우리는 적혈구 항체의 중요성을 예측하는 데 사용할 수 있는 최선의 방법을 결정하기 위해 노력하고 있습니다. 단핵구-대식세포 분석법은 단핵구 단층 분석법보다 민감도가 높은 것으로 보입니다. 따라서 우리가 대답하려고 하는 질문은 단핵구-대식세포 분석법이 단핵구 단층 분석법보다 적혈구 항체의 유의성을 예측하는 데 더 나은 분석법인지 여부입니다.
단핵구 단층 분석법과 단핵구-대식세포 분석법의 실험적 과제는 효율성을 최적화하여 더 빠른 완료를 가능하게 하는 동시에 수동 식세포작용 평가의 필요성을 없애는 것입니다. 즉, 문제는 이러한 분석을 반자동화하는 것입니다. 제가 1980년에 처음 개발한 단핵구 단층 분석법은 1983년부터 면역혈액학 참조 실험실에서 일상적으로 사용되어 기증자의 혈액이 이러한 항체를 가진 환자에게 수혈될 때 용혈을 유발할 가능성이 있는 적혈구 자동 또는 동종 항체를 결정하는 데 도움을 주고 있습니다.
따라서 MMA는 분석에서 단핵구를 사용하지만 항체 매개 용혈은 일반적으로 비장이나 간의 대식세포에 의해 발생합니다. 따라서 여기에서 우리는 이 분석에서 1차 대식세포를 사용하는 것이 잠재적인 항체 임상적 중요성의 예측 인자로서 단핵구보다 더 나은지 여부를 탐구하고 있습니다. 단핵구-대식세포 분석을 보다 사용자 친화적이고 빠르며 광학 현미경이 필요하지 않게 만들려고 노력하는 것이 좋지만, 식세포작용을 판독하기 위한 자동화된 메커니즘이 바람직할 수 있습니다.
먼저 RPMI-1640 Complete Medium으로 전혈을 희석하고 원심분리를 위해 밀도 구배 배지에 층을 이룹니다. 원심분리 후 말초 혈액 단핵 세포 또는 PMBC가 포함된 담황색 코트를 회수합니다. 얻어진 PBMC를 펠릿화한 후 10ml의 예열된 RPMI-1640 Complete Medium에 재현탁합니다.
단핵구 분리 프로세스를 시작하기 전에 적절한 장비를 사용하여 세포 수를 결정합니다. 단핵구 분리 키트 지침에 따라 검체를 적절한 크기의 프로필렌 튜브로 옮깁니다. 농축 칵테일을 시료 1밀리리터당 50마이크로리터의 농도로 시료에 첨가합니다.
샘플을 위아래로 피펫팅한 후 와류를 일으켜 완전히 혼합하고 얼음 양동이에서 10분 동안 섭씨 2도에서 8도의 샘플을 배양합니다. 이제이 잠복기 동안 30 초 동안 자성 입자를 소용돌이칩니다. 배양 후, 시료 1밀리리터당 100마이크로리터의 농도로 시료에 자성 입자를 첨가합니다.
샘플을 소용돌이치고 섭씨 2도에서 8도에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 등급이 매겨진 피펫을 사용하여 필요에 따라 분리 매체를 추가하여 부피를 2.5ml 또는 10ml로 채우고 혼합합니다. 다음으로 뚜껑이 없는 프로필렌 튜브를 자석에 넣고 실온에서 약 2.5분 동안 배양합니다.
그런 다음 자석을 집어 들고 한 번의 연속 동작으로 뒤집어 셀 현탁액을 새로운 5 또는 14 밀리리터 튜브에 붓습니다. 분리된 세포를 RPMI-1640 배지에 재현탁시킵니다. 먼저 각 대식세포 집단(M1 및 M2)에 대해 25ml 플라스크에 5ml의 poly-D-lycine 용액을 추가하고 플라스크를 후드에 최소 1시간 동안 그대로 둡니다.
세포 수를 결정한 후 RPMI-1640 배지 5ml를 첨가한 다음 사전 코딩된 각 25ml 플라스크에 6개의 단핵구의 10배를 1-5회 시딩합니다. 섭씨 37도에서 플라스크를 5% 이산화탄소로 최소 2시간 동안 배양합니다. 배양 기간이 끝나면 PBS로 플라스크를 한 번, 완전한 RPMI-1640 배지로 두 번 세척합니다.
원하는 세포 유형에 따라 플라스크에 10ml의 M1 또는 M2 분화 배지를 추가하고 세포가 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 6일 동안 인큐베이터에서 분화되도록 합니다. 6일차에 필요에 따라 각 플라스크에 5ml의 M1 또는 M2 편광 배지를 추가합니다. 대식세포가 섭씨 37도의 인큐베이터에서 최소 이틀 동안 5%의 이산화탄소로 분극화되도록 합니다.
8일째에 M1 또는 M2 대식세포를 채취하기 전에 필요한 경우 나중에 사용할 수 있도록 상층액을 15ml 튜브에 수집합니다. 플라스크에 1ml의 세포 박리 용액을 넣고 배양합니다. 반응을 중지하려면 플라스크에 3ml의 완전한 RPMI-1640 배지를 추가하고 배지를 15ml 튜브에 수집합니다.
