이 프로토콜은 낮은 배경 신호로 여러 길이 스케일에 걸쳐 염색체 접힘 특징을 정확하게 감지합니다. 예를 들어, 프로모터 인핸서 상호작용은 염색체 구획의 맥락에서 분석될 수 있다. 제한 엔도뉴클레아제의 사용은 투입 물질의 분해 수준을 최적화하는 것을 우회합니다.
결찰 제품을 포획하기 위해 겔 분리에 의한 선택이 필요하지 않습니다. 가장 일반적인 문제는 DSG 고정 후 세포가 손실되고 고품질 라이브러리를 생성하기에 충분한 DNA를 캡처하는 것입니다. 시작하려면 5 x 10을 포함하는 150mm 플레이트에서 진공 트랩에 연결된 파스퇴르 피펫으로 배지를 6 번째 셀로 흡입합니다.
10 밀리리터의 HBSS로 세포를 두 번 씻으십시오. 세포를 가교하려면 23.125 밀리리터의 1 % 포름 알데히드 용액을 15 센티미터 플레이트에 붓습니다. 실온에서 10 분 동안 배양하고 2 분마다 손으로 플레이트를 부드럽게 흔 듭니다.
다음으로, 1.25 밀리리터의 2.5 몰 글리신을 첨가하고 플레이트를 부드럽게 소용돌이 치며 가교 반응을 진정시킨 다음 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 가교를 중지하기 위해 15 분 동안 얼음에서 계속 배양하십시오. 세포 스크레이퍼 또는 고무 경찰관으로 플레이트에서 세포를 긁어 내고 세포 현탁액을 피펫으로 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다.
현탁액을 실온에서 10분 동안 1, 000회 G로 원심분리하고 흡인하여 상층액을 버린다. Dulbecco의 인산염 완충 식염수 또는 DPBS 10ml로 펠릿을 한 번 씻으십시오. 이어서, DSG 가교를 진행하기 전에 다시 원심분리한다.
DSG와의 가교를 위해 펠렛 셀을 9.9ml의 DPBS에 재현탁시킵니다. 그런 다음 100 마이크로 리터의 300 밀리몰 DSG를 추가하십시오. 튜브를 반전으로 혼합하고 회전 장치에서 실온에서 40 분 동안 세포를 가교 결합시킵니다.
가교 결합 후 1.925 밀리리터의 2.5 몰 글리신을 넣고 뒤집어 혼합하고 실온에서 5 분 동안 배양합니다. 다음으로, 세포를 2, 000 배 G에서 15 분 동안 원심 분리하고 펠렛을 1.7 밀리리터 튜브로 옮기기 전에 0.05 % 소 혈청 알부민 DPBS 1 밀리리터에 재현탁시킨다. 세포를 섭씨 4도에서 15분 동안 2, 000배 G로 원심분리하고 상층액을 버린다.
염색체 확인 캡처를 진행하기 전에 펠릿을 액체 질소에서 스냅 동결합니다. 10 마이크로리터의 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 1밀리리터의 빙냉 용해 완충액에 가교결합된 세포 분취량을 재현탁시키고, 얼음 상에서 15분 동안 Dounce 균질화기로 옮긴다. 유봉 A를 천천히 위아래로 30 번 움직여 세포를 균질화하고 1 분 동안 배양하여 세포가 30 회 더 치기 전에 식도록합니다.
마지막 스트로크 후 용해물을 1.7 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 용해된 현탁액을 2, 500회 G에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 플릭 또는 와동하여 젖은 펠릿을 다시 부유시킵니다.
가능한 한 많은 상청액을 제거하여 최소한의 덩어리로 요구르트와 같은 물질을 얻으십시오. 원심분리 전에 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 제한 버퍼에 펠릿을 재현탁합니다. 두 번째 세척 후, 셀 크기에 따라 펠릿의 캐리오버 부피에 대략 340 마이크로리터를 추가한 후 피펫팅에 의해 360 마이크로리터의 제한 완충액에 펠릿을 재현탁시킨다.
