פרוטוקול זה מאפשר שימוש חוזר במטריצה חוץ-תאית של ריאות שלמות כמצע תרבית רקמה תלת-ממדי ותפוקה מתונה. היתרון העיקרי של מערכת רקמת הריאה המהונדסת הוא הגמישות של הפלטפורמה. ניתן להתאים את ה-ELTs לשימוש בפיגומי רקמות שונים, בתאים או במדיה של תרביות מעניינות.
לאחר חילוץ הריאות, מלאו מזרק של 10 מיליליטר באגרוז ו-HBSS ללא פנול אדום. לנפח את הריאות עם כ -10 מיליליטרים של אוויר דרך צינורית קנה הנשימה, ואז מיד להזריק את האגרוז המוכן דרך צינור קנה הנשימה עד שקצות הדיסטליים ביותר של אונות הריאה מנופחים. קחו את קנה הנשימה על ידי חיבור הכובע הלבן מסטופר בעל ארבעה כיוונים אל מנעול הלואר הנקבי של צינורית קנה הנשימה.
מניחים את הריאה בצלחת פטרי באורך 150 מילימטרים על קרח כדי לאפשר לאגרוזה להתמצק. מכינים את פרוסות הריאה על פי הפרוטוקול בכתב היד, ואז ממלאים צלחת פטרי של 100 מילימטרים ב-1/3 נפח של PBS. מעבירים קלטות וכרטיסיות לצלחת באמצעות מלקחיים.
אם הפרוסות קפואות, הפשיר מנה אחת בכל פעם על ידי מזיגה על PBS בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו פרוסה מופשרת לצלחת פטרי בקוטר 150 מ"מ. פתחו בעדינות את הפרוסה באמצעות מלקחיים עדינים או המוסטאט ושאפו בזהירות לעודפי PBS מרחבי הרקמה.
לאחר מכן, חותכים מהפרוסה רצועה ברוחב שלושה מילימטרים, באורך של לפחות תשעה מילימטרים, על ידי לחיצה על מלוא אורכו של סכין גילוח בחוזקה כנגד המנה ומנענעים אותה קלות מצד לצד. כדי לחתוך את רצועת הרקמה לתוך הקלטת, הציפו אותה מעל הקלטת, ומרכזים אותה בזהירות כדי לעבור את החורים בקליפים משני הקצוות. מניחים לשונית חלקית לתוך החור בקצה אחד עם מלקחיים עדינים, מיישרים בעדינות את הרקמה ומגדירים את הלשונית השנייה.
לבסוף, השתמש במלקחיים כדי ללחוץ על כל לשונית במלואה כדי לאבטח את הרקמה. לאחר חיתוך כל הדפנות, העבירו את המנה באורך 100 מילימטר המכילה את הקלטות למכסה גלימה למינרי. העבר קלטות ללוחות בעלי שש בארות המכילות את תמיסת הדה-סלאריזציה הראשונה באמצעות המוסטאט מעוקל כדי לתפוס את הצדדים החרוצים.
לאחר מכן, הניחו את לוחית ששת הבארים על שייקר מסלולי ב-30 סל"ד למשך 10 דקות. שאפו את הנוזל מכל באר, ואז החליפו אותו בשלושה מיליליטרים של תמיסת הדה-תאיזציה השנייה לכל באר. מניחים את הצלחת על שייקר מסלולי ב-30 סל"ד ודוגרים במשך חמש דקות.
חזור על תהליך זה עם כל פתרון כמתואר בפרוטוקול הדה-סלולריזציה בכתב היד. לאחר השטיפה הסופית עם PBS, מעבירים את הרקמות לצלחות סטריליות בעלות שש בארות המכילות PBS טרי עם אנטיביוטיקה ואנטימיקוטיקה ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר עיקור עם אנטיביוטיקה ותרופות אנטי-מיקוטיות, ניתן לזרוע פיגומי רקמות ריאה באופן מיידי או לאחסן אותם בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד 30 יום.
לפני השימוש לתרבית, פיגומי הדגירה מאוחסנים בארבע מעלות צלזיוס עם PBS טרי ואנטיביוטיקה ואנטימיקוטיקה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס כשלב עיקור נוסף. לאחר מכן, לשטוף פיגומים עם PBS סטרילי, חמישה מיליליטרים לכל באר, שלוש פעמים, במשך חמש דקות כל אחד. בחנו פיגומים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 5 כדי לבחור רקמות לזריעה.
הכינו את תרחיף תאי האנדותל במדיום האנדותל ב-5 מיליון תאים למיליליטר עם מספיק תאים כדי לזרוע 500, 000 תאי אנדותל לפרוסה. מניחים אמבטיות זריעה אוטוקלאביות בכלי פטרי בקוטר 100 מ"מ ומעבירים בזהירות את פיגומי השטיפה במהופך לאמבטיות הזריעה. סובבו בעדינות את תרחיף התא המוכן כדי לערבב.
לאחר מכן, בזהירות pipette 100 microliters של תאים ישירות על גבי כל רקמה בבסיס הבארות, תוך הקפדה לא לפגוע ברקמה עם קצה פיפטה. מעבירים את הרקמות הנזרעות לחממת תרביות התאים. 24 שעות לאחר זריעת תאי האנדותל, הוסיפו 900 מיקרוליטרים של מדיום תרבית שחומם מראש לכל באר באמצעות פיפטה ידנית, ואז החזירו את הצלחת לחממה.
לאחר 24 שעות של זריעת תאים, יש להסיר את המדיום ולהחליף את מיליליטר אחד של מדיום אנדותל טרי לכל באר. 72 שעות לאחר זריעת תאי האנדותל, ספרו תאי AEC2s, או אפיתל נאדיים מסוג II, ופיברובלסטים באמצעות המוציטומטר והכנו תרחיף של 1:1 בתאי AEC2 במדיום גדילה AEC2 ב-5 מיליון תאים למיליליטר. פיפטה את המדיום מכל אמבט זריעה היטב וסובבה בעדינות את מתלה התא המוכן.
פיפט 100 מיקרוליטרים של תאים ