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要約

この論文は、 ショウジョウバエ の光受容体から数種類の脂質を同定し定量するための、汎用性が高く、堅牢で高感度な質量分析プロトコルを示しています。

要約

ホスホリパーゼCβ(PLCβ)の活性化は、 ショウジョウバエ の光受容体における感覚伝達中の重要なステップです。PLCβ活性は、膜脂質ホスファチジルイノシトール4,5ビスリン酸[PI(4,5)P2]の加水分解をもたらし、最終的に一過性受容体電位(TRP)およびTRP様(TRPL)チャネルの活性化につながります。PLCβの活性は、その後、多くの脂質種の生成にもつながり、そのうちのいくつかはTRPおよびTRPL活性化に関与することが提案されています。さらに、いくつかのクラスの脂質が、光受容体の細胞生物学を組織化してシグナル伝達反応を最適化し、最適な感覚伝達を実現する上で重要な役割を果たすことが提案されています。歴史的に、これらの発見は、特定の脂質のレベルを制御する酵素のために ショウジョウバエ 変異体を単離し、これらの変異体の光受容体生理学の解析を行う能力によって推進されてきました。最近では、高感度で特異性の高い脂質の単離と定量分析のための強力な質量分析法が開発されています。これらは、放射性核種の標識を必要とせずに光受容体からの脂質分析が可能になった ショウジョウバエ での使用に特に適しています。この記事では、 ショウジョウバエ の光受容体におけるさまざまなシグナル伝達脂質の堅牢で高感度かつ正確な定量評価のための脂質質量分析の使用における概念的および実用的な考慮事項について説明します。分子遺伝学や生理学的解析の既存の方法とともに、このような脂質は、生物学における発見のモデルシステムとして、光受容体の力を高める可能性があります。

概要

ショウジョウバエの光伝達は、Gタンパク質共役PLCβカスケードによって媒介され、光活性化チャネルTRPおよびTRPL1の活性化につながります。PLCβは、膜結合リン脂質であるホスファチジルイノシトール4,5ビスホスフェート[PI(4,5)P2]を加水分解し、ジアシルグリセロール(DAG)とイノシトール1,4,5トリスホスフェート(IP3)を生成します。その後、DAGはDAG-キナーゼによってリン酸化され、ホスファチジン酸(PA)が生成されます。その後、脂質中間体の生成を伴う一連の反応を通じて、PI(4,5)P2が再生されます2。このPI(4,5)P2サイクルのいくつかの成分は、ショウジョウバエの光受容体で機能を持っています。PLCの活性化がTRPおよびTRPLチャネルゲーティングにつながるメカニズムは未解決のままです。しかし、いくつかの証拠は、PI(4,5)P2加水分解によって生成された脂質中間体がこのプロセスを媒介する可能性があることを示唆しています3。したがって、ショウジョウバエの光伝達におけるTRPおよびTRPLの活性化メカニズムを明らかにするためには、これらの脂質中間体を同定し定量することが非常に重要です。脂質は、光伝達自体における役割に加えて、光受容体の細胞組織化にもいくつかの重要な役割を果たしている(3)の項でレビューした。脂質のこれらの機能的役割を理解するには、in vivoで脂質レベルを検出し、定量化する能力が必要です。この記事では、ショウジョウバエの光受容体由来の脂質を定量する方法の選択と実施について、概要とプロトコルについて説明します。

歴史的に、脂質分析は、化学クラスによる分画とそれに続く個々のクラスの分析で構成されていました。脂質の同定と定量を成功させるために、標的脂質分析または非標的脂質分析である多くの分析法が開発されてきました4,5,6,7,8,9,10。ターゲット分析は、既知の脂質に焦点を当て、これらの特定の脂質の定量分析に高感度の特定の方法を利用します。ノンターゲット脂質分析は、サンプル中の多くの脂質種を同時に検出することを目的としています。これらの分析方法には、薄層クロマトグラフィー(TLC)4、ガスクロマトグラフィー(GC)5、液体クロマトグラフィー(LC)6、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)7、核磁気共鳴(NMR)8、放射性核種標識、質量分析(MS)9,10が含まれます。放射性標識は脂質を検出するための感度の高い方法であり、培養細胞の状況で使用できますが、ショウジョウバエなどの無傷生物の脂質分析での使用は、生きた飛行動物の放射性標識の安全性を考慮するため困難です。放射性標識のもう一つの課題は、すべての前駆体プールをほぼ平衡状態に標識することに依存しており、これはin vivoモデルの文脈では難しい場合があることです。

MSを用いた包括的な脂質分析は、最新のMS技術11の発展によって可能になった最近の進歩である。MSベースの脂質分析には、サンプルサイズが小さい、動物モデルからのサンプルへの適用性、高感度、特異性、高スループットなど、いくつかの利点があります。特に、エレクトロスプレーイオン化の広範な使用は、脂質分析のためのMSの性能の向上につながっています。異なる質量分析装置の組み合わせを含む質量分析計の質量分析装置の改良により、さらなる利点が追加され、高分解能質量分析装置の開発により脂質研究が復活しました11。MSベースの分析は、脂質分子を2つの主要な方法で特徴付けます:(1)MS実験がリピドーム内の全球的変化の迅速な定量的特性評価を目的とし、無傷の脂質前駆体の正確な質量のみに依存するトップダウンリピドミクス12;(2)タンデムMSを用いて特徴的な構造断片イオンを検出することにより個々の分子種を定量するボトムアップリピドミクス13,14。

全体として、ショウジョウバエの光受容体における脂質の分析は、1 つ目の眼/頭部組織からの脂質の抽出と、MS による抽出された脂質の分析の 2 つのステップで構成されています。これは、MSに結合した液体クロマトグラフィー(LC)による脂質の分離、またはショットガンリピドミクス/直接注入MS(DIMS)を使用したクロマトグラフィー分離なしの方法のいずれかを使用して実行できます。どちらの脂質プロファイリングアプローチも、エレクトロスプレーイオン化MS(ESI-MS)の使用に基づいており、感度、定量性、および効率性が高いことが証明されています10,15。DIMS分析では、脂質の同定は、プリカーサーイオン質量、中性損失スキャン、および脂質クラス特異的シグネチャ14、16、17、18に基づいています。このアプローチは分析のスピードと堅牢性を兼ね備えていますが、サンプル中に高存在量で分極性の高い脂質が存在することによる低存在量の脂質のイオン抑制は避けられません。したがって、ホスホイノシチドやPAなどの低濃度の脂質は、イオン抑制などの理由により、標準的なDIMMSプラットフォームでは検出されないか、検出が不十分であることがよくあります19,20。MSの前処理(LC-MS)前の液体クロマトグラフィー分離は、イオン抑制を克服するだけでなく、目的の脂質の特定のクラスまたは種の分析に焦点を合わせるのに役立ちます21。

この記事では、ショウジョウバエの光受容体で関心のある主要な脂質を定量化するための手順について説明します。この点に関して、(1)高分解能質量分析計を使用したDIMS、(2)トリプル四重質量分析計を使用した誘導体化後の逆相液体クロマトグラフィー-MS(RPLC-MS)、(3)プロダクトイオンスキャン機能を強化したトリプル四重質量分析計を使用した順相液体クロマトグラフィー-多重反応モニタリング強化プロダクトイオンスキャン-MS(NPLC-MRM-EPI-MS)の3つの異なるMSアプローチが最適化されています。これらの方法の選択は、調査中の特定の研究課題によって決定されます。光形質導入に関与するあらゆる種類のグリセロリン脂質の全体的な説明と分析には、DIMSを使用する必要があります。しかし、このアプローチでは、ホスホイノシチドのような低分極性で低存在量のグリセロリン脂質が検出される可能性が低いことに留意すべきである22。これらの低存在量の脂質を検出するには、誘導体化後のRPLC-MSを実施する必要があります。このアプローチを用いて、ホスファチジン酸(PA)23,24,25、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルイノシトール5リン酸(PI5P)26、ホスファチジルイノシトール4リン酸(PI4P)、PI(4,5)P227の検出と定量に成功しました。DIMSおよび誘導体化後のRPLC-MSメソッドにより、脂質クラスレベルの情報が生成されます。例えば、これら2つの方法を使用すると、(i)PA(16:0/18:2)、(ii)PA(18:2/16:0)、(iii)PA(16:2/18:0)、(iv)PA(18:0/16:2)、(v)PA(16:1/18:1)、(vi)PA(18:1/16:1)、(vii)PA(14:2/20:0)、(viii)PA(20:0/14:2)を含む複数の分子種とm/zが一致するPA(34:2)を定量化できます。これらの方法では、サンプル中に存在するPA(34:2)の脂肪酸アシル鎖組成に関する情報を得ることはできません。この課題は、LC分離、多重反応モニタリング(MRM)、および強化プロダクトイオンスキャン(EPI)を組み合わせたハイブリッドMS分析法によって克服できます。この方法は、感度と定量性の両方があり、直接測定、すなわち、サンプルの事前標識または後処理なしで、正確な脂肪酸アシル鎖情報25を持つ分子種を確立することを可能にする。この方法を用いて、PAの多数の分子種を同定し、グリセロール骨格のSN1およびSN2における脂肪酸アシル鎖の正確な組成を決定しました。このアプローチは、光受容体におけるあらゆるクラスの脂質の特定の分子種の機能を分析する際に有用です。これらの分析タイプごとにここで示す詳細なプロトコルは、ショウジョウバエの光受容体機能に関連する他のシグナル脂質に適合させることができます(概略図については図1を参照)。他のいくつかの脂質クラス(本稿では取り上げていません)のリピドミクス分析の詳細な方法は、他の場所で説明されていることに注意する必要があります。これらには、セラミド28,29、スフィンゴ脂質30,31、ジグリセリドやトリグリセリド32,33などの中性脂質、およびステロール15,33が含まれます。場合によっては、これらの脂質の分析方法がショウジョウバエの幼虫組織について記載されており、光受容体での使用に適合させることができます。