플라스크에 3ml의 배지를 더 첨가한 후 세포 스크레이퍼를 사용하여 바닥에서 세포를 분리합니다. 분리된 세포를 15밀리리터의 새 튜브에 모읍니다. M1 및 M2 대식세포의 품질을 측정하려면 PBS로 세포를 두 번 세척하고 튜브당 6개의 세포의 10배로 0.5배의 완전한 RPMI-1640 배지에 재현탁합니다.
그런 다음 유세포 분석 분석을 사용하여 두 세포 집단을 분석합니다. 얻어진 M1 및 M2 대식세포를 혈구계를 사용하여 트리판 블루와 일대일 염색 비율로 계수합니다. RPMI-1640 Complete Medium에서 대식세포를 1 곱하기 10의 농도로 1640 Complete Medium에서 밀리리터당 6개 세포의 거듭제곱으로 재구성합니다.
마이크로 피펫을 사용하여 8개의 웰 챔버 슬라이드의 각 웰에 400마이크로리터의 세포 현탁액을 파종하고 완전히 가습된 조직 배양 인큐베이터에서 최소 1.5시간 동안 5%의 이산화탄소와 함께 섭씨 37도의 슬라이드를 배양합니다. RhD 양성 R2R2 적혈구를 세척하려면 pH 7.4의 PBS를 세포에 첨가하고 350G에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 이러한 세척을 두 번 더 한 후 테스트 RBC 샘플을 관심 항체로 opsonize합니다.
항체 옵소니화 및 비옵소니화 적혈구를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 1시간 동안 배양합니다. 적혈구가 가라앉는 것을 방지하기 위해 15분마다 간헐적으로 소용돌이칩니다. 그런 다음 앞에서 설명한 바와 같이 pH 7.4에서 PBS로 opsonize RBC를 세 번 세척합니다.
RBC 옵소니화를 확인하기 위해 1차 옵소니징 항체에 대한 2차 옵소니징 항인간 항체로 간접 항글로불린 검사를 수행합니다. 간접 항글로불린 테스트를 읽은 후, RPMI-1640 Complete Medium을 사용하여 세척된 옵소니제이드 RHD와 R2R2 적혈구를 1.25% 부피 현탁액으로 재구성합니다. M1 및 M2 대식세포를 1.5시간 동안 배양한 후 웰 모서리를 따라 상층액을 흡인하고 부드럽게 버립니다.
그런 다음 1.25%opsonized RBC 혼합물 400마이크로리터를 3중 설정의 각 웰에 추가합니다. 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소를 넣은 샘플을 방해받지 않고 2시간 동안 배양합니다. 이제 pH 7.4에서 PBS 100ml를 두 개의 비커에 붓습니다.
슬라이드를 첫 번째 비커에 담그고 20-30회 스트로크 동안 천천히 앞뒤로 움직입니다. 그런 다음 슬라이드를 두 번째 비커로 옮기고 20-30회 세척합니다. PBS에서 슬라이드를 제거하고 종이 타월에 묻은 여분의 액체를 가볍게 두드려냅니다.
슬라이드를 100% 메탄올에 45초 동안 담궈 세포를 고정합니다. 슬라이드를 자연 건조시키고 사내에서 준비한 장착 매체를 사용하여 장착합니다. 커버 슬립을 추가하고 식세포작용의 정량화 전에 슬라이드를 밤새 건조시킵니다.
M1 및 M2 대식세포는 현미경 이미지에서 관찰된 뚜렷한 형태학적 특징과 함께 8일 동안 성공적으로 분극 및 배양되었습니다. 유세포 분석에서 M1 대식세포는 CD80의 약 86.1%, CD209의 0.17% 발현을 나타냈습니다. M2 대식세포는 CD209 발현의 97.3%와 CD80 발현의 0.003%를 나타냈습니다.
형광 강도의 히스토그램은 M2 대식세포에 비해 M1 대식세포에서 더 높은 CD80 발현을 확인했습니다. M2 대식세포는 M1 대식세포에 비해 CD209 발현이 현저히 높았습니다. M2 대식세포는 M1 대식세포에 비해 유의하게 높은 식세포 지수를 보여주었습니다.
현미경 이미지는 M1 대식세포에 비해 M2 대식세포에서 식세포작용이 증가했다는 명확한 증거를 보여주었습니다. 본 연구는 적혈구 항체의 유의성을 예측하기 위해 단핵구 대신 대식세포를 사용할 수 있는 가능성을 평가하는 것을 목표로 했습니다. 이 표는 M2 대식세포가 M1 대식세포 또는 단핵구보다 식세포가 더 우수하며, 항체가 임상적으로 유의한 것으로 간주됨을 보여줍니다.
따라서, 추가 연구를 통해 M2 대식세포를 사용하는 분석법은 항체의 임상적 유의성을 더 잘 예측하는 데 사용될 수 있습니다.
