Análise da sinalização lipídica em fotorreceptores de Drosophila usando espectrometria de massas

O manuscrito apresenta protocolos de espectrometria de massas versáteis, robustos e sensíveis para identificar e quantificar várias classes de lipídios de fotorreceptores de Drosophila .

A ativação da fosfolipase Cβ (PLCβ) é uma etapa essencial durante a transdução sensorial em fotorreceptores de Drosophila . A atividade do PLCβ resulta na hidrólise do fosfatidilinositol 4,5 bifosfato lipídico da membrana [PI(4,5)P₂] levando, em última análise, à ativação do potencial receptor transitório (TRP) e canais semelhantes a TRP (TRPL). A atividade do PLCβ também leva subsequentemente à geração de muitas espécies lipídicas, várias das quais foram propostas para desempenhar um papel na ativação do TRP e do TRPL. Além disso, várias classes de lipídios foram propostas para desempenhar papéis importantes na organização da biologia celular dos fotorreceptores para otimizar as reações de sinalização para uma transdução sensorial ideal. Historicamente, essas descobertas foram impulsionadas pela capacidade de isolar mutantes de Drosophila para enzimas que controlam os níveis de lipídios específicos e realizam análises da fisiologia dos fotorreceptores nesses mutantes. Mais recentemente, poderosos métodos de espectrometria de massa para isolamento e análise quantitativa de lipídios com alta sensibilidade e especificidade foram desenvolvidos. Estes são particularmente adequados para uso em Drosophila , onde a análise lipídica agora é possível a partir de fotorreceptores sem a necessidade de marcação de radionuclídeos. Neste artigo, são abordadas as considerações conceituais e práticas no uso da espectrometria de massa lipídica para a avaliação quantitativa robusta, sensível e precisa de vários lipídios de sinalização em fotorreceptores de Drosophila . Juntamente com os métodos existentes em genética molecular e análise fisiológica, esse lipídio provavelmente aumentará o poder dos fotorreceptores como um sistema modelo para descobertas em biologia.

A fototransdução em Drosophila é mediada por uma cascata de PLCβ acoplada à proteína G que leva à ativação dos canais ativados por luz TRP e TRPL¹. O PLCβ hidrolisa o fosfolipídio ligado à membrana, fosfatidilinositol 4,5 bifosfato [PI (4,5) P₂] e gera diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5 trifosfato (IP₃). O DAG é então fosforilado pela DAG-quinase para gerar ácido fosfatídico (PA). Posteriormente, por meio de uma série de reações que envolvem a geração de intermediários lipídicos, o PI(4,5)P₂ é regenerado². Vários componentes deste ciclo PI(4,5)P₂ têm funções nos fotorreceptores de Drosophila . O mecanismo pelo qual a ativação do PLC leva ao bloqueio do canal TRP e TRPL permanece sem solução. No entanto, várias linhas de evidência sugerem que intermediários lipídicos gerados pela hidrólise de PI(4,5)P₂ podem mediar esse processo³. Assim, é muito importante identificar e quantificar esses intermediários lipídicos para esclarecer o mecanismo de ativação de TRP e TRPL na fototransdução de Drosophila . Além de seu papel na fototransdução em si, os lipídios também desempenham vários papéis importantes na organização celular dos fotorreceptores (revisado em³). A compreensão desses papéis funcionais dos lipídios é auxiliada pela capacidade de detectar e quantificar seus níveis in vivo. Este artigo fornece uma visão geral, bem como protocolos para a escolha e implementação de métodos para quantificar lipídios de fotorreceptores de Drosophila .

Historicamente, a análise lipídica consistia no fracionamento por classes químicas seguido da análise de classes individuais. Para identificar e quantificar com sucesso os lipídios, muitos métodos analíticos foram desenvolvidos que são análises lipídicas direcionadas ou não direcionadas 4,5,6,7,8,9,10. A análise direcionada se concentra em lipídios conhecidos e utiliza um método específico com alta sensibilidade para a análise quantitativa desses lipídios específicos. A análise lipídica não direcionada visa detectar muitas espécies lipídicas em uma amostra simultaneamente. Esses métodos analíticos incluem cromatografia em camada delgada (TLC)⁴, cromatografia gasosa (GC)⁵, cromatografia líquida (LC)⁶, ensaios imunoenzimáticos (ELISA)⁷, ressonância magnética nuclear (RMN)⁸, marcação de radionuclídeos e espectrometria de massa (MS)^9,10. Embora a marcação radioativa seja um método sensível para a detecção de lipídios e possa ser usada no contexto de células cultivadas, seu uso na análise de lipídios em organismos intactos, como Drosophila, é desafiador devido a considerações de segurança da radiomarcação de animais voadores vivos. O outro desafio com a marcação radioativa é que ela depende da marcação de todos os pools de precursores para um equilíbrio próximo e isso pode ser difícil no contexto de modelos in vivo.

A análise lipídica abrangente usando a EM é um avanço recente possibilitado pelo desenvolvimento de tecnologias modernas de EM¹¹. A análise de lipídios baseada em MS oferece várias vantagens, incluindo tamanhos de amostra pequenos, aplicabilidade a amostras de modelos animais, alta sensibilidade, especificidade e alto rendimento. Em particular, o uso extensivo de ionização por eletrospray levou a uma melhoria no desempenho do MS para análise lipídica. O aprimoramento dos analisadores de massa em espectrômetros de massa, incluindo a combinação de diferentes analisadores de massa, acrescentou vantagens extras e o desenvolvimento de um analisador de massa de alta resolução reavivou os estudos lipídicos¹¹. A análise baseada em MS caracteriza as moléculas lipídicas de duas maneiras principais: (1) lipidômica de cima para baixo, onde os experimentos de MS visam a rápida caracterização quantitativa das mudanças globais dentro do lipidoma e dependem apenas de massas precisas de precursores lipídicos intactos¹²; (2) Lipidômica de baixo para cima que quantifica espécies moleculares individuais detectando íons de fragmentos estruturais característicos usando tandem MS^13,14.

No geral, a análise de lipídios em fotorreceptores de Drosophila consiste em duas etapas: primeiro, extração de lipídios do tecido ocular / cabeça e, segundo, análise de lipídios extraídos por MS. Isso pode ser realizado usando um dos seguintes métodos: separação de lipídios por cromatografia líquida (LC) acoplada a MS ou sem separação cromatográfica usando lipidômica shotgun / MS de infusão direta (DIMS). Ambas as abordagens de perfil lipídico são baseadas no uso de eletrospray ionizado MS (ESI-MS) e têm se mostrado sensíveis, quantitativas e eficientes^10,15. Na análise DIMS, a identificação de lipídios é baseada na massa do íon precursor, varreduras de perda neutra e assinaturas específicas da classe lipídica^{14 , 16 , 17 , 18} . Embora essa abordagem combine a velocidade de análise e robustez, a supressão de íons de lipídios de baixa abundância devido à presença de lipídios de alta abundância e altamente polarizáveis na amostra não pode ser evitada. Assim, lipídios pouco abundantes, como fosfoinositídeos e PA, muitas vezes não são detectados ou mal detectados pelas plataformas DIMS padrão, devido à supressão de íons, entre outros motivos^19,20. A separação por cromatografia líquida antes da MS (LC-MS) pode ajudar a superar a supressão de íons, bem como focar a análise de classes específicas ou espécies de lipídios de interesse²¹.

Neste artigo, são descritas as etapas envolvidas na quantificação dos principais lipídios de interesse nos fotorreceptores de Drosophila. A este respeito, três abordagens diferentes de MS foram otimizadas: (1) DIMS usando um espectrômetro de massa de alta resolução, (2) cromatografia líquida de fase reversa pós-derivatização-MS (RPLC-MS) usando um espectrômetro de massa quádruplo triplo e (3) cromatografia líquida de fase normal - monitoramento de reação múltipla - varredura de íons de produto aprimorada-MS (NPLC-MRM-EPI-MS) usando um espectrômetro de massa quádruplo triplo com uma função aprimorada de varredura de íons de produto. A escolha entre esses métodos é ditada pelas questões específicas de pesquisa sob investigação. Para uma descrição e análise global de todos os tipos de glicerofosfolipídios envolvidos na fototransdução, o DIMS deve ser usado. No entanto, deve-se notar que, nessa abordagem, glicerofosfolipídios de baixa polarização e baixa abundância, como os fosfoinositídeos, provavelmente não serão detectados²². Para detectar esses lipídios de baixa abundância, RPLC-MS pós-derivatização deve ser realizada. Usando essa abordagem, detectamos e quantificamos com sucesso o ácido fosfatídico (PA) ^{23 , 24 , 25} , fosfatidilinositol (PI), fosfato 5 fosfato (PI5P) ²⁶, fosfato fosfatidilinositol 4 (PI4P) e PI (4,5) P₂²⁷. Os métodos DIMS e RPLC-MS pós-derivatização geram informações em nível de classe lipídica. Por exemplo, usando esses dois métodos, pode-se quantificar PA (34:2) cujo m/z é consistente com várias espécies moleculares, incluindo: (i) PA (16:0/18:2), (ii) PA (18:2/16:0), (iii) PA (16:2/18:0), (iv) PA (18:0/16:2), (v) PA (16:1/18:1), (vi) PA (18:1/16:1), (vii) PA (14:2/20:0) e (viii) PA (20:0/14:2). Usando esses métodos, não é possível obter informações sobre a composição da cadeia de acila gordurosa do PA (34:2) presente na amostra. Esse desafio pode ser superado por um método híbrido de MS que combina separação por LC, monitoramento de reações múltiplas (MRM) e varredura aprimorada de íons do produto (EPI). Esse método é sensível e quantitativo e permite: mensuração direta, ou seja, sem qualquer pré-rotulagem ou pós-processamento da amostra, e estabelece as espécies moleculares com informações exatas da cadeia de acila gordurosa²⁵. Usando este método, identificamos um grande número de espécies moleculares de PA e determinamos a composição exata das cadeias de acila gordurosa em SN1 e SN2 da estrutura do glicerol. Essa abordagem será útil ao analisar a função de espécies moleculares específicas de qualquer classe de lipídios em fotorreceptores. Os protocolos detalhados apresentados aqui para cada um desses tipos de análises podem ser adaptados a outros lipídios de sinalização relevantes para a função dos fotorreceptores de Drosophila (para esquemas, consulte a Figura 1). Deve-se notar que métodos detalhados para análise lipidômica de várias outras classes de lipídios (não abordados neste artigo) foram descritos em outro lugar. Estes incluem ceramidas^28,29, esfingolipídios^30,31, lipídios neutros como diglicerídeos e triglicerídeos^32,33 e esteróis ^15,33. Em alguns casos, métodos para análises desses lipídios foram descritos para tecidos larvais de Drosophila e podem ser adaptados para uso em fotorreceptores.

1. Criação de moscas e preparação de produtos químicos

1. Moscas traseiras (Drosophila melanogaster) em alimento padrão para moscas em uma incubadora com 50% de umidade relativa a 25 °C sem iluminação interna. Prepare alimentos para moscas adicionando 80 g/L de farinha de milho, 20 g/L de D-glicose, 40 g/L de sacarose, 8 g/L de ágar, 15 g/L de extrato de levedura, 4 mL de ácido propiônico, 0,7 g/L de TEGO (para-hidroxibenzoato de metila) e 0,6 mL de ácido ortofosfórico, conforme descrito em³⁴ e também estão disponíveis em https:// bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparation. Cultive um conjunto de moscas, pós-eflosões, em uma incubadora resfriada mantida a 25 ° C com iluminação contínua de luz branca de ~ 2.000 lux.
2. Prepare o tampão de eluição de fosfoinositídeo (PEB) adicionando clorofórmio: metanol: ácido clorídrico 2,4 M na proporção de 250: 500: 200 (vol / vol / vol). Prepare o tampão de lavagem da fase inferior (LPWS) adicionando metanol: 1 M ácido clorídrico: clorofórmio na proporção de 235: 245: 15 (vol / vol / vol). Prepare a solução de lavagem pós-derivatização adicionando clorofórmio: metanol: água na proporção de 8: 4: 3 (vol / vol / vol).
   NOTA: Use solventes e produtos químicos de grau MS. Não armazene o buffer PEB e LPWS por mais de 3 meses.
3. Use a coluna C4 (1,7 μm x 1 mm x 100 mm) para os fosfoinositídeos, PI4P e PI(4,5)P₂ e a coluna C18 (1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm) para PA, fosfatidilcolina (PC) e fosfatidilinositol (PI). Para o método NPLC-MRM-EPI, use a coluna de sílica (1 mm x 150 mm x 3 μm).
4. Preparar o eluente A adicionando hexano:álcool isopropílico:acetato de amónio aquoso 100 mM numa proporção de 68:30:2 (vol/vol/vol) e o eluente B adicionando hexano:álcool isopropílico:acetato de amónio aquoso 100 mM na proporção 70:20:10 (vol/vol/vol) para PA, PC e PI. Prepare o solvente A para fosfoinositídeos adicionando 0,1% de ácido fórmico em água e o solvente B adicionando 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila.

2. Isolamento de tecido

1. Colete 10 moscas por amostra usando anestesia com dióxido de carbono (CO₂) (as moscas imobilizam em segundos) e decapite as moscas usando uma lâmina afiada em uma placa anestesiante de CO₂ .
2. Colete moscas adaptadas à luz ou escuras de idade definida (12-24 h de idade) em tubos de 1,5 mL e congele em nitrogênio líquido. Desidrate as moscas em acetona a -80 °C durante 48 h num frasco de vidro³⁵. Para tecido retiniano, colete 100 retinas de moscas liofilizadas. Usando um bisturi, remova os olhos do resto da cabeça e retire as retinas.
3. Para a análise de fosfoinositídeos PI4P e PI(4,5)P₂ , ao trabalhar com retinas frescas, utilizar 25 retinas por amostra de moscas cultivadas em condições de iluminação adequadas para medir os níveis de lípidos durante a iluminação e de moscas cultivadas sem luz para medir os níveis de lípidos no escuro. Armazenar em 50 μL de 1x PBS em tubos homogeneizadores em gelo seco até que esteja pronto para extração.

3. Extração de lipídios

CUIDADO: O clorofórmio é um solvente tóxico e de natureza cancerígena. Afeta o sistema reprodutivo e é irritante para a pele e os olhos. Deve-se tomar cuidado ao manusear este produto químico. Todas as etapas que envolvem o clorofórmio devem ser realizadas em uma coifa química bem ventilada.

1. Para todos os glicerofosfolipídios, exceto PI4P e PI(4,5)P₂
   1. Para cada amostra, homogeneizar 10 cabeças de mosca ou 100 retinas (coletadas conforme descrito na etapa 2.2) em 0,1 mL de HCl metanólico gelado 0,1 N e 30 μL de mistura de padrão interno (PA (17:0/14:1), PC (17:0/14:1), ácido lisofosfatídico (LPA; 13:0), lisofosfatidilcolina (LPC; 13:0), LPC (17:1), PA (17:0/17:0), PA (16:0-D31/18:1), LPA (17:1), LPC (19:0), PI (12:0/13:0), PA (12:0/13:0) e PC (12:0/13:0)). Prepare padrões de forma que a quantidade final de qualquer padrão lipídico esteja dentro da curva de resposta linear do espectrômetro de massa.
   2. Homogeneizar os tecidos usando um homogeneizador automatizado que permite o tratamento rápido e simultâneo de todas as amostras. Gire brevemente os tubos em uma centrífuga de mesa e certifique-se de que nenhum pellet seja formado - isso indica homogeneização completa. Transferir o homogeneizado metanólico para um tubo de microcentrífuga com tampa de 2 ml.
   3. Adicione 0,2 mL de HCl metanólico 0,1 N gelado para recuperar qualquer material residual no tubo e misture no tubo de 2 mL. Adicione 0,1 mL de HCl metanólico gelado 0,1 N seguido de 0,8 mL de clorofórmio e misture bem. Deixe a mistura, contendo homogeneizado de tecido, repousar sobre gelo por 10 min e, em seguida, adicione 0,4 mL de KCl a 0,88% e vórtice por 30 s.
   4. Centrifugue a mistura a 1.000 x g por 10 min a 4 °C para separar as fases aquosa e orgânica. Retire a fase orgânica inferior contendo lipídios com muito cuidado, sem misturar com a fase aquosa, e transfira para um novo tubo de microcentrífuga de 2 mL.
      NOTA: Durante a extração de lipídios, transfira a fase orgânica inferior com o máximo cuidado para evitar a mistura com a fase aquosa, o que pode dificultar a análise lipídica a jusante.
   5. Secar esta solução lipídica num evaporador a vácuo a 4 °C, inspeccionar visualmente a amostra para assegurar a secagem completa. Ressuspender em 420 μL de mistura 2:1 metanol:clorofórmio para análise. Analise as amostras imediatamente sem armazenamento.
2. Para fosfoinositídeos PI4P e PI(4,5)P₂
   1. Homogeneizar 25 retinas em 950 μL de tampão de eluição de fosfoinositídeo (PEB; 250 mL de CHCl₃, 500 mL de metanol e 200 mL de HCl 2,4 M) e adicionar padrões internos (fosfatidiletanolamina (PE) 17:0/14:1; PI (17:0/14:1); PI4P (17:0/20:4); e mistura de PI(4,5)P₂ (16:0/16:0)) contendo 50 ng de PI, 25 ng de PI4P, 50 ng de PI(4,5)P₂ e 0,2 ng de PE por amostra.
   2. Adicione 250 μL de clorofórmio e 2,4 M de HCl, seguido de sonicação por 2 min e centrifugação a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C para separação de fases. Retire a fase orgânica inferior para um tubo novo, lave com 900 μL de LPWS e centrifugue a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C.
   3. Extrair os lípidos da fase aquosa restante, efectuando novamente uma separação de fases, como indicado no passo 3.2.2. Secar as fases orgânicas recolhidas numa centrifugadora de vácuo regulada para 4 °C, inspeccionar visualmente as amostras para assegurar a secagem completa.

4. Ensaio de fosfato orgânico

1. Faça uma solução estoque de 7,34 mM KH₂PO₄. Efectuar as diluições padrão, utilizando água destilada, em tubos de microcentrífuga, conforme o quadro 1. Agite levemente os tubos e transfira as diluições padrão para tubos de vidro sem fosfato.
2. Prepare um conjunto separado de tubos de vidro contendo as amostras de lipídios. Otimize o volume de amostras lipídicas de modo que a absorbância a 630 nm (após a conclusão deste protocolo) caia dentro da faixa do padrão KH₂PO₄ (que é de 0 a 20x).
3. Aquecer os tubos de vidro contendo diluições-padrão a 120 °C até completar a secura. Aquecer os tubos de vidro que contêm as amostras lipídicas (retirar 1/^{8 do volume} total da amostra necessário para ter absorvância dentro da gama da norma KH₂PO₄) a 90 °C até completar a secura.
4. Adicione 50 μL de ácido perclórico a 70% a todos os tubos e aqueça a 180 °C por 30 min. Resfrie os tubos à temperatura ambiente. Adicione 250 μL de água, 50 μL de molibdato de amônio a 2,5% e 50 μL de ácido ascórbico a 10% a cada tubo.
   NOTA: 2,5% de molibdato de amônio e 10% de ácido ascórbico são concentrações de peso / vol. Eles precisam ser feitos na hora e podem ser armazenados a 4 ° C por até 1 semana.
5. Manter os tubos numa incubadora agitável a 37 °C durante 1 h. Alíquota de 130 μl de amostra para uma placa de 96 poços e medir a absorvância a 630 nm usando um espectrofotômetro.

5. Derivatização

CUIDADO: O trimetilsilildiazometano (TMSD) tem muitos efeitos toxicológicos em humanos. A TMSD em solução tem como alvo os rins, fígado, trato gastrointestinal, músculos esqueléticos, sistema nervoso central e sistemas respiratório e reprodutivo. Deve-se tomar extrema precaução ao manusear este produto químico. Todo o processo deve ser realizado em uma coifa química bem ventilada.

1. À fase orgânica inferior das amostras obtidas no final da etapa 3.2.3., adicione 50 μL de 2 M TMSD. Permitir que a reação prossiga à temperatura ambiente durante 10 minutos, agitando constantemente a 250 rpm. Após 10 min, adicione 10 μL de ácido acético glacial para extinguir a reação, indicada pelo desaparecimento da cor amarela na solução.
2. Bata nos tubos e abra-os com cuidado para remover o N₂ formado na reação de têmpera. Depois que o gás N₂ escapar, feche os tubos e gire-os para baixo. Em seguida, adicione 600 μL de solução de lavagem pós-derivatização e vórtice por 2 min em um misturador a 250 rpm.
3. Descarte ~ 400 μL da fase superior que se formará. Repita a etapa 5.2. Descarte toda a fase superior e adicione 50 μL de metanol a 90% à fase inferior e misture.
4. Secar as amostras durante 2 h num concentrador centrífugo a 800 x g a funcionar no vácuo. Após a secagem, os tubos devem conter ~ 20 μL da amostra restante. Adicione 180 μL de metanol 100%, misture bem e armazene a 4 °C por até 2-3 dias antes de LC-MS/MS.

6. Aquisição e análise de dados

1. Aquisição de dados em MS de infusão direta (DIMS)
   NOTA: A ESCLEROSE MÚLTIPLA pode ser feita por infusão direta ou cromatografia líquida pelo método MS (LC-MS). Nesta seção, descrevemos a EM baseada em infusão direta.
   1. Antes de iniciar o experimento, calibre o espectrômetro de massa de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Gere uma curva de resposta linear para a série de diluições de padrões sintéticos e, com base na resposta linear do instrumento, dilua a amostra de modo que a intensidade do analito lipídico fique dentro da linearidade do instrumento. Diluir os extratos lipídicos totais ou os padrões lipídicos com uma mistura de metanol:clorofórmio 2:1 (vol/vol). Selecionar a diluição dos extratos lipídicos totais e dos padrões sintéticos individualmente para cada experimento.
   3. Transfira os extratos e padrões para frascos individuais. Evite bolhas de ar durante a transferência de amostras para frascos de amostra de MS. As bolhas de ar criarão alta pressão na coluna e dificultarão a análise lipídica.
   4. Antes da análise, centrifugue as amostras por 9 min a 6.440 x g e carregue em uma placa de 96 poços e sele com papel alumínio.
   5. Realize análises de MS em um espectrômetro de massa de alta resolução usando o método de infusão direta. Obtenha ionização estável baseada em ESI de glicerofosfolipídios usando uma fonte robótica de íons de nanofluxo usando chips com bicos de pulverização de diâmetro de 4,1 μm.
   6. Controle a fonte de íons usando um software de espectrômetro de massa personalizado e defina as tensões de ionização em +1,2 kV e -1 kV nos modos positivo e negativo, respectivamente; contrapressão a 1 psi em ambos os modos; e temperatura do capilar de transferência de íons a 180 °C. Realize a aquisição em resolução de massa, R_m/z400 = 100.000. Consulte a Figura 2A para a interface do software para configurar os parâmetros do espectrômetro de massa.
   7. Dissolver novamente os extractos lipídicos totais secos em 400 μL de clorofórmio:metanol (1:2). Para a análise, carregue 60 μL de amostras em uma fonte de íons de placa de 96 poços e sele com papel alumínio. Analise cada amostra por 20 min em modo de íon positivo para detectar PC, fosfatidilserina (PS), fosfatidiletanolamina (PE), PE-O (fosfatidiletanolamina ligada ao éter), ceramida (Cer) e fosfato de ceramida (Cer-P).
   8. Realize uma aquisição independente no modo de íon negativo por 20 min onde PA e PI foram detectados. Consulte a Figura 2B para obter detalhes específicos da configuração do instrumento para aquisição de dados para EM de alta resolução e uma lista direcionada de espécies de PA que foram incluídas na configuração de aquisição dependente de dados (DDA).
      NOTA: A interface do software para configuração do método DDA é mostrada na Figura 2C. A lista de moléculas de PA visadas nesta abordagem está listada na Tabela 2. Uma captura de tela do resultado experimental na abordagem DDA é mostrada na Figura 2D.
2. Análise de dados em MS de infusão direta (DIMS)
   NOTA: A análise de dados de massa gerados por todos os tipos de espectrômetros de massa requer uma plataforma automatizada de análise de lipídios. O LipidXplorer³⁶ é um software não comercial que suporta todos os tipos de experimentos lipídicos DIMS. Este software pode ser encontrado aqui: https://www.mpi-cbg.de/research-groups/current-groups/andrej-shevchenko/projects/lipidxplorer/
   1. Uma vez que os dados tenham sido adquiridos usando os métodos descritos na etapa 6.1, identifique as espécies lipídicas usando uma plataforma de análise lipídica, combinando m/z de seus picos monoisotópicos com as restrições de composição elementar correspondentes. O exemplo de importação de dados é mostrado na Figura 3A. Defina a tolerância de massa para 10 ppm e o limite de intensidade de acordo com o nível de ruído relatado pelo software do espectrômetro de massa.
   2. Após a importação, compile consultas MFQL (molecular fragmentation query language) para PA com base na estrutura química do PA, que é mostrada na Figura 3B. Consulte a Figura 3C para obter o MFQL configurado na plataforma de análise de lipídios.
   3. Usando uma abordagem semelhante, compile o MFQL para outros glicerofosfolipídios no software da plataforma de análise lipídica. Cada consulta tem como destino uma classe lipídica e muitas consultas podem ser usadas em uma única execução.
   4. Execute todos os MFQLs clicando no botão Executar . Todas as espécies lipídicas identificadas são relatadas em um único arquivo de resultados em formato de arquivo .csv com as abundâncias de íons precursores e/ou fragmentos correspondentes para a subsequente quantificação de lipídios. Um exemplo da saída é dado na Tabela 3.

7. Cromatografia líquida e MS em tandem de amostras derivatizadas

1. Separar as amostras obtidas na etapa 5.4 por cromatografia líquida utilizando um sistema de cromatografia líquida de ultra-performance. Ao escolher este sistema, certifique-se de que seu software possa se integrar ao do espectrômetro de massa usado para a análise.
2. Conecte o sistema a um espectrômetro de massa triplo quadrupolo. Escolha uma coluna de separação. Para a separação de lipídios diferentes de PI4P e PI(4,5)P₂ , escolha uma coluna C18 (1,0 mm x 100 mm x 1,7 mm). Para PI4P e PI(4,5)P₂, escolha uma coluna C4 de dimensões 300 Å (1.0 mm x100 mm x 1.7 μm).
3. Preparar a fase móvel que contém formiato de amónio dissolvendo primeiro o formiato de amónio em água de grau de massa e, em seguida, em solventes orgânicos. Sonicar todos os solventes que são usados na espectrometria de massa por 20 min para remover bolhas de ar.
4. Equilibre a coluna infundindo a solução A contendo água + ácido fórmico a 0,1% e a solução B contendo acetonitrila + ácido fórmico a 0,1%.
5. Injectar o eluído do sistema de cromatografia líquida (volume de injecção no intervalo de 1-20 μl) no espectrómetro de massa para análise. Defina a vazão em 0,1 mL/min e a temperatura da coluna à temperatura ambiente. Injetar todo o volume de eluir que sai da coluna no espectrômetro de massa.
6. Na sequência de injeção de amostras, sempre comece com uma injeção de solvente em branco (metanol) e mantenha amostras padrão limpas intermitentemente entre as amostras biológicas para verificações de controle de qualidade de execução de espectrometria de massa (a cada sexta execução).
7. Para a configuração experimental do espectrômetro de massa híbrido triplo quadrupolo íon-armadilha, antes de iniciar o experimento, calibre o espectrômetro de massa de acordo com as instruções do fabricante. Para PA, PC e PI, use ionização por eletrospray (ESI) para gerar os íons e operar em modo positivo para detectar as espécies lipídicas carregadas positivamente. Adquira os dados e analise-os usando o software de análise de dados instalado com o sistema.
8. Otimize os parâmetros para análise de acordo com o padrão interno correspondente utilizado. Os parâmetros do espectrômetro de massa são os seguintes: tempo de permanência = 30 ms; CAD (dissociação ativada por colisão) = 3 psi; GS1 (gás de origem 1) = 24 psi e GS2 (gás de fonte 2) = 21 psi; CUR (gás de cortina) = 30 psi; IS (tensão ESI) = 4,5 kV; e ETM (temperatura de origem) = 450 °C.
9. Para PI4P e PI(4,5)P₂, use espectrômetro de massa no modo positivo. Os parâmetros do espectrômetro de massa são os seguintes: tempo de permanência = 65 ms; CAD (dissociação ativada por colisão) = 2 psi; GS1 (gás fonte 1) e GS2 (gás fonte 2) = 20 psi; CUR (gás de cortina) = 37 psi; IS (tensão ESI) = 5,2 kV; e MET (temperatura de origem) = 350 °C.

8. Cromatografia líquida de fase normal - monitoramento de reação múltipla - varredura de íons aprimorada do produto MS (NPLC-MRM-EPI MS)

1. Condições cromatográficas
   1. Use um método LC de fase normal usando uma coluna de sílica, que é capaz de separar o PA de outros fosfolipídios. Utilizar hexano:álcool isopropílico:100 mM NH₄COOH aquoso na proporção 68:30:2 como fase móvel A e álcool isopropílico:hexano:100 mM NH₄COOH aquoso na proporção de 70:20:10 como fase móvel B.
      NOTA: Esta combinação proporcionou a melhor separação e seletividade de pico de diferentes espécies moleculares de PA.
   2. Use o comportamento cromatográfico dos compostos de referência (padrões internos), em termos de resolução e forma de pico, para escolher as condições ideais.
   3. Efectuar a separação cromatográfica numa coluna de sílica em fase normal (1 mm x 150 mm x 3 μm) à temperatura ambiente numa coluna de cromatografia líquida de ultra-desempenho. Defina o volume de injeção do amostrador automático para 6 μL e a vazão do eluente para 210 μL/min.
   4. Após 5 min de equilíbrio com 100% da fase móvel A, aumente linearmente a fase móvel B para 30% em 5 min, para 80% em 5 min, depois para 100% em 5 min e mantenha-a constante em 100% por 5 min. Por fim, reequilibre a coluna por 9 min.
2. Espectrometria de massa
   1. Use um espectrômetro de massa híbrido triplo quadrupolo ion-trap operando no modo ESI negativo. Controle a operação do sistema e a aquisição de dados usando o software de análise fornecido. Antes de iniciar o experimento, calibre o espectrômetro de massa de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Otimize os parâmetros da fonte usando a análise de injeção de fluxo da mistura padrão interno. Assim, defina a tensão de pulverização de íons = -4.5 kV, temperatura da fonte (TEM) = 450 °C, gás de dissociação ativado por colisão (CAD) = 3 psi. Use o gás nitrogênio como gás de colisão e defina o gás nebulizador (GS1) = 24 psi, o gás auxiliar (GS2) = 21 psi e o gás de cortina (CUR) = 30 psi.
   3. Defina os parâmetros do caminho iônico dependente do composto como potencial de desagrupamento (DP) = -42 V, potencial de entrada (EP) = -6 V e potencial de saída da célula de colisão (CXP) = -12 V, otimizados usando infusão contínua de solução de mistura de padrão interno. Registre espectros completos do produto junto com as transições MRM do precursor para o produto com energia de colisão variável (CE) a partir de 12 eV a 40 eV para análise de fragmentação usando a função de varredura EPI disponível no espectrômetro de massa.
      NOTA: O MPI baseado em IDA acionado por MRM registra simultaneamente o produto iônico precursor, a varredura de íons e a aquisição instantânea de MS/MS. O MRM estreitou a faixa de varredura de íons no quadrupolo 1 (Q1) e a armadilha de íons aumentou os fragmentos de íons que passam por Q2, melhorando muito a capacidade qualitativa do quadrupolo MS / MS, especialmente para captura de todos os fragmentos decorrentes do íon precursor. No modo EPI, vários íons de fragmentos decorrentes dos íons precursores são detectados em Q3 com melhor relação sinal-ruído.
   4. Realize experimentos de MRM com CE de 39 eV para obter alta sensibilidade. Limitar o número máximo de MRM a 75 e o tempo de permanência a 30 ms para detectar e registar o MRM de qualquer molécula específica que seja eluída da coluna cromatográfica em qualquer momento durante a execução. Isso aumenta o ciclo de trabalho da máquina.
   5. Realize o ajuste experimental para decidir os melhores parâmetros de ionização para PA, conforme descrito acima. Para este experimento, defina a tensão de pulverização de íons = -4,5 kV, temperatura da fonte (TEM) = 450 °C, gás de dissociação ativado por colisão (CAD) = 3 psi. Use gás nitrogênio como gás de colisão. Defina o gás nebulizador (GS1) = 24 psi, o gás auxiliar (GS2) = 21 psi e o gás de cortina (CUR) = 30 psi.
   6. Examine manualmente todos os dados de ajuste para garantir a seleção adequada dos parâmetros de ionização e íons do produto. Leve em consideração a minimização da interferência potencial entre os canais MRM ao selecionar o íon do produto. Os parâmetros experimentais utilizados para a análise de todas as espécies moleculares de PA são mostrados na Tabela 4.
      NOTA: O espectrômetro de massa híbrido triplo quadrupolo linear de armadilha de íons nos permite combinar o modo de varredura MRM com a função de varredura de armadilha de íons, permitindo assim uma varredura rápida e alta, utilizando métodos como a varredura EPI para registrar espectros de massa em tandem úteis de cada precursor detectado. Neste estudo, para identificar espécies moleculares distintas de PA, exploramos esta abordagem MS/MS baseada em MRM-EPI baseada no caminho convencional de íons triplo quadrupolo com a propriedade de varredura EPI da armadilha de íons, controlada pelo software de análise.

Determinação da linearidade da medição em MS. A linearidade é a capacidade do método MS de fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração do analito lipídico. A linearidade depende de (a) eficiência de ionização do analito lipídico e (b) comportamento de ionização do analito lipídico em diferentes concentrações depende da fonte de íons utilizada. Na ionização por eletrospray (ESI) usada neste estudo, a linearidade se mantém em concent...

Várias linhas de evidência convergem para múltiplos papéis de lipídios sinalizadores na regulação da organização e função dos fotorreceptores de Drosophila. Além do papel bem estudado dos lipídios na regulação da fototransdução³, os lipídios sinalizadores também têm sido implicados no tráfego de proteínas e na organização subcelular 23,30,39,40,41.

Os autores não têm nada a divulgar.

O trabalho descrito neste manuscrito foi apoiado pelo Departamento de Energia Atômica, Governo da Índia (Identificação do Projeto No. RTI 4006), o Departamento de Biotecnologia do Governo da Índia (BT / PR4833 / MED / 30/744/2012) e uma bolsa sênior da India Alliance (IA / S / 14/2/501540) para PR. Agradecemos ao NCBS Mass Spectrometry Facility, especialmente ao Dr. Dhananjay Shinde e aos membros do laboratório de relações públicas por suas contribuições para o desenvolvimento desses métodos.