unité manuelle SPPS/micro-ondes²³. Outre le coût, cet accessoire nécessiterait l’engagement de notre unité à micro-ondes à ne faire que des SPPS manuels. D’autres utilisateurs de laboratoire n’auraient plus accès aux excellentes capacités de l’unité micro-ondes. Par conséquent, la mise en œuvre de l’accessoire commercial a été jugée inacceptable dans notre cas.

Au lieu de cela, nous avons assemblé, à l’aide de composants relativement peu coûteux, un appareil pour effectuer des SPPS assistés par micro-ondes à l’échelle millimolaire. Le protocole ci-dessous décrit l’utilisation de composants simples et relativement peu coûteux pour effectuer des SPPS manuels assistés par micro-ondes.

1. Assemblez l’appareil (Figure 1)

REMARQUE : Tous les composants pour l’assemblage de l’appareil se trouvent dans la table des matériaux.

1. Assemblez la sortie de l’aspirateur.
   1. Connectez un tube en téflon de 2 po de 1/8 po sur le côté droit du « Té » (Figure 1, pièce étiquetée « 1 ») en éthylène tétrafluoroéthylène (ETFE).
   2. Connectez le tube en téflon 1/8 » à une valve (Figure 1, pièce étiquetée « 2 ») en ETFE.
   3. Fixez 100 cm de tube en téflon de l’autre côté de la vanne (Figure 1, pièce étiquetée « 2 »).
   4. Insérez ce tube dans l’ouverture de 1/8 » d’un bouchon en caoutchouc et utilisez ce bouchon pour boucher un erlenmeyer à bras latéral (figure 1A, pièce étiquetée « 8 ») connecté à l’aspirateur (maison ou pompe modeste).
2. Assemblez l’entrée d’azote gazeux.
   1. Connectez un tube en téflon de 2 po de 1/8 po sur le côté gauche du « Té » en ETFE (Figure 1, pièce étiquetée « 1 »).
   2. Connectez le tube en téflon 1/8 » à une vanne ETFE (Figure 1, pièce étiquetée « 3 »).
   3. Fixez 100 cm de tube en téflon de 1/8 po de l’autre côté de la vanne EFTE (Figure 1, pièce étiquetée « 3 »).
   4. Enfilez l’extrémité du tube en téflon de 1/8 po dans un bouchon en caoutchouc et utilisez ce bouchon pour le connecter à un tube en tygon fixé à une bouteille d’azote équipée d’un régulateur (figure 1A, pièce étiquetée « 7 »).
   5. Avec le robinet à pointeau du régulateur fermé, utilisez le robinet à membrane du régulateur (Figure 1A, pièce étiquetée « 7 »). pour atteindre une pression de 5 à 10 psi.
3. Assemblez l’aspirateur/bulleur.
   1. Connectez la tige du « Té » (Figure 1, pièce étiquetée « 1 ») à un tube en téflon de 1/8 po de diamètre extérieur de 100 cm.
   2. Insérez ce tube à travers un micro-septum (figure 1, partie étiquetée « 6 ») préalablement percé avec une aiguille.
   3. Insérez le tube à fond dans un tube de dispersion de gaz. Utilisez le micro-septum pour former un joint entre le tube de dispersion de gaz (Figure 1, pièce étiquetée « 4 ») et le tube en téflon.
   4. Insérez le tube à dispersion de gaz dans le récipient de réaction du tube à essai (Figure 1, pièce étiquetée « 5 »)., et placez le tube à essai dans son support (illustré sur la Figure 1B), qui est externe au réacteur à micro-ondes.
      REMARQUE : Pendant les réactions chimiques, le tube à essai sera inséré dans le réacteur à micro-ondes. Lors de l’ajout de solutions réactionnelles et de lavages de solvants, le tube à essai est maintenu à l’extérieur du réacteur à micro-ondes.
4. Fixez l’atténuateur à cuve ouverte au réacteur à micro-ondes. L’appareil devrait maintenant être prêt à l’emploi.

2. Préparez les réactifs

1. Préparez des solutions d’acides aminés FMOC. Pour une échelle de 0,100 mmol, préparez 0,2 M FMOC-AA-OH dans DMF. Chaque cycle de couplage utilisera 2,5 mL de solutions d’acides aminés.
2. Préparez le réactif de couplage au diisopropylcarbodiimide (DIC). Préparez une DIC de 1,0 m dans du DMF. Chaque accouplement utilisera 1,0 mL de solution de CID.
3. Préparez la solution d’additif Oxyma Pure. Préparez 0,5 M d’oxyme dans du DMF. Chaque accouplement utilisera 1,0 mL de solution d’oxyme.
4. Préparez une solution de déprotection. Préparez une solution de morpholine/DMF à 20 % v/v. Chaque cycle de déprotection nécessite 7 mL de solution. Effectuez deux exécutions de déprotection pour chaque déprotection de fmoc.

3. Préparation de la résine peptidique

1. Mesurez la masse appropriée de résine SPPS Wang, de 100 à 200 mailles, de polystyrène réticulé avec 1 % de divinylbenzène, et placez la résine sèche dans la cuve de réaction du tube à essai. Par exemple, pour une synthèse à l’échelle de 0,100 mmol, une résine avec une charge de 0,500 mmol ^g-1 nécessiterait 200 mg de résine.
2. Ajouter 3 mL de solvant DMF à la résine et faire gonfler la résine à température ambiante pendant 15 min. Pour cette étape, assurez-vous que l’alimentation en azote gazeux est « marche/ouverte » pour l’agitation, et que la soupape de dépression (Figure 1, étiquetée « 2 ») est « arrêt/fermée ». Utilisez la soupape à pointeau de l’alimentation en azote (figure 1A, étiquetée 7) pour obtenir un léger bouillonnement dans la solution.
   REMARQUE : Ce réglage doit être approprié pour toute agitation supplémentaire par l’azote gazeux.
3. Après 15 min de gonflement de la résine, aspirez le solvant DMF sous vide : fermez la vanne N₂ (Figure 1, étiquetée « 3 »). Ouvrez la vanne de vide (Figure 1, étiquetée « 2 ») et aspirez le solvant DMF. Lorsque le solvant est presque éliminé, ouvrez la vanne N₂ (Figure 1, étiquetée « 3 »).
4. Répétez les étapes 3.2 et 3.3 2 fois pour gonfler complètement la résine.

4. Retrait des FMOC

REMARQUE : Les résines sont disponibles préchargées avec une variété d’acides aminés protégés par FMOC préchargés en tant que résidus C-terminaux. Par conséquent, l’élimination des FMOC est généralement la première étape après le gonflement de la résine.

1. Lorsque la cuve de réaction du tube à essai est à l’extérieur du réacteur à micro-ondes et que la soupape à vide (figure 1, étiquetée « 2 ») est fermée, ajoutez 7 mL de pipéridine/DMF à 20 % ou de morpholine/DMF à 20 % directement dans le tube à essai.
2. Ouvrez la vanne d’azote (Figure 1, étiquetée « 3 ») pour agiter les billes.
   REMARQUE : Les résines SPPS sont disponibles préchargées avec le résidu C-terminal, protégées par FMOC.
3. Insérez le tube à essai contenant les billes dans le réacteur à micro-ondes à l’aide de l’atténuateur à « cuve ouverte » (figure 1B, port métallique du réacteur).
4. Chauffer à 90 °C pendant 2 min à l’aide du micro-ondes en mode dynamique : régler la température cible à 90 °C, puissance de 50 W, temps de maintien = 2,0 min (voir le fichier supplémentaire 1 pour un rapport sur la déprotection au micro-ondes). Surveiller la température via le capteur infrarouge du micro-ondes ; Le micro-ondes réduira la puissance pour maintenir la température de réaction.
5. Retirez le tube à essai contenant les billes du réacteur à micro-ondes.
6. Aspirer la solution de DMF et les sous-produits de réaction sous vide : fermer la vanne N₂ (Figure 1, étiquetée « 3 »). Ouvrez la vanne pour le vide (Figure 1, étiquetée « 2 »). Lorsque la solution est presque éliminée, ouvrez la vanne N₂ (Figure 1, étiquetée « 3 »).
7. Fermez la soupape de dépression (Figure 1, étiquetée « 2 »). Ajouter 3 ml de DMF pour rincer le tube à essai et le tube à dispersion de gaz.
8. Aspirer le DMF sous vide : fermer la vanne N₂ (Figure 1, étiquetée « 3 »). Ouvrez la vanne pour le vide (Figure 1, étiquetée « 2 »). Lorsque la solution est presque éliminée, ouvrez la vanne N₂ (Figure 1, étiquetée « 3 »).
9. Répétez les étapes 4.7 et 4.8 deux fois, pour un total de trois lavages avec le solvant DMF.
10. Répétez les étapes de retrait du FMOC 4.1 à 4.9 pour un total de deux étapes de déprotection successives.

5. Couplage des acides aminés FMOC

1. Placez le récipient de réaction du tube à essai dans son support externe au réacteur à micro-ondes.
2. Ajoutez manuellement 2,5 ml d’acide aminé FMOC 0,2 M (excès molaire 5x), 1,0 ml de solution d’agent de couplage DIC 1,0 M (excès molaire 10x) et 1,0 ml de solution additif oxymaire 0,5 M (excès molaire 5x) à la résine du tube à essai.
3. Ouvrez la vanne d’azote (Figure 1, étiquetée « 3 ») pour obtenir l’agitation des billes.
4. Insérez le tube à essai contenant les billes dans le réacteur à micro-ondes à l’aide de l’atténuateur à cuve ouverte (Figure 1B, orifice métallique du réacteur). Chauffer la solution à 100 °C pendant 10 min. À l’aide du four à micro-ondes en mode dynamique, réglez la température cible à 100 °C, puissance de 60 W, temps de maintien = 10,0 min (voir le fichier supplémentaire 1 pour un rapport sur le couplage au sein du micro-ondes). Surveiller la température via le capteur infrarouge du micro-ondes ; Le micro-ondes réduira la puissance pour maintenir la température de réaction.
5. Retirez le tube à essai contenant les billes du réacteur à micro-ondes.
6. Aspirer le solvant DMF et les sous-produits de réaction sous vide : fermer la vanne N₂ (Figure 1, étiquetée « 3 »). Ouvrez la vanne pour le vide (Figure 1, étiquetée « 2 »). Lorsque la solution est presque éliminée, ouvrez la vanne N₂ (Figure 1, étiquetée « 3 »).
7. Fermez la soupape de dépression (Figure 1, étiquetée « 2 »). Ajouter 3 ml de DMF pour rincer le tube à essai et le tube à dispersion de gaz.
8. Aspirer le DMF sous vide : fermer la vanne N₂ (Figure 1, étiquetée « 3 »). Ouvrez la vanne pour le vide (Figure 1, étiquetée « 2 »). Lorsque la solution est presque éliminée, ouvrez la vanne N₂ (Figure 1, étiquetée « 3 »).
9. Répétez les étapes 5.7 et 5.8 2 fois pour un total de trois lavages avec le solvant DMF.

6. Répétez les cycles peptidiques SPPS

1. Répétez toutes les étapes des sections 4 (élimination des FMOC) et 5 (Couplage des acides aminés FMOC) jusqu’à l’obtention d’un peptide de la séquence souhaitée.
   REMARQUE : Assurez-vous d’ajouter des solutions réactives à l’extérieur du réacteur à micro-ondes, à température ambiante, directement dans la cuve de réaction du tube à essai. Assurez-vous également que l’agitation de l’azote est initiée avant de placer le tube à essai dans le réacteur à micro-ondes.

7. Clivage peptidique

1. Transférez la résine dans une seringue en plastique frittée.
2. Préparez un cocktail de clivage composé de 95 % d’acide trifluoroacétique (TFA), de 2,5 % d’eau et de 2,5 % de silane triisopropylique (TIPS) à un volume de 1 mL/100 mg de résine.
3. Fendez le peptide pendant 2 h à température ambiante en le secouant continuellement ou occasionnellement.
4. Précipiter le produit peptidique dans 10 mL d’éther diéthylique glacé.
5. Remettre la pastille en suspension dans une quantité minimale de MeCN/TFA aqueux à 0,1 % et lyophiliser pendant la nuit.

Des exemples de séquences peptidiques préparées avec notre appareil sont présentés à la figure 2 et à la figure 3. Le tableau 1 résume les solutions, les paramètres des micro-ondes et les lavages que nous avons utilisés. La confirmation de la spectrométrie de masse MALDI-TOF est illustrée dans les figures. La récupération de masse de ces peptides a été supérieure à 80 %. De manière significat...

L’appareil présenté ici invoque une méthode simple, nouvelle et peu coûteuse pour éliminer les solvants, les réactifs en excès et les déchets, ainsi que pour ajouter de l’agitation à l’azote gazeux, pendant le SPPS assisté par micro-ondes. Contrairement aux récipients SPPS conventionnels, qui invoquent une fritte au fond du récipient, l’appareil présenté invoque un tube de dispersion de gaz sous vide pour aspirer le récipient. La cuve de réaction est donc une épr...

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Les auteurs sont reconnaissants du soutien des subventions INSPIRE de l’Université Fairfield, du soutien du Département de chimie et de biochimie de l’Université Fairfield et de l’aide de la Dre Dorothy Szobcynski pour son expertise dans la gestion du laboratoire. De plus, les auteurs sont reconnaissants aux professeurs Jillian Smith-Carpenter et Aaron Van Dyke pour les discussions concernant les peptides et la synthèse organique. Les auteurs apprécient le soutien du Fonds de publication du Collège des arts et des sciences de l’Université Fairfield.