プロトコル

1.ハエの飼育と薬品の調製

  1. リアフライ(Drosophila melanogaster)は、内部照明なしで25°Cで相対湿度50%のインキュベーター内の標準的なフライフードに乗った。80 g/Lのトウモロコシ粉、20 g/LのD-グルコース、40 g/Lのスクロース、8 g/Lの寒天、15 g/Lの酵母抽出物、4 mLのプロピオン酸、0.7 g/LのTEGO(メチルパラヒドロキシ安息香酸)、および0.6 mLのオルトリン酸を加えてフライフードを準備します https://bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparation。25°Cに維持された冷却インキュベーターで、~2,000ルクスの連続白色光照明で1セットのハエを成長させます。
  2. クロロホルム:メタノール:2.4 M 塩酸を 250:500:200 (vol/vol/vol) の比率で添加して、ホスホイノシチド溶出バッファー (PEB) を調製します。メタノール:1 M 塩酸:クロロホルムを 235:245:15 (vol/vol/vol) の比率で添加し、低相洗浄バッファー (LPWS) を調製します。誘導体化後の洗浄液を調製するには、クロロホルム:メタノール:水を8:4:3(vol/vol/vol)の比率で添加します。
    注:MSグレードの溶剤と化学薬品を使用してください。PEBおよびLPWSバッファーを3か月以上保管しないでください。
  3. ホスホイノシチド、PI4P、PI(4,5)P2 にはC4(1.7 μm x 1 mm x 100 mm)カラムを、PA、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジルイノシトール(PI)にはC18カラム(1.0 mm x 100 mm x 1.7 mm)を使用します。NPLC-MRM-EPI法では、シリカカラム(1 mm x 150 mm x 3 μm)を使用します。
  4. 溶離液Aは、ヘキサン:イソプロピルアルコール:100 mM酢酸アンモニウム水溶液を68:30:2(vol/vol/vol)比で添加し、溶離液Bは、ヘキサン:イソプロピルアルコール:100 mM酢酸アンモニウム水溶液を70:20:10(vol/vol/vol)比でPA、PC、PIに添加して調製します。ホスホイノシチド用の溶媒Aを調製するには、0.1%ギ酸を水に添加し、溶媒Bはアセトニトリルに0.1%ギ酸を添加します。

2.組織の分離

  1. 二酸化炭素(CO2)麻酔を使用してサンプルごとに10匹のハエを収集し(ハエは数秒以内に動けなくなります)、CO2 麻酔プレートの鋭利な刃を使用してハエの首を切り落とします。
  2. 定義された年齢(12〜24時間齢)の暗いまたは明るい適応したハエを1.5mLチューブに収集し、液体窒素で急速冷凍します。ハエをガラスバイアル35で-80°Cで48時間アセトンで脱水します。網膜組織の場合は、凍結乾燥したハエから100個の網膜を収集します。メスを使用して、頭の残りの部分から目を取り除き、網膜をすくい取ります。
  3. ホスホイノシチドPI4PおよびPI(4,5)P2 分析では、新鮮なレチネで作業する場合は、適切な照明条件下で成長したハエからサンプルあたり25レチネを使用して、照明中の脂質レベルを測定し、光なしで成長したハエから暗所で脂質レベルを測定します。ホモジナイザーチューブ内の1x PBSを50 μLに入れ、抽出の準備が整うまでドライアイスで保存します。

3. 脂質抽出

注意:クロロホルムは有毒な溶剤であり、本質的に発がん性があります。それは生殖器系に影響を及ぼし、皮膚と目を刺激するものです。この化学物質の取り扱いには注意が必要です。クロロホルムを含むすべての手順は、換気の良い化学フードで実行する必要があります。

