11.18 : כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה: תהליך האילוציה

כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) מתבססת על תהליך האילוציה, אשר מהווה גורם מרכזי בהפרדת אנליטים ואיכות תוצאות הכרומטוגרפיה. תהליך האילוציה מתאר כיצד תרכובות נעות דרך העמודה ומופרדות בהתאם לאינטראקציות שלהן עם הפאזות הניידת והנייחת. תהליך זה קובע את הרזולוציה, צורת השיאים וזמני השהייה בכרומטוגרמה, ומשמש לזיהוי וכימות מרכיבים בתערובות מורכבות. הבנת תהליך האילוציה מסייעת בפענוח נתוני כרומטוגרפיה ובשיפור יעילות ההפרדה.

ב-HPLC נעשה שימוש בממסים בדרגת ניקיון גבוהה (HPLC-grade) להבטחת הפרעה מינימלית מזיהומים. ממסים בדרגה גבוהה חיוניים מכיוון שאפילו כמות זעירה של מזהמים עלולה להפריע לתהליך האילוציה, לעוות את שיאי הכרומטוגרמה ולפגוע ברגישות בזיהוי הדגימה. בנוסף, ממסים עשויים להכיל גזים מומסים, כגון חנקן וחמצן, שעלולים להפריע לזיהוי הדגימה. תהליך הסרת גז (Degassing) משמש להסרת גזים אלו באמצעות משאבת ואקום או העברת גז הליום, לשמירה על תקינות תהליכי ההפרדה והזיהוי.

לאחר מכן, ממסים שעברו הסרת גז נשאבים ממאגר הפאזה הניידת על ידי משאבת לחץ גבוה, כאשר המשאבה ההדדית (Reciprocating Pump) היא הנפוצה ביותר. משאבה זו כוללת בוכנה ושסתומים חד-כיווניים, המאפשרים שאיבה בתנועה חוזרת של הבוכנה. עם זאת, חסרונה של המשאבה ההדדית הוא יצירת זרימה פועמת של הממס. לכן, מערכות HPLC מודרניות כוללות בולם פעימות המחובר למשאבה לטיפול בבעיה זו. קיימות גם משאבות אחרות, כמו משאבות בורגיות (Screw-driven displacement pumps), אך יש להן מגבלות, כגון קיבולת ממס נמוכה ויכולת נשיאת לחץ נמוכה, מה שהופך אותן לפחות נוחות לשינויים בממסים.

תהליכי האילוציה מתחלקים לשניים: אילוציה איזוקרטית (Isocratic Elution) ואילוציה גרדיאנטית (Gradient Elution). אילוציה איזוקרטית עושה שימוש בממס יחיד או פאזה ניידת יחידה לאורך כל ההפרדה, בעוד אילוציה גרדיאנטית כוללת שינוי בהרכב במהלך תהליך ההפרדה. שיטה זו משפרת את יעילות ההפרדה, מקצרת את זמן הניתוח ומשפרת את הרזולוציה, מה שמוביל לשיאים חדים יותר בכרומטוגרמה. אילוציה גרדיאנטית מספקת רזולוציה טובה יותר ותוצאות ברורות יותר, מה שמקל על פענוח הכרומטוגרמה עבור תערובות מורכבות בהשוואה לאילוציה איזוקרטית.

לפני כניסת הפאזה הניידת לעמודה, הדגימה מוזרקת באמצעות מזרק לולאה עם שסתום דו-מצבי. השסתום מאפשר ניתוב של הפאזה הניידת לעמודה. בשל הלחץ הגבוה ב-HPLC, הזרקת דגימות אינה יכולה להתבצע באותו אופן כמו בכרומטוגרפיה גזית (GC). לולאות הדגימה, בעלות נפחים קבועים הנעים בין 0.5 מיקרוליטר ל-2 מיליליטר, ניתנות להחלפה.