פרוטוקול זה שימושי במחקרים ביולוגיים וטוקסיקולוגיים רבים של דבורי דבש שטופלו בחומרי הדברה. זה עוזר לזהות את התגובות הסלולריות של רקמת דבורת הדבש של acaricides המשמשים מושבות דבורים לטיפול נגד קרדית Varroa. זהו כלי רב עוצמה לזיהוי של השפעות תת-מעטות על רקמות בשילוב עם התנהגות של דבורים או חרקים מועילים אחרים.
כדי להתחיל, בזהירות לקחת דבורה עובד עם מלקחיים ולשים אותו על קרח או מקפיא במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות כדי לשתק אותו. הצמידו את הדבורה לצלחת הפטרי באלכסון דרך החלק האחורי העליון של בית החזה פעמיים משמאל לימין ומימין לשמאל. חרק מסכן מלח כדי לכסות את הגוף.
הניחו את צלחת הפטרי מתחת לסטריאומיקרוסקופ, התמקדו והתכווננו. כדי לנתח את המותניים, התחילו עם הבטן על ידי החדרת נקודה אחת של המספריים מתחת לטרגיט A5 במרכז הצד הימני של גוף הדבורה. חותכים לטרגיט A2. שמור על הלהב הפנימי של המספריים במקביל לצד הגוף כדי למנוע פגיעה באיברים הפנימיים.
סובבו את המספריים שמאלה וחתכו. פתח בעדינות את החלק השמאלי של הבטן והצמיד אותו. בעזרת מלקחיים ביד אחת, מושכים בעדינות את בטן דבורת הדבש כלפי מעלה, וביד השנייה חותכים בקצה הוושט.
מושכים את הבטן ואת המותניים הרחק מהבטן וחותכים בפי הטבעת. השתמש פיפטה עם תמיסת מלח חרקים ולהסיר כל צואה או חלקים של הרקמה. עבור כריתה של בלוטות hypopharyngeal, לשתק דבורה עובד על קרח כפי שתואר קודם.
חתכו את הראש והניחו אותו על צלחת קטנה יותר כשהאנטנה פונה כלפי מעלה. אבטחו את הראש באמצעות שתי סיכות, האחת דרך העין המורכבת השמאלית והשנייה דרך העין המורכבת הימנית. בצע חתך על פני העין המורכבת הראשונה בצד הפנימי של הסיכות, המשך ללברום, ולאחר מכן בצע חתך נוסף בצד השני על פני העין המורכבת השנייה.
נתק את האנטנות. מרימים את המסכה וחותכים היכן שעדיין מחוברים. קח את המלקחיים בזהירות להסיר את הבלוטות יחד עם המוח וחלק מהעיניים המורכבת.
עבור hematoxylin ו eosin מכתים, לשים את החלקים dewaxed, מיובש מחדש בהמטוקסילין במשך חמש דקות. לאחר מכן, הניחו אותם בזהירות מתחת למי ברז זורמים למשך שתי דקות. לאחר מכן, לשים אותם לתוך מים מזוקקים במשך דקה אחת eosin במשך ארבע דקות.
מניחים את השקופיות 96% אתנול למשך דקה אחת לאחר מכן 2-פרופנול למשך שתי דקות, ולבסוף לתוך סוכן הסליקה למשך שתי דקות. הוסיפו מדיום הרכבה וכוס כיסוי ותנו להם להתייבש. התבונן תחת מיקרוסקופ אור.
מכינים צנצנות קופלין. מכינים פרוטאינאז-K. לאחר התייבשות וייבוש מחדש של החלקים, הניחו את השקופיות ב- PBS למשך חמש דקות.
מניחים את השקופיות שטוחות במיכל ומוסיפים פרוטאינאז-K. שטפו את המגלשות במים מזוקקים. להרוות פרוקסידאז אנדוגני בטמפרטורת החדר.
שטפו את המגלשות עם PBS או מים. הניחו את המגלשות שטוחות במיכל והפעילו את מאגר שיווי המשקל למשך 10 שניות בטמפרטורת החדר. לאחר ניגוב סביב הרקמה, הוסיפו את האנזים דאוקסינוקלאוטידיל טרנספראז לכל מקטע, ודגרו בתא לחות למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לפני הדגירה, הניחו מגבות נייר לחות בתוך המגש סביב השקופיות וכסו אותן בניילון נצמד. לאחר הדגירה, הניחו את הדגימות על המדף והשאירו אותן במאגר לשטיפה. לאחר שטיפת השקופיות ב- PBS וניגוב סביב הרקמות, מוסיפים שתי טיפות של פרוקסידאז חם נגד דיגוקסיגנין מצומד למקטעים ודוגרים במשך 30 דקות במיכל לח.
לאחר הכביסה ב-PBS, מכינים את מצע הפרוקסידאז, מכסים את החלקים במצע פרוקסידאז ומכתימים במשך חמש דקות. הניחו את השקופית מתחת למיקרוסקופ וקבעו את זמן הצביעה האופטימלי. לאחר שטיפת המגלשות במדף מכתים ומים מזוקקים, דגרו את המגלשות במים מזוקקים למשך חמש דקות.
כתם נגדי באמצעות המטוקסילין למשך שתי דקות. שטפו את המגלשות על ידי הנחתן תחת מי ברז זורמים למשך שלוש דקות ולאחר מכן במים מזוקקים. הרכב את המגלשות מתחת לכיסויי זכוכית והרכבה בינונית והשאר שטוח לייבוש.
התבונן תחת מיקרוסקופ אור. אחוז התאים הנגועים חושב באמצעות מיקרוסקופ אור. התוצאות הצביעו על כך שהטיפול בחומצה אוקסלית השפיע באופן משמעותי על התאים במידגוט.
Immunostaining הראה תוצרי תגובה אדומים או חומים חיוביים בגרעינים האפופטוטיים של בלוטות הלוע. תוצר תגובה חיובית לאחר טיפול באימידקלופריד או קומפוס נקבע ברוב תאי הבלוטות. בעת הרמת המסכה של ראש הדבורה, היזהר לא לפגוע או למשוך את החלקים של בלוטות הלוע.
טכניקה זו מזהה שינויים תת-קליניים בדבורים ומתאימה גם לזיהוי השפעות סביבתיות אחרות על דבורים ועל אורגניזמים חיים אחרים.
