私たちは、赤血球抗体の意義を予測するために使用する最適な方法を決定しようとしています。単球マクロファージアッセイは、単球単層アッセイよりも感度が高いようです。したがって、私たちが答えようとしている問題は、単球マクロファージアッセイが赤血球抗体の意義を予測するためのより優れたアッセイであり、単球単層アッセイよりも優れているかどうかです。
単球単層アッセイと単球マクロファージアッセイの両方における実験上の課題は、その効率を最適化して、より迅速な完了を可能にすると同時に、手動の食作用評価の必要性を排除することです。言い換えれば、課題はこれらのアッセイを半自動化しようとすることです。私が1980年に実際に開拓した単球単層アッセイは、1983年以来、免疫血液学リファレンスラボで日常的に使用されており、ドナーの血液がこれらの抗体を持つ患者に輸血されたときに、どの赤血球自己抗体または同種抗体が溶血を引き起こす可能性があるかを決定するのに役立てられています。
そのため、MMAはアッセイで単球を使用しますが、抗体媒介性溶血は通常、脾臓または肝臓のマクロファージによって引き起こされます。そこで、ここでは、このアッセイで初代マクロファージを使用することが、潜在的な抗体の臨床的意義の予測因子として単球よりも優れているかどうかを調査しています。単球マクロファージアッセイをより使いやすく、より速く、光学顕微鏡を必要としないように試みることですが、食作用を読み取るための自動化されたメカニズムが望ましいかもしれません。
まず、全血をRPMI-1640コンプリートメディウムで希釈し、密度勾配培地に重ねて遠心分離します。遠心分離後、末梢血単核細胞またはPMBCを含むバフィーコートを回収します。得られたPBMCをペレット化した後、予熱したRPMI-1640コンプリートミディアムの10ミリリットルに再懸濁します。
単球単離プロセスを開始する前に、適切な機器を使用して細胞数を決定します。単球単離キットの指示に従って、サンプルを適切なサイズのプロピレンチューブに移します。濃縮カクテルをサンプルの1ミリリットルあたり50マイクロリットルの濃度でサンプルに加えます。
サンプルをピペッティングで上下した後、ボルテックスして十分に混合し、サンプルを摂氏2〜8度で氷のバケツで10分間インキュベートします。次に、このインキュベーション期間中に磁性粒子を30秒間ボルテックスします。インキュベーション後、磁性粒子をサンプル1ミリリットルあたり100マイクロリットルの濃度でサンプルに加えます。
サンプルをボルテックスし、摂氏2〜8度で5分間インキュベートします。次に、分離培地を添加して、必要に応じて、段階的なピペットを使用して容量を2.5ミリリットルまたは10ミリリットルに補充し、混合します。次に、蓋をしていないプロピレンチューブを磁石に入れ、室温で約2.5分間インキュベートします。
次に、磁石をピックアップし、1回の連続動作で反転させて、セル懸濁液を新しい5ミリリットルまたは14ミリリットルのチューブに注ぎます。単離した細胞をRPMI-1640培地に再懸濁します。まず、マクロファージ集団M1およびM2の各25ミリリットルのフラスコに5ミリリットルのポリ-D-リシン溶液を加え、フラスコをフードに少なくとも1時間放置します。
細胞数を決定した後、5ミリリットルのRPMI-1640培地を追加し、次に1〜5回、10の6つの単球の累乗を事前にコード化された各25ミリリットルフラスコに播種します。フラスコを摂氏37度で5%二酸化炭素と少なくとも2時間インキュベートします。インキュベーション期間の後、フラスコをPBSで1回、完全なRPMI-1640培地で2回洗浄します。
所望の細胞種に応じて10ミリリットルのM1またはM2分化培地をフラスコに加え、インキュベーター内で細胞を5%二酸化炭素で摂氏37度で6日間分化させます。6日目に、必要に応じて各フラスコに5ミリリットルのM1またはM2偏光媒体を追加します。マクロファージをインキュベーター内で摂氏37度で5%の二酸化炭素で少なくとも2日間分極させます。
8日目にM1またはM2マクロファージを採取する前に、必要に応じて上清を15ミリリットルのチューブに集めてさらに使用します。フラスコに1ミリリットルの細胞剥離液を加え、インキュベートします。反応を止めるには、3ミリリットルの完全RPMI-1640ミディアムをフラスコに加え、メディアを15ミリリットルのチューブに集めます。