  1. PI4PおよびPI(4,5)P2以外のすべてのグリセロリン脂質について
    1. 各サンプルについて、0.1 mL の 0.1 N 氷冷メタノール酸 HCl と 30 μL の内部標準混合物 (PA (17:0/14:1)、PC (17:0/14:1)、リゾホスファチジン酸 (LPA; 13:0)、リゾホスファチジルコリン (LPC; 13:0)、LPC (17:1)、PA (17:0/17:0)、PA (16:0-D31/18:1)、LPA (17:1)、LPC (19:0)、PI (12:0/13:0)、 PA (12:0/13:0)、PC (12:0/13:0)) です。脂質標準液の最終量が質量分析計の線形応答曲線内に収まるように標準試料を調製します。
    2. 自動ホモジナイザーを使用して組織を均質化し、すべてのサンプルを迅速かつ同時に処理できます。卓上遠心分離機でチューブを短時間回転させ、ペレットが形成されないようにします-これは完全な均質化を示しています。メタノールホモジネートを2mLのキャップ付きマイクロ遠心チューブに移します。
    3. 0.2 mLの氷冷した0.1 NメタノールHClを添加してチューブ内の残留物質を回収し、2 mLチューブで結合します。0.1 mLの0.1 N氷冷メタノール酸HClを加え、続いて0.8 mLのクロロホルムを加え、よく混合します。組織ホモジネートを含む混合物を氷上に10分間放置し、0.4mLの0.88%KClを加え、ボルテックスを30秒間加えます。
    4. 混合物を1,000 x g で4°Cで10分間遠心分離し、水相と有機相を分離します。水相と混合せずに、脂質を含む下部有機相を非常に慎重に取り出し、新鮮な2 mLの微量遠心チューブに移します。
      注:脂質抽出中は、下流の脂質分析を妨げる可能性のある水相との混合を避けるために、細心の注意を払って下部有機相を移してください。
    5. この脂質溶液を真空蒸発器で4°Cで乾燥させ、サンプルを目視検査して完全に乾燥させます。分析のために、2:1メタノール:クロロホルム混合物420 μLに再懸濁します。サンプルを保管せずにすぐに分析できます。
  2. ホスホイノシチドPI4PおよびPI(4,5)P2の場合
    1. 950 μL のホスホイノシチド溶出バッファー (PEB; 250 mL の CHCl3、500 mL のメタノール、200 mL の 2.4 M HCl) で 25 レチネをホモジナイズし、内部標準 (ホスファチジルエタノールアミン (PE) 17:0/14:1;PI (17:0/14:1);PI4P (17:0/20:4);およびサンプルあたり50 ngのPI、25 ngのPI4P、50 ngのPI(4,5)P2、および0.2 ngのPEを含むPI(4,5)P2(16:0/16:0))混合物。
    2. クロロホルムと2.4M HClをそれぞれ250μL加えた後、2分間超音波処理し、1,000 x g で4°Cで5分間遠心分離して相分離します。下部有機相を新しいチューブに取り出し、900 μLのLPWSで洗浄し、1,000 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
    3. ステップ3.2.2のように相分離を再度実行することにより、残りの水相から脂質を抽出します。採取した有機相を4°Cに設定した真空遠心分離機で乾燥させ、サンプルを目視検査して完全に乾燥させます。

4. 有機リン酸塩アッセイ

  1. 7.34 mM KH2PO4のストック溶液を作成します。 表1に従って、蒸留水を使用して、マイクロ遠心チューブで標準希釈を行います。チューブを軽くボルテックスし、標準希釈液をリン酸塩を含まないガラスチューブに移します。
  2. 脂質サンプルを含むガラス管のセットを別途調製します。630 nmでの吸光度(このプロトコルの完了後)が標準KH2PO4 (0〜20倍)の範囲に収まるように、脂質サンプルの量を最適化します。
  3. 標準希釈液を含むガラス管を120°Cで加熱し、完全に乾燥させます。脂質サンプルの入ったガラス管(標準KH2PO4の範囲内で吸光度を得るために必要な全サンプル量の1/8を採取)を90°Cで加熱し、完全に乾燥させます。
  4. 50 μLの70%過塩素酸をすべてのチューブに加え、180°Cで30分間加熱します。チューブを室温まで冷却します。各チューブに250 μLの水、50 μLの2.5%モリブデン酸アンモニウム、50 μLの10%アスコルビン酸を加えます。
    注:2.5%モリブデン酸アンモニウムと10%アスコルビン酸は重量/vol濃度です。.それらは作りたてである必要があり、4°Cで最大1週間保存できます。
  5. チューブを37°Cの振とうインキュベーターに1時間保管します。130 μLのサンプルを96ウェルプレートに分注し、分光光度計を使用して630 nmでの吸光度を測定します。

5. 誘導体化

注意:トリメチルシリルジアゾメタン(TMSD)は、ヒトに多くの毒物学的影響を与えると報告されています。溶液中のTMSDは、腎臓、肝臓、消化管、骨格筋、中枢神経系、呼吸器系および生殖器系を対象としています。この化学物質を取り扱う際には、細心の注意を払う必要があります。すべてのプロセスは、換気の良い化学フードで実行する必要があります。

  1. ステップ3.2.3の終了から得られたサンプルの下部有機相に、50 μLの2 M TMSDを加えます。反応を室温で10分間進行させ、250rpmで一定に振とうします。10分後、10 μLの氷酢酸を加えて反応を急冷しますが、これは溶液中の黄色の消失によって示されます。
  2. チューブを軽くたたいて慎重に開き、クエンチング反応で形成されたN2 を取り除きます。N2 ガスが逃げた後、チューブを閉じてスピンダウンします。次に、誘導体化後の洗浄液600μLを加え、ミキサーで250rpmで2分間ボルテックスします。
  3. 形成される上層相から~400μLを廃棄します。手順5.2を繰り返します。上相全体を捨て、下相に50μLの90%メタノールを加えて混合します。
  4. 真空中で800 x g の遠心濃縮器でサンプルを2時間乾燥させます。乾燥後、チューブには~20 μLの残りのサンプルが含まれている必要があります。100%メタノール180μLを加えてよく混合し、LC-MS / MSの前に最大2〜3日間4°Cで保存します。

6. データの取得と分析

  1. 直接注入MS(DIMS)でのデータ収集
    注:MSは、直接注入または液体クロマトグラフィーMS(LC-MS)法のいずれかで行うことができます。このセクションでは、直接注入ベースのMSについて説明します。
    1. 実験を開始する前に、製造元の指示に従って質量分析計を校正してください。
    2. 希釈シリーズの合成標準の線形応答曲線を生成し、装置の線形応答に基づいて、脂質分析物の強度が装置の直線性内に収まるようにサンプルを希釈します。全脂質抽出物または脂質標準試料を2:1メタノール:クロロホルム(vol/vol)の混合物で希釈します。各実験について、総脂質抽出物と合成標準の希釈度を個別に選択してください。
    3. 抽出物と標準試料を個々のバイアルに移します。MSのサンプルバイアルにサンプルを移す際には気泡を避けてください。
    4. 分析に先立ち、サンプルを6,440 x g で9分間遠心分離し、96ウェルプレートにロードしてアルミホイルでシールします。
    5. 高分解能質量分析計で、直接注入法を用いてMS分析を行います。直径4.1μmのスプレーノズル付きチップを用いたロボットナノフローイオン源により、グリセロリン脂質のESIによる安定なイオン化を実現します。
    6. カスタム質量分析計ソフトウェアを使用してイオン源を制御し、イオン化電圧を正と負のモードでそれぞれ+1.2kVと-1kVに設定します。両方のモードで1psiの背圧。イオン移動キャピラリーの温度は180°Cです。 質量分解能Rm/z400 = 100,000で取得します。質量分析計のパラメータを設定するためのソフトウェアインターフェースについては、 図2A を参照してください。
    7. 乾燥した全脂質抽出物を400 μLのクロロホルム:メタノール(1:2)に再溶解します。分析では、60 μLのサンプルを96ウェルプレートイオン源にロードし、アルミホイルでシールします。各サンプルをポジティブイオンモードで 20 分間分析し、PC、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、PE-O(エーテル結合ホスファチジルエタノールアミン)、セラミド(Cer)、およびリン酸セラミド(Cer-P)を検出します。
    8. マイナスイオンモードで20分間、PAとPIを検出した独立した取得を行います。高分解能 MS のデータ取得のための装置セットアップの具体的な詳細と、データ依存性取得(DDA)セットアップに含まれる PA 分子種のターゲットリストについては、 図 2B を参照してください。
      メモ: DDA メソッドを設定するためのソフトウェアインターフェースを 図 2C に示します。このアプローチで標的とするPA分子のリストを 表2に示します。DDAアプローチの実験結果のスクリーンショットを 図2Dに示します。
  2. 直接注入MS(DIMS)でのデータ分析
    注:すべてのタイプの質量分析計で生成された質量データの分析には、自動脂質分析プラットフォームが必要です。LipidXplorer36 は、あらゆるタイプのDIMMS脂質実験をサポートする非商用ソフトウェアです。このソフトウェアはここにあります:https://www.mpi-cbg.de/research-groups/current-groups/andrej-shevchenko/projects/lipidxplorer/
    1. ステップ6.1で説明した方法を使用してデータを取得したら、脂質分析プラットフォームを使用して、モノアイソトピックピークの m/z を対応する元素組成制約に一致させることにより、脂質種を同定します。データ・インポートの例を 図 3A に示します。質量許容誤差を10ppmに設定し、質量分析計ソフトウェアによって報告されたノイズレベルに応じて強度しきい値を設定します。
    2. インポート後、 図 3B に示すように、PA の化学構造に基づいて PA の Molecular Fragmentation Query Language (MFQL) クエリをコンパイルします。脂質分析プラットフォームで設定された MFQL については、 図 3C を参照してください。
    3. 同様のアプローチを使用して、脂質分析プラットフォームソフトウェアで他のグリセロリン脂質の MFQL をコンパイルします。各クエリは 1 つの脂質クラスを対象としており、1 回の実行で多数のクエリを使用できます。
    4. [ 実行 ] ボタンをクリックして、すべての MFQL を実行します。同定されたすべての脂質分子種は、その後の脂質定量のために、対応するプリカーサーイオンおよび/またはフラグメントイオンの存在量とともに、.csvファイル形式の単一の結果ファイルで報告されます。出力の例を 表 3 に示します。