염색질 무결성을 테스트하기 위해 18 마이크로 리터의 용해물을 따로 보관하거나 나머지 용해물을 CI.To 하고 38 마이크로 리터의 1 % 나트륨 도데 실 설페이트를 hi-C 튜브에 추가하여 총 부피 380 마이크로 리터를 만들고 기포를 도입하지 않고 피펫 팅하여 조심스럽게 혼합합니다. 염색질을 열기 위해 10분 동안 흔들지 않고 섭씨 65도에서 샘플을 배양합니다. 그런 다음 즉시 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
Triton X-100으로 소화 혼합물을 준비한 후이 혼합물 107 마이크로 리터를 hi-C 튜브에 첨가하여 총 부피 487 마이크로 리터를 만들고 간격 진탕으로 열 혼합기에서 섭씨 37도에서 밤새 염색질을 분해합니다. 다음날, 샘플을 섭씨 65도까지 20 분 동안 옮겨 나머지 엔도 뉴 클레아 제 활성을 비활성화시킵니다. 샘플을 얼음 위에 놓은 후 10마이크로리터의 소화 조절 또는 DC를 따로 보관하고 섭씨 4도에서 보관하십시오.
피펫으로 또는 회전하여 뚜껑에서 응결을 제거하십시오. 그런 다음 58 마이크로 리터의 비오틴 필 인 믹스를 추가하여 총 부피를 535 마이크로 리터로 만듭니다. 기포를 형성하지 않고 부드럽게 피펫팅한 후 섭씨 23도에서 써모믹서에서 4시간 동안 배양합니다.
배양 후, 665 마이크로 리터의 결찰 혼합물을 첨가하여 샘플 부피를 1, 200 마이크로 리터로 만든다. 피펫팅으로 샘플을 혼합하고 섭씨 16도에서 열혼합기에서 4시간 동안 배양합니다. 다음으로, 50 마이크로 리터의 단백질 분해 효소 -K를 두 개의 분획으로 hi-C 샘플 튜브에 첨가하고 간격 흔들림으로 섭씨 65도에서 밤새 배양합니다.
DNA 정제를 위해 100% 얼음처럼 차가운 에탄올을 넣고 섭씨 4도에서 30분 동안 18, 000배 G에서 튜브를 원심분리합니다. 펠릿이 아닌 쪽에서 상청액을 완전히 제거하고 10분 동안 또는 펠릿이 눈에 띄게 건조될 때까지 샘플을 자연 건조합니다. 펠릿이 건조되면 피펫팅 또는 소용돌이를 통해 450마이크로리터의 트리스 저EDTA에 용해시킵니다.
가용화된 현탁액을 3킬로달톤 분자량 컷오프를 사용하여 0.5mm 원심 필터 유닛 또는 CFU로 옮깁니다. CFU를 최대 속도로 10분 동안 원심분리하고 플로우 스루를 폐기합니다. 두 번째 세척 후 80 마이크로 리터의 트리스 저 EDTA를 컬럼에 첨가하십시오.
컬럼을 새 수집 튜브로 전환하여 최대 속도로 2분 동안 원심분리합니다. 마지막으로 샘플을 0.8%아가로스 겔에 넣습니다. PCR 적정 결과가 있는 아가로스 겔은 대부분의 라이브러리가 최종 PCR 증폭의 5-8 사이클을 필요로 한다는 것을 보여주었습니다.
아가로스 겔 상의 더 작은 단편에 의해 관찰된 바와 같이, 최종 증폭된 PCR 라이브러리의 세포 분해는 적절한 결찰 접합부의 존재를 확인하고 시퀀싱 전에 품질 검사의 역할을 한다. 시퀀싱 후, 매핑된 데이터는 DpnII와 DdeI의 조합이 종래의 포름알데히드 가교결합에 DSG를 첨가함에 따라 단거리 접촉을 상당히 증가시킨다는 것을 보여주었다. 향상된 신호는 2D 상호 작용 매트릭스에서 직접 장거리 및 단거리에서 관찰 할 수도 있습니다.
구획 신호는 장거리에서 CRISPR이며 염색질 루프에 의해 형성된 점은 짧은 거리에서 더 두드러집니다. 포름 알데히드 외에도 DSG와의 가교는 무작위 결찰을 감소시켜 cis의 상대적 적용 범위를 향상시킵니다. 가교 도중과 가교 후에 세포를 잃지 않는 것이 중요합니다.
세포 펠릿은 느슨하거나 보이지 않을 수 있으며 세포는 일부 완충액의 피펫 팁에 달라붙을 수 있습니다.