フラスコにさらに3ミリリットルの培地を追加した後、セルスクレーパーを使用して細胞を底から切り離します。分離した細胞を新鮮な15ミリリットルのチューブに集めます。M1およびM2マクロファージの品質を測定するには、細胞をPBSで2回洗浄し、完全なRPMI-1640培地に0.5倍(チューブあたり10の6細胞の累乗)で再懸濁します。
次に、フローサイトメトリーアッセイを使用して、2つの細胞集団を解析します。得られたM1およびM2マクロファージを、血球計算盤を用いてトリパンブルーと1対1の染色比でカウントします。マクロファージを10×10の濃度にRPMI-1640 Complete Mediumで1ミリリットルあたり6細胞の累乗で再構成します。
マイクロピペットを使用して、400マイクロリットルの細胞懸濁液を8ウェルチャンバースライドの各ウェルに播種し、スライドを摂氏37度で5%二酸化炭素と少なくとも1.5時間、完全に加湿した組織培養インキュベーターでインキュベートします。RhD陽性のR2R2赤血球を洗浄するには、pH 7.4のPBSを細胞に添加し、サンプルを350 Gで5分間遠心分離します。このような洗浄をさらに2回行った後、試験用RBCサンプルを目的の抗体でオプソナイズします。
抗体のオプソニン化および非オプソニン化赤血球を摂氏37度で5%二酸化炭素と1時間インキュベートします。RBCが沈降するのを防ぐために、15分ごとに断続的に渦を巻きます。次に、前に示したように、PBSでPBSで3回オプソナイズRBCを洗浄します。
RBCオプソニン化を確認するには、一次オプソナイジング抗体に対する二次オプソナイジング抗ヒト抗体を用いて間接的な抗グロブリン試験を実施します。間接的な抗グロブリン試験を読んだ後、洗浄したオプソニン化RHDとR2R2 RBCをRPMI-1640 Complete Mediumを使用して1.25体積懸濁液中に再構成します。M1およびM2マクロファージを1.5時間インキュベートした後、上清培地をウェルの角に沿って静かに吸引して廃棄します。
次に、1.25%オプソン化RBC混合物の400マイクロリットルをトリプリケートセットアップの各ウェルに加えます。サンプルを摂氏37度で5%二酸化炭素と2時間乱さずにインキュベートします。次に、pH 7.4の100ミリリットルのPBSを2つのビーカーに注ぎます。
スライドを最初のビーカーに沈め、20〜30ストロークゆっくりと前後に動かします。次に、スライドを2番目のビーカーに移し、20〜30ストローク洗います。PBSからスライドを取り出し、ペーパータオルで余分な液体を軽くたたきます。
スライドを100%メタノールに45秒間浸して細胞を固定します。スライドを風乾し、社内で用意した封入剤を使用して取り付けます。カバースリップを追加し、スライドを一晩乾燥させてから、食作用を定量化します。
M1およびM2マクロファージは、顕微鏡画像で観察された明確な形態学的特徴とともに、8日間にわたって分極および培養に成功しました。フローサイトメトリーでは、M1マクロファージはCD80の約86.1%の発現とCD209の0.17%の発現を示しました。M2マクロファージは、CD209発現の97.3%、CD80発現の0.003%を示しました。
蛍光強度のヒストグラムにより、M1マクロファージではM2マクロファージと比較してCD80の発現が高いことが確認されました。一方、M2マクロファージは、M1マクロファージと比較して有意に高いCD209発現を示しました。M2マクロファージは、M1マクロファージと比較して有意に高い食作用指数を示しました。
顕微鏡画像では、M1マクロファージと比較して、M2マクロファージの食作用の増加が明らかな証拠を示しました。この研究は、単球の代わりにマクロファージを使用して赤血球抗体の意義を予測する可能性を評価することを目的としていました。この表は、M2マクロファージが、臨床的に重要であると考えられる抗体を持つM1マクロファージまたは単球よりも食作用が優れていることを示しています。
したがって、さらなる研究により、M2マクロファージを用いたアッセイを用いて、抗体の臨床的意義をより正確に予測することができるようになるかもしれません。