7. 誘導体化サンプルの液体クロマトグラフィーおよびタンデムMS

  1. ステップ5.4で得られたサンプルを、超高速液体クロマトグラフィーシステムを用いた液体クロマトグラフィーで分離します。このシステムを選択する際には、そのソフトウェアが分析に使用される質量分析計のソフトウェアと統合できることを確認してください。
  2. システムをトリプル四重極質量分析計に接続します。分離列を選択します。PI4P と PI(4,5)P2 以外の脂質の分離には、C18 カラム(1.0 mm x 100 mm x 1.7 mm)をお選びください。PI4P および PI(4,5)P2 の場合、寸法 300 Å (1.0 mm x 100 mm x 1.7 μm) の C4 カラムを選択します。
  3. ギ酸アンモニウムを含む移動相を調製するには、まずギ酸アンモニウムを質量分析グレードの水に溶解し、次に有機溶媒に溶解します。質量分析で使用されるすべての溶媒を20分間超音波処理して、気泡を除去します。
  4. 水 + 0.1% ギ酸を含む溶液 A とアセトニトリル + 0.1% ギ酸を含む溶液 B を注入して、カラムを平衡化します。
  5. 液体クロマトグラフィーシステムからの溶出液(注入量が1〜20 μLの範囲)を質量分析計に注入して分析します。流速を0.1 mL/min、カラムの温度を室温に設定します。カラムから出ている溶出量全体を質量分析計に注入します。
  6. サンプル注入シーケンスでは、常にブランク溶媒注入(メタノール)から開始し、質量分析分析の品質管理チェック(6回目ごと)のために、生物学的サンプルの間に標準サンプルを断続的に保持します。
  7. ハイブリッド トリプル四重極イオントラップ質量分析計の実験セットアップでは、実験を開始する前に、製造元の指示に従って質量分析計を校正してください。PA、PC、およびPIの場合、エレクトロスプレーイオン化(ESI)を使用してイオンを生成し、ポジティブモードで動作して正に帯電した脂質種を検出します。データを取得し、システムにインストールされているデータ分析ソフトウェアを使用して分析します。
  8. 使用する対応する内部標準に従って、分析用のパラメータを最適化します。質量分析計のパラメータは次のとおりです:滞留時間= 30ミリ秒;CAD(衝突活性化解離)= 3 psi;GS1(原ガス1)= 24 psiおよびGS2(原ガス2)= 21 psi;CUR(カーテンガス)= 30 psi;IS(ESI電圧)= 4.5kV;TEM(ソース温度)= 450°C。
  9. PI4PおよびPI(4,5)P2の場合、質量分析計をポジティブモードで使用します。質量分析計のパラメータは次のとおりです:滞留時間= 65ミリ秒;CAD(衝突活性化解離)= 2 psi;GS1(原ガス1)およびGS2(原ガス2)= 20 psi;CUR(カーテンガス)= 37 psi;IS(ESI電圧)= 5.2 kV;TEM(ソース温度)= 350°C。

8.順相液体クロマトグラフィー-多重反応モニタリング-強化製品イオンスキャンMS(NPLC-MRM-EPI MS)

