이 프로토콜은 입체 조직 배양 기질로서 무손상 폐 세포외 매트릭스의 반복 가능한 사용 및 적당한 처리량을 가능하게 한다. 조작된 폐 조직 시스템의 가장 큰 장점은 플랫폼의 유연성입니다. ELTs는 관심있는 다양한 조직 스캐폴드, 세포, 또는 배양 배지를 사용하도록 적응될 수 있다.
폐가 추출되면 페놀 레드가없는 아가로스와 HBSS로 10 밀리리터 주사기를 채 웁니다. 기관 캐뉼라를 통해 약 10 밀리리터의 공기로 폐를 팽창시킨 다음 폐 엽의 가장 원위 끝이 팽창 될 때까지 기관 캐뉼라를 통해 준비된 아가로스를 즉시 주입하십시오. 사방 스톱콕에서 기관 캐뉼라의 여성 루어 잠금 장치에 흰색 캡을 부착하여 기관을 캡핑하십시오.
폐를 얼음 위의 150 밀리미터 페트리 접시에 넣어 아가로스가 응고되도록 하십시오. 원고의 프로토콜에 따라 폐 조각을 준비한 다음 100 밀리미터 페트리 접시에 PBS의 1/3 부피를 채 웁니다. 포셉을 사용하여 카세트와 탭을 접시에 옮깁니다.
슬라이스가 냉동된 경우, 실온 PBS에 붓고 한 번에 하나의 디쉬를 해동시킨다. 그런 다음 해동 된 조각을 150 밀리미터 페트리 접시로 옮깁니다. 미세한 포셉 또는 지혈제를 사용하여 슬라이스를 부드럽게 펼치고 조직 주위에서 과도한 PBS를 조심스럽게 흡인합니다.
그런 다음 면도날의 전체 길이를 접시에 단단히 대고 좌우로 약간 흔들어서 조각에서 세 밀리미터 너비, 적어도 아홉 밀리미터 길이의 스트립을 자릅니다. 티슈 스트립을 카세트에 클립하려면 카세트 위에 올려 놓고 조심스럽게 가운데에 두어 양쪽 끝의 클립의 구멍을 지나 확장하십시오. 미세한 집게로 한쪽 끝의 구멍에 탭을 부분적으로 놓고 조직을 부드럽게 곧게 펴고 두 번째 탭을 설정하십시오.
마지막으로 포셉을 사용하여 각 탭을 완전히 눌러 조직을 고정하십시오. 모든면을 클리핑 한 후 카세트가 들어있는 100 밀리미터 접시를 층류 후드로 옮깁니다. 첫 번째 탈세포화 용액이 들어있는 여섯 웰 플레이트에 카세트를 옮기고 곡선 지혈제를 사용하여 노치면을 잡습니다.
이어서, 여섯 웰 플레이트를 30 RPM의 오비탈 쉐이커 상에 10분 동안 놓는다. 각 웰에서 유체를 흡인 한 다음 웰 당 두 번째 탈세포 화 용액의 세 밀리리터로 교체하십시오. 플레이트를 30RPM의 오비탈 쉐이커 위에 놓고 5분 동안 인큐베이션한다.
원고의 탈세포화 프로토콜에 설명 된대로 각 솔루션으로이 과정을 반복하십시오. PBS로 최종 헹구어 낸 후, 조직을 항생제 및 항균제와 함께 신선한 PBS를 함유하는 멸균된 여섯 웰 플레이트로 옮기고 섭씨 37도에서 48시간 동안 인큐베이션한다. 항생제 및 항균제로 멸균 한 후, 폐 조직 스캐폴드는 즉시 시드되거나 섭씨 4도에서 최대 30 일 동안 보관할 수 있습니다.
배양을 위해 활용하기 전에, 추가적인 멸균 단계로서 신선한 PBS 및 항생제 및 항균제와 함께 섭씨 4도에서 저장된 스캐폴드를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 스캐폴드를 멸균 PBS, 웰 당 다섯 밀리리터, 세 번, 각각 다섯 분 동안 헹구십시오. 스캐폴드를 5X 배율로 위상차 현미경으로 검사하여 시딩할 조직을 선택합니다.
