이 프로토콜은 살충제로 처리 된 꿀벌에 대한 많은 생물학적 및 독성 학적 연구에 유용합니다. Varroa 진드기에 대한 치료를 위해 꿀벌 식민지에서 사용되는 살비제의 꿀벌 조직의 세포 반응을 감지하는 데 도움이됩니다. 꿀벌이나 다른 유익한 곤충의 행동과 함께 조직에 미치는 작은 효과를 감지하는 강력한 도구입니다.
시작하려면 조심스럽게 집게로 일벌을 가져 와서 섭씨 영하 20 도의 얼음이나 냉동고에 2 분 동안 올려 고정시킵니다. 페트리 접시에 꿀벌을 흉부의 맨 위 뒤쪽 부분을 통해 대각선으로 왼쪽에서 오른쪽으로, 오른쪽에서 왼쪽으로 두 번 고정합니다. 몸을 덮는 불쌍한 곤충 식염수.
페트리 접시를 실체 현미경 아래에 놓고 초점을 맞추고 조정합니다. 중추를 해부하려면 꿀벌 몸의 오른쪽 중앙에있는 tergite A5 아래에 가위의 한 지점을 삽입하여 복부부터 시작하십시오. 테르 기트 A2로 자릅니다. 내부 장기가 손상되지 않도록 가위의 안쪽 날을 몸의 측면과 평행하게 유지하십시오.
가위를 왼쪽으로 돌려 자릅니다. 복부의 왼쪽 부분을 부드럽게 열고 고정하십시오. 한 손으로 집게를 사용하여 꿀벌 위를 부드럽게 위로 당기고 다른 손에는 가위로 식도 끝에서 자릅니다.
복부에서 위와 중추를 당겨 직장을 자릅니다. 곤충 식염수가 든 피펫을 사용하여 대변이나 조직의 일부를 제거하십시오. 하인두 땀샘의 해부를 위해, 앞에서 설명한대로 얼음 위에 일벌을 고정시킵니다.
머리를 잘라 안테나가 위를 향하도록 작은 판에 놓습니다. 두 개의 핀으로 머리를 고정하는데, 하나는 왼쪽 겹눈을 관통하고 다른 하나는 오른쪽 겹눈을 관통합니다. 핀 안쪽의 첫 번째 겹눈을 가로질러 절단하고 음순으로 계속 이동한 다음 두 번째 겹눈을 가로질러 다른 쪽을 다시 자릅니다.
안테나를 잘라냅니다. 마스크를 벗고 아직 부착된 부분을 자릅니다. 집게를 가지고 뇌와 겉눈의 일부와 함께 땀샘을 조심스럽게 제거하십시오.
헤마톡실린 및 에오신 염색을 위해, 탈랍되고 재수화된 절편을 헤마톡실린에 5분 동안 넣는다. 그런 다음 흐르는 수돗물에 2 분 동안 조심스럽게 두십시오. 그런 다음 증류수에 1 분, 에오신 4 분 동안 넣는다.
슬라이드를 96 % 에탄올을 1 분 동안 놓은 다음 2- 프로판올을 2 분 동안 넣고 마지막으로 2 분 동안 클리어링 에이전트에 넣습니다. 장착 매체와 커버 유리를 추가하고 건조시킵니다. 광학 현미경으로 관찰하십시오.
코플린 항아리를 준비하십시오. 프로테이나제-K를 준비합니다. 섹션을 탈랍하고 재수화한 후 슬라이드를 PBS에 5분 동안 놓습니다.
슬라이드를 용기에 평평하게 놓고 프로테이나제-K를 추가합니다. 증류수로 슬라이드를 씻으십시오. 실온에서 내인성 과산화 효소로 담금질하십시오.
슬라이드를 PBS 또는 물로 헹굽니다. 슬라이드를 용기에 평평하게 놓고 실온에서 10초 동안 평형 버퍼를 적용합니다. 조직 주위를 닦은 후 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제 효소를 각 섹션에 추가하고 섭씨 37도의 가습 챔버에서 1시간 동안 배양합니다.
부화하기 전에 슬라이드 주위의 트레이 안에 축축한 종이 타월을 넣고 플라스틱 랩으로 덮으십시오. 배양 후 표본을 랙에 놓고 세척 중지 버퍼에 두십시오. PBS로 슬라이드를 세척하고 조직 주위를 닦은 후 따뜻한 항 디곡시제닌 퍼 옥시 다제 접합체 2 방울을 섹션에 넣고 가습 용기에서 30 분 동안 배양합니다.
PBS로 세척 한 후 작동 강도-퍼 옥시 다제 기질을 준비하고 과산화 효소 기질로 섹션을 덮고 5 분 동안 염색합니다. 슬라이드를 현미경 아래에 놓고 최적의 염색 시간을 결정합니다. 슬라이드를 염색 랙 및 증류수로 세척한 후, 슬라이드를 증류수에서 5분 동안 배양한다.
2 분 동안 헤 마톡실린을 사용하여 카운터 염색. 슬라이드를 흐르는 수돗물에 3 분 동안 넣은 다음 증류수에 넣어 씻으십시오. 슬라이드를 유리 커버 슬립과 장착 매체 아래에 장착하고 평평하게 두어 건조시킵니다.
광학 현미경으로 관찰하십시오. 영향을 받은 세포의 백분율은 광학 현미경을 사용하여 계산되었습니다. 결과는 옥살산 치료가 중추의 세포에 상당한 영향을 미친다는 것을 나타 냈습니다.
면역 염색은 하인두 땀샘의 세포 사멸 핵에서 양성 적색 또는 갈색 반응 생성물을 보였다. 이미다클로프리드 또는 쿠마포스 처리 후의 양성 반응 생성물은 대부분의 선 세포에서 결정되었다. 꿀벌 머리의 마스크를 들어 올릴 때 하 인두 땀샘의 일부를 손상 시키거나 잡아 당기지 않도록주의하십시오.
이 기술은 꿀벌의 무증상 변화를 감지하고 꿀벌 및 다른 생물체에 대한 다른 환경 영향을 감지하는 데에도 적합합니다.