  1. クロマトグラフィー条件
    1. シリカカラムを用いた順相LC法により、PAを他のリン脂質から分離することができます。移動相Aとしてヘキサン:イソプロピルアルコール:100 mMの水溶液NH4COOHを68:30:2の比率で使用し、イソプロピルアルコール:ヘキサン:100 mMのNH4COOHを70:20:10の比率で移動相Bとして使用します。
      注:この組み合わせにより、PA の異なる分子種に対して最高の分離とピーク選択性が得られました。
    2. 参照化合物(内部標準)の分離能とピーク形状の点から見たクロマトグラフィーの挙動を利用して、最適な条件を選択します。
    3. 順相シリカカラム(1 mm × 150 mm × 3 μm)の室温で、超高速液体クロマトグラフィーカラムでクロマトグラフィー分離を行います。オートサンプラーの注入量を 6 μL に、溶離液の流量を 210 μL/min に設定します。
    4. 移動相 A を 100% で 5 分間平衡化した後、移動相 B を 5 分間で 30% まで、さらに 5 分間で 80% まで、さらに 5 分間で 100% まで直線的に増加させ、100% で 5 分間一定に保ちます。最後に、カラムを9分間再平衡化します。
  2. 質量分析
    1. ネガティブESIモードで動作するハイブリッドトリプル四重極イオントラップ質量分析計を使用します。付属の解析ソフトウェアを使用して、システムの動作とデータ取得を制御します。実験を開始する前に、製造元の指示に従って質量分析計を校正してください。
    2. 内部標準混合物のフローインジェクション解析を使用して、ソースパラメータを最適化します。したがって、イオン噴霧電圧 = -4.5 kV、ソース温度 (TEM) = 450 °C、衝突活性化解離ガス (CAD) = 3 psi に設定します。衝突ガスとして窒素ガスを使用し、ネブライザーガス(GS1)= 24 psi、補助ガス(GS2)= 21 psi、カーテンガス(CUR)= 30psiに設定します。
    3. 化合物依存性のイオンパスパラメータは、デクラスタリング電位(DP)= -42 V、入口電位(EP)= -6 V、コリジョンセル出口電位(CXP)= -12 Vとして設定し、内部標準混合物溶液の連続注入を使用して最適化します。質量分析計で利用可能なEPIスキャン機能を使用してフラグメンテーション分析のために、12 eVから40 eVまでのさまざまなコリジョンエネルギー(CE)で、製品MRMへの前駆体遷移とともに、完全な製品スペクトルを記録します。
      注:MRMトリガーIDAベースのEPIは、プリカーサーイオン生成物、イオンスキャン、およびオンザフライMS/MS取得を同時に記録します。MRM は四重極 1(Q1)のイオンスキャン範囲を狭め、イオントラップは Q2 を通過するイオンフラグメントを強化したため、四重極 MS/MS の定性能力が大幅に向上しました。これは、特にプリカーサーイオンから生じるすべてのフラグメントの捕捉において、四重極 MS/MS の定性能力が大幅に向上しました。EPIモードでは、プリカーサーイオンから生じる複数のフラグメントイオンがQ3で検出され、S/N比が良好になります。
    4. 39 eVのCEでMRM実験を行い、高感度を実現します。MRM の最大数を 75 ミリ秒、滞留時間を 30 ms に制限して、分析中にクロマトグラフィーカラムから溶出する特定の分子の MRM をいつでも検出および記録します。これにより、機械のデューティサイクルが増加します。
    5. 上記のように、PAに最適なイオン化パラメータを決定するために、実験的なチューニングを行います。この実験では、イオン噴霧電圧 = -4.5 kV、ソース温度 (TEM) = 450 °C、衝突活性化解離ガス (CAD) = 3 psi に設定します。衝突ガスとして窒素ガスを使用します。ネブライザーガス(GS1)= 24 psi、補助ガス(GS2)= 21 psi、およびカーテンガス(CUR)= 30psiを設定します。
    6. すべてのチューニングデータを手動で調べて、イオン化パラメーターと製品イオンが適切に選択されていることを確認します。製品イオンを選択する際には、MRMチャネル間の潜在的な干渉を最小限に抑えることを考慮に入れてください。すべてのPA分子種の分析に使用される実験パラメータを 表4に示します。
      注:ハイブリッドトリプル四重極リニアイオントラップ質量分析計は、MRMスキャンモードとイオントラップスキャン機能を組み合わせることができるため、EPIスキャンなどの方法を利用して、検出された各前駆体の有用なタンデム質量スペクトルを記録することで、高速かつ高スキャンが可能になります。本研究では、PAの異なる分子種を同定するために、従来のトリプル四重極イオンパスに基づくMRM-EPIベースのMS/MSアプローチと、イオントラップのEPIスキャン特性を解析ソフトウェアで制御するアプローチを利用しました。

結果

MSにおける測定の直線性の決定。直線性とは、脂質分析種の濃度に正比例する結果を提供する MS 分析法の能力です。直線性は、(a)脂質分析種のイオン化効率、および(b)異なる濃度での脂質分析種のイオン化挙動は、使用するイオン源に依存します。この研究で使用したエレクトロスプレーイオン化(ESI)では、(a)ESIソースから質量分析器へのイオン輸送、(b...

ディスカッション

多くの証拠は、ショウジョウバエの光受容体の組織と機能の調節におけるシグナル伝達脂質の複数の役割に収束しています。光伝達3の調節における脂質のよく研究された役割に加えて、シグナル伝達脂質は、タンパク質輸送および細胞内組織化にも関与している23,30,39,40,41。