내피 배지에서 내피 세포 현탁액을 밀리리터 당 5 백만 개의 세포로 준비하여 슬라이스 당 500, 000 개의 내피 세포를 시드하기에 충분한 세포로 준비하십시오. 오토클레이브 시드 욕조를 100mm 페트리 접시에 넣고 조심스럽게 헹굼 스캐폴드를 거꾸로 씨를 뿌리는 욕조로 옮깁니다. 제조된 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이 치며 혼합한다.
그런 다음 웰 바닥에있는 각 조직의 맨 위에 100 마이크로 리터의 세포를 조심스럽게 피펫하여 피펫 팁으로 조직이 손상되지 않도록주의하십시오. 시딩된 조직을 세포 배양 인큐베이터로 옮긴다. 내피 세포 시딩 24시간 후, 수동 피펫을 사용하여 900 마이크로리터의 미리 가온된 배양 배지를 각 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 인큐베이터로 복귀시킨다.
세포 시딩 24시간 후, 배지를 제거하고 웰 당 한 밀리리터의 신선한 내피 배지를 교체한다. 72시간 후 내피 세포를 시딩하고, AEC2s, 또는 폐포 상피 유형 II 세포를 계수하고, 혈구분석기를 사용하여 섬유아세포를 계수하고, 밀리리터당 5백만 개의 세포에서 AEC2 성장 배지에서 1:1 세포 현탁액을 제조하였다. 각 시딩 욕조로부터 배지를 잘 피펫하고 준비된 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이친다.
100 마이크로 리터의 세포를 우물 바닥에있는 각 조직의 바로 위에 피펫하십시오. 시딩된 조직을 세포 배양 인큐베이터로 옮긴다. 2시간 후, 900 마이크로리터의 미리 가온된 AEC2 성장 배지를 각 웰에 첨가한 다음, 플레이트를 인큐베이터로 복귀시킨다.
AEC2s 및 섬유아세포로 24시간 배양한 후, 카세트 당 웰 당 1밀리리터의 미리 가온된 AEC2 성장 배지로 12-웰 플레이트를 제조하였다. 시딩 배쓰의 각 웰로부터 배지 800 마이크로리터를 피펫한 다음, 시딩 배쓰로부터 카세트를 제거하고 웰 당 하나의 카세트인 준비된 12-웰 플레이트까지 우측으로 옮긴다. 원하는 배양 기간 동안 격일로 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 배양 배지를 조심스럽게 변화시킨다.
배양 기간 동안 5X 배율에서 위상차 현미경을 통해 조직 재집단의 정도를 모니터링한다. 조직 스캐폴드의 H 및 E 염색은 가시적인 세포 핵이 없는 탈세포화 후에 보존된 폐포 구조를 나타냈다. 폐포 조직은 탈세포화된 세포외 매트릭스 스캐폴드를 위상차 현미경으로 5X 배율로 보았을 때 관찰되었다.
큰 가지기도와 혈관도 일부 조각에서 볼 수있었습니다. 배양 일곱째 날에, 위상차 현미경 검사는 조작된 폐 조직에서의 재세포화 패턴이 성공적인 재집단의 경우에 조직 폐포 구조를 모방한다는 것을 보여주었다. 불쌍한 재세포화도 눈에 띄었다.
일곱 번째 또는 여덟 일째에 H 및 E 염색은 폐포 중격의 재집단을 나타내었다. 면역형광 프로콜라겐 타입 I 알파 1 양성 섬유아세포, ABCA3 양성 AEC2s, CD31 양성 내피 세포, SPB 양성 AEC2s가 풍부함을 밝혀냄을 드러냈다. 더욱이, 티미딘 분석은 많은 증식하는 AEC2s를 보여주었다.
이 기술은 폐 조직 공학을위한 전략 개발을 촉진했으며 폐포 내에서 유형 II 세포 증식 및 분화를 지원하는 대기열에 대한 조사를 가능하게했습니다.
