يكتشف هذا البروتوكول بدقة ميزات طي الكروموسوم عبر مقاييس طول متعددة مع إشارة خلفية منخفضة. على سبيل المثال ، يمكن تحليل تفاعلات محسن المروج في سياق مقصورات الكروموسوم. استخدام endonucleases تقييد التحايل على تحسين مستوى الهضم من المواد المدخلة.
لا يلزم الاختيار عن طريق عزل الجل لالتقاط منتجات الربط. المشكلة الأكثر شيوعا هي فقدان الخلايا بعد تثبيت DSG والتقاط ما يكفي من الحمض النووي لإنتاج مكتبات عالية الجودة. للبدء ، قم بشفط الوسط باستخدام ماصة باستور مقترنة بمصيدة فراغ من لوحة 150 ملم تحتوي على 5 × 10 إلى الخلايا السادسة.
اغسل الخلايا مرتين ب 10 ملليلتر من HBSS. لربط الخلايا ، صب 23.125 ملليلتر من محلول الفورمالديهايد 1٪ في لوحة 15 سم. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، هز بلطف لوحة باليد كل دقيقتين.
بعد ذلك، أضف 1.25 ملليلتر من 2.5 مولار من الجلايسين وحرك اللوح برفق لإخماد تفاعل الربط المتقاطع، قبل التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. استمر في الحضانة على الجليد لمدة 15 دقيقة لإيقاف الربط المتقاطع. كشط الخلايا من اللوحة باستخدام مكشطة خلية أو شرطي مطاطي ونقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر مع ماصة.
الطرد المركزي التعليق في 1،000 مرة G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل الطافية عن طريق الشفط. اغسل الحبيبات مرة واحدة ب 10 ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco ، أو DPBS. ثم ، أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى قبل المتابعة إلى DSG عبر الربط.
للربط المتقاطع مع DSG ، أعد تعليق الخلايا المحببة في 9.9 ملليلتر من DPBS. ثم أضف 100 ميكرولتر من 300 ملليمولار DSG. امزج الأنبوب عن طريق الانعكاس وقم بربط الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة على جهاز دوار.
بعد الربط المتقاطع ، أضف 1.925 ملليلتر من 2.5 مولار جليكاين ، واقلب للخلط ، واحتضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بطرد الخلايا بالطرد المركزي بمعدل 2،000 مرة G لمدة 15 دقيقة وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من ألبومين مصل الأبقار 0.05٪ DPBS قبل نقله إلى أنبوب سعة 1.7 ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي للخلايا في 2،000 مرة G لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية وتجاهل المادة الطافية.
قم بتجميد الحبيبات في النيتروجين السائل قبل المتابعة إلى التقاط تأكيد الكروموسوم. أعد تعليق القسمة الخلوية المتشابكة في ملليلتر واحد من محلول التحلل البارد بالثلج الذي يحتوي على 10 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات الأنزيم البروتيني وانقله إلى خالط Dounce لمدة 15 دقيقة من الحضانة على الثلج. حرك المدقة A ببطء لأعلى ولأسفل 30 مرة لتجانس الخلايا واحتضانها لمدة دقيقة واحدة للسماح للخلايا بالتبريد قبل 30 ضربة أخرى.
بعد السكتة الدماغية الأخيرة ، انقل المحللة إلى أنبوب سعة 1.7 ملليلتر. الطرد المركزي التعليق المحلل في 2،500 مرة G لمدة خمس دقائق. تخلص من المادة الطافية ونفض الغبار أو الدوامة لإعادة تعليق الحبيبات المبللة.
قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة الطافية للحصول على مادة تشبه الزبادي مع الحد الأدنى من الكتل. أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتقييد الجليد البارد قبل الطرد المركزي. بعد الغسيل الثاني, أعد تعليق الحبيبات في 360 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتقييد عن طريق السحب بعد إضافة ما يقرب من 340 ميكرولتر إلى حجم ترحيل الحبيبات, اعتمادا على حجم الخلية.
ضع جانبا 18 ميكرولتر من المحللة لاختبار سلامة الكروماتين ، أو CI.To المحللة المتبقية ، أضف 38 ميكرولترا من كبريتات دوديسيل الصوديوم 1٪ إلى أنبوب hi-C لعمل حجم إجمالي قدره 380 ميكرولتر واخلطه بعناية عن طريق السحب دون إدخال فقاعات. احتضان العينات عند 65 درجة مئوية دون رجها لمدة 10 دقائق لفتح الكروماتين. ثم ضع الأنبوب على الفور على الثلج.
بعد تحضير خليط الهضم باستخدام Triton X-100 ، أضف 107 ميكرولتر من هذا الخليط إلى أنبوب hi-C لتكوين حجم إجمالي قدره 487 ميكرولتر وهضم الكروماتين طوال الليل عند 37 درجة مئوية في خلاط حراري مع اهتزاز الفاصل الزمني. في اليوم التالي ، انقل العينات إلى 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لإلغاء تنشيط نشاط النوكلياز المتبقي. بعد وضع العينة على الثلج ، ضع جانبا 10 ميكرولتر من التحكم في الهضم ، أو DC ، وتخزينها في أربع درجات مئوية.
قم بإزالة التكثيف من الغطاء باستخدام ماصة أو عن طريق الدوران. بعد ذلك ، أضف 58 ميكرولترا من مزيج تعبئة البيوتين ليصبح الحجم الكلي 535 ميكرولتر. ماصة بلطف دون تشكيل فقاعات قبل الحضانة عند 23 درجة مئوية لمدة أربع ساعات في خلاط حراري.
بعد الحضانة ، أضف 665 ميكرولتر من مزيج الربط ، مما يجعل حجم العينة 1،200 ميكرولتر. امزج العينة عن طريق السحب واحتضانها عند 16 درجة مئوية لمدة أربع ساعات في خلاط حراري. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من البروتيناز-K في جزأين إلى أنبوب عينة hi-C واحتضانه طوال الليل عند 65 درجة مئوية مع اهتزاز الفاصل الزمني.
لتنقية الحمض النووي ، أضف الإيثانول المثلج بنسبة 100٪ وأجهزة الطرد المركزي للأنابيب عند 18،000 مرة G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية تماما من الجانب غير الحبيبي وجفف العينة في الهواء لمدة 10 دقائق أو حتى تجف الكريات بشكل واضح. بمجرد أن تجف الكريات ، قم بإذابتها في 450 ميكرولتر من Tris low-EDTA عن طريق السحب أو الدوامة.
انقل التعليق القابل للذوبان إلى وحدة مرشح طرد مركزي 0.5 مم ، أو CFU ، مع قطع الوزن الجزيئي بمقدار ثلاثة كيلودالتون. قم بالطرد المركزي لوحدة CFU بأقصى سرعة لمدة 10 دقائق وتخلص من التدفق. بعد الغسيل الثاني ، أضف 80 ميكرولتر من Tris low-EDTA إلى العمود.
حول العمود إلى أنبوب تجميع جديد لمدة دقيقتين من الطرد المركزي بأقصى سرعة. أخيرا ، قم بتحميل العينات على جل أغاروز 0.8٪. أظهر جل الأغاروز مع نتائج معايرة PCR أن معظم المكتبات تتطلب خمس إلى ثماني دورات من تضخيم PCR النهائي.
يؤكد هضم الخلايا في مكتبة تفاعل البوليميراز المتسلسل المضخم النهائي ، كما لوحظ من خلال شظايا أصغر على هلام الأغاروز ، وجود تقاطعات ربط مناسبة ويعمل كفحص للجودة قبل التسلسل. بعد التسلسل ، أظهرت البيانات المعينة أن الجمع بين DpnII و DdeI يزيد بشكل كبير من جهات الاتصال قصيرة المدى ، مثل إضافة DSG إلى الربط المتقاطع التقليدي للفورمالديهايد. يمكن أيضا ملاحظة إشارة محسنة على مسافات طويلة وقصيرة مباشرة من مصفوفات التفاعل 2D.
إشارات المقصورة هي كريسبر على مسافات طويلة والنقاط التي تشكلها حلقات الكروماتين تكون أكثر بروزا على مسافات قصيرة. بالإضافة إلى الفورمالديهايد ، يقلل الربط المتقاطع مع DSG من الروابط العشوائية ، مما يحسن التغطية النسبية في رابطة الدول المستقلة. من المهم ألا تفقد الخلايا أثناء وبعد التشابك.
يمكن أن تكون كريات الخلايا فضفاضة أو غير مرئية ، ويمكن أن تلتصق الخلايا بأطراف الماصة في بعض المخازن المؤقتة.
