우리의 연구는 장 확장 슬리브와 질 확장 슬리브를 중심으로 이루어지고 있으며, 둘 다 장과 질관을 크게 늘리는 것으로 밝혀진 산만한 힘을 제공합니다. 우리는 단백질 기반 치료제를 추가하여 이러한 장치의 배포에 따른 국소 염증 및 섬유증을 최소화하는 데 도움이 되도록 장치를 최적화하기를 희망하고 있습니다. 이러한 치료제를 당사의 기기에 직접 결합함으로써, 우리는 국부적인 용량으로 관심 분야를 직접 대상으로 하는 전신 투여의 필요성을 우회할 수 있습니다.
이러한 국소화를 통해 약물 투여량을 낮추고 전신 부작용의 위험을 줄이며 치료 비용도 낮출 수 있습니다. 앞으로 당사는 PVA 코팅 장치에 결합된 이러한 단백질 기반 치료제의 방출 속도를 결정하고자 하며, 이는 다양한 유형의 치료에 대한 약물 투여량을 결정하는 데 필요할 것입니다. 시작하려면 5ml의 탈이온수에 PVA 5g을 첨가하여 100% 폴리비닐 알코올 또는 PVA 용액을 준비합니다.
용해를 돕기 위해 뜨거운 접시에 혼합물을 저어줍니다. 다음으로, 1밀리리터의 탈이온수에 1밀리그램의 GLP-2를 첨가하여 글루카곤 유사 펩타이드 2 또는 GLP-2 용액 1밀리그램을 준비합니다. 유리 피펫 위에 장 확장 슬리브와 질 확장 슬리브를 사전 계약하고 유리 피펫과 슬리브 주위에 단단히 끼워진 절단된 플라스틱 피펫으로 끝을 안정화합니다.
작은 붓을 사용하여 5% PVA 용액으로 사전 계약된 슬리브를 칠합니다. 각 코팅 사이에 10분 동안 슬리브를 실온에서 건조시킵니다. 다섯 번째 코팅이 건조되면 사전 계약된 슬리브를 화학 안전 후드 아래의 건조제에 넣습니다.
25% 글루타르알데히드 3밀리리터와 94-98% 황산 3밀리리터를 데시케이터의 별도 개방형 비커에 첨가하여 증기 반응을 허용하고 PVA 멤브레인을 슬리브에 가교합니다. 48시간 동안 가교한 후 챔버에서 슬리브를 제거하고 글루타르알데히드가 15분 동안 증발하도록 합니다. 나중에 사용할 수 있도록 50마이크로리터의 GLP-2 용액을 각 가교 슬리브에 피펫으로 분사합니다.
PVA에 결합된 GLP-2의 표준 곡선을 만들려면 24웰 플레이트의 18웰 바닥에 50마이크로리터의 5%PVA를 피펫팅합니다. 장 확장 슬리브와 질 확장 슬리브를 고정하기 위해 6개의 웰을 비워 두고 각 장치 유형에 대해 3개의 웰을 사용합니다. PVA 층을 섭씨 120도의 오븐에서 밤새 건조시킵니다.
다음 날, 24웰 플레이트를 화학 안전 후드 아래의 건조제에 넣습니다. 25%글루타르알데히드 3밀리리터와 94-98%황산 3밀리리터를 데시케이터 내부의 별도의 개방형 비커에 첨가하여 증기 반응을 허용하고 PVA 멤브레인을 24웰 플레이트에 가교합니다. 48시간 가교 후 데시케이터에서 24웰 플레이트를 제거하고 글루타르알데히드가 15분 동안 증발하도록 합니다.
다음으로, 250, 150, 25 및 0 마이크로리터의 1밀리리터 GLP-2 용액을 각각의 라벨링된 웰에 추가하여 농도 구배를 생성합니다. 그런 다음 약물로 코팅된 장 및 질 확장 슬리브를 각각의 웰에 넣습니다. 각각의 GLP-2 농도와 약물 코팅된 장 확장 슬리브 및 질 확장 슬리브를 웰에 첨가한 후 약물 결합을 허용하기 위해 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 24웰 플레이트를 냉장 보관합니다.
다음 날, 탈이온화된 물 차단 용액에 분유 1밀리리터당 1밀리그램 2밀리리터를 각 웰에 1시간 동안 첨가합니다. 막기 후에, 세척당 5분 동안 PBS로 각 우물을 3번 세척하십시오. 40마이크로리터의 토끼 항 GLP-2 항체를 50ml의 탈이온수에 첨가하여 토끼 항 GLP-2 항체 용액을 준비합니다.
그런 다음 플레이트의 각 웰에 2ml의 항체 용액을 추가합니다. 접시를 섭씨 4도에서 밤새 냉장 보관하십시오. 다음 날, 각 우물을 PBS로 5분 동안 세 번 씻습니다.
40ml의 탈이온수에 20ml의 항체를 첨가하여 항토끼 IgG 알칼리성 인산가수분해효소 2차 항체 용액을 준비합니다. 각 웰에 2ml의 2차 항체 용액을 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. PBS로 웰을 세척한 후 각 웰에 2ml의 알칼리성 인산가수분해효소 블루 마이크로 웰 기질을 추가하고 20분 동안 배양합니다.
배양하는 동안 용액의 색이 노란색에서 파란색으로 변할 때 반응을 모니터링합니다. 각 웰에서 200마이크로리터의 용액을 라벨이 붙은 96웰 플레이트에 피펫팅하여 반응을 중지합니다. 620 나노미터의 파장에서 흡광도 마이크로플레이트 리더를 사용하여 96 웰 플레이트를 판독합니다.
표준 곡선을 생성하고 PVA 코팅 슬리브의 GLP-2 농도를 계산합니다. 장 확장 슬리브 및 질 확장 슬리브 장치의 GLP-2 농도는 평균 제곱센티미터당 22.69마이크로그램으로 24웰 플레이트의 50마이크로그램 웰의 농도와 유사하며 제곱센티미터당 23.7마이크로그램입니다.
