11.18 : Cromatografia Líquida de Alto Desempenho: Processo de Eluição

Na Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC), o processo de eluição é crítico para a separação dos analitos e a qualidade dos resultados cromatográficos. A eluição descreve como os compostos se movem pela coluna e se separam com base em suas interações com as fases móvel e estacionária. Este processo determina a resolução, o formato do pico e os tempos de retenção no cromatograma, que são essenciais para identificar e quantificar componentes em misturas complexas. Entender o processo de eluição ajuda a interpretar dados cromatográficos e a melhorar a eficiência da separação.

A HPLC utiliza solventes de grau HPLC altamente puros para garantir interferência mínima de impurezas. Solventes de alto grau são essenciais porque até mesmo quantidades vestigiais de contaminantes podem interferir no processo de eluição, distorcer os picos do cromatograma e reduzir a sensibilidade durante a detecção da amostra. Além disso, os solventes podem conter gases dissolvidos, como nitrogênio e oxigênio, que também podem interferir na detecção da amostra. A desgaseificação é empregada para eliminar esses gases, usando uma bomba de vácuo ou purga com gás hélio, para manter a integridade dos processos de separação e detecção.

Os solventes desgaseificados são então puxados do reservatório de fase móvel por uma bomba de alta pressão, sendo a bomba reciprocante o tipo mais comumente usado. A bomba consiste em um pistão e duas válvulas de retenção, que puxam o solvente usando o movimento de vaivém do pistão. No entanto, uma desvantagem da bomba reciprocante é que ela produz um fluxo de solvente pulsado. Portanto, os sistemas HPLC modernos têm um amortecedor de pulso conectado à bomba para resolver esse problema. Outras bombas, como bombas de deslocamento acionadas por parafuso, estão disponíveis, mas podem ter limitações, como menor capacidade de solvente e pouca capacidade de suporte à pressão, o que as torna menos convenientes para trocas de solvente.

Existem dois tipos de processos de eluição: eluição isocrática e gradiente. A eluição isocrática utiliza um único solvente ou fase móvel, durante a separação, enquanto a eluição gradiente envolve uma mudança na composição durante o processo de separação. Este método melhora a eficiência da separação, reduz o tempo de análise e melhora a resolução, levando a picos mais nítidos no cromatograma. A eluição de gradiente fornece melhor resolução e resulta em picos mais distintos e separados, facilitando a interpretação do cromatograma para misturas complexas em comparação à eluição isocrática.

Antes que a fase móvel entre na coluna, a amostra é introduzida usando um injetor de loop com uma válvula de duas posições. A válvula ajuda a direcionar a fase móvel para a coluna. Devido à alta pressão na HPLC, a injeção de amostra não pode ser realizada como na cromatografia gasosa (GC). Loops de amostragem, com volumes fixos variando de 0,5 microlitros a 2 mililitros, podem ser intercambiáveis.