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この原稿に記載されている作業は、インド政府原子力省(Project Identification No.RTI 4006)、バイオテクノロジー省、インド政府(BT / PR4833 / MED / 30/744/2012)およびインドアライアンスシニアフェローシップ(IA / S / 14/2/501540)にPRします。NCBS質量分析施設、特にDhananjay Shinde博士とPRラボのメンバーの皆様には、これらのメソッドの開発に貢献していただいたことに感謝いたします。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1 N methanolic HCLFor total lipid isolation
0.88% KClSigma AldrichP9541For total lipid isolation
1.5 ml / 2ml LoBind Eppendorf tubesEppendorf,022431081/022431102For total lipid isolation
2.3.18 16:0/18:1 Diether PEAvanti polar lipids999974Lipid Internal Standard
37% pure HClSigma Aldrich320331For total lipid isolation
96-well plateTotal Organic Phosphate assay
AcetoneFisher Scientific32005For dissections
Ammonium molybdateTotal Organic Phosphate assay
Ascorbic AcidTotal Organic Phosphate assay
Bath sonicator
BEH300 C18 column [1.0 mm x 100mm x 1.7 mm]Waters India Pvt. Ltd.186002352LC
Blade holderFine Scientific Tools10052-11For dissections
BOD incubatorTotal Organic Phosphate assay
Breakable bladesFine Scientific tools10050-00For dissections
Butter paperGE healthcare10347671For dissections
C4, 300 A0, [1.7 μm x1 mm x 100 mm] columnWaters India Pvt. Ltd.186004623LC
Chromatography amber color glass vials with insertsMerck27083-U
d18:1/17:0)Avanti polar lipids860517Lipid Internal Standard
d5-Phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate [PI(3,5)P2]-16:0/16:0Avanti polar lipids850172Lipid Internal Standard
Dissecting microscopesOlympusSZ51For dissections
Dry heat bath.
Eluent AHexane:Isopropyl alcohol:100 mM aqueous ammonium acetate (68:30:2) , for LC
Eluent BHexane:Isopropyl alcohol:100 mM aqueous ammonium acetate (70:20:10), for LC
Filter paperIndica-HM274039For dissections
FlasksBorosilFor dissections
FliesNANARaghu Padinjat lab
Fly foodNANANCBS lab kitchen, composition: corn flour 80 g/L, D-glucose 20 g/L, sucrose 40 g/L, agar 8 g/L, yeast extract 15 g/L, propionic acid 4 mL, TEGO (methyl para hydroxybenzoate) 0.7 g/L, orthophosphoric acid 0.6 mL)
ForcepsFine Scientific Tools11254-20For dissections
Fume hood
FunnelBorosilFor dissections
Glacial acetic acidFisher ScientificA35-500For derivatization
Glass bottles: transparent and amber colorFor total lipid isolation
High-temperature-resistant phosphate-free glass tubes.Total Organic Phosphate assay
Homogenization tubes with zirconium oxide beadsFor total lipid isolation
Homogenizer instrumentPrecellys
Humidified CO2 connected to fly padsFor fly pushing
Illumination controlled incubatorsPanasonic SanyoMIR-553For fly rearing
Initial organic mixturemethanol:chloroform (2:1), For total lipid isolation
LC-MS grade ChloroformSigma Aldrich650498For total lipid isolation
LC-MS grade MethanolSigma Aldrich34860For total lipid isolation
LC-MS grade waterSigma Aldrich34877For total lipid isolation
Light meterHTC instrumentsLX-103
Low retention tipsEppendorf0030072006/72014/72022/72030For total lipid isolation
LTQ Orbitrap XL instrumentThermo Fisher Scientific, Bremen, Germany
Lysophosphatidic acid (LPA)- 13:0Avanti polar lipidsLM-1700Lipid Internal Standard
Lysophosphatidic acid (LPA)- 17:1Avanti polar lipidsLM 1701Lipid Internal Standard
Lysophosphatidylcholine (LPC) -13:0Avanti polar lipidsLM-1600Lipid Internal Standard
Lysophosphatidylcholine (LPC) -17:1Avanti polar lipids855677Lipid Internal Standard
Lysophosphatidylcholine (LPC)- 19:0Avanti polar lipids855776Lipid Internal Standard
Perchloric acid.Total Organic Phosphate assay
Phosphate standard potassium dihydrogen phosphateTotal Organic Phosphate assay
Phosphate-buffered saline (PBS)NANAComposition: 137mMNaCl, 2.7mM KCl, 10 mM Na2HPO4, and 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4
Phosphatidic acid (PA)- 12:0/13:0Avanti polar lipids, LM-1400 Lipid Internal Standard
Phosphatidic acid (PA)- 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1404Lipid Internal Standard
Phosphatidic acid (PA)-(17:0/17:0)Avanti polar lipids830856Lipid Internal Standard
Phosphatidic acid (PA)-16:0-D31/18:1Avanti polar lipids860453Lipid Internal Standard
Phosphatidylcholine (PC) -12:0/13:0Avanti polar lipidsLM-1000Lipid Internal Standard
Phosphatidylcholine (PC)- 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1004Lipid Internal Standard
Phosphatidylethanolamine (PE) - 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-110Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol (PI) - 17:0/14:1Avanti polar lipidsLM-1504Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4Avanti polar lipidsLM-1904Lipid Internal Standard
Phosphatidylinositol 4-phosphate (PI4P) - 17:0/20:4Avanti polar lipidsLM-1901Lipid Internal Standard
Robotic nanoflow ion sourceTriVersa NanoMate (Advion BioSciences, Ithaca, NY, USA)
Rotospin instrumentTarsons3090X
Silicone padsFor dissections
solvent A0.1% formic acid in water, for LC
solvent B0.1% formic acid in acetonitrile, for LC
Table-top centrifuge
Thermo-mixer
TMS-diazomethaneAcrosAC385330050For derivatization
Triple quadrupole mass spectrometerAB SciexQTRAP 6500
UPLC systemWaters Acquity
Vacuum centrifugal concentratorScanvac , Labogene
Vortex machine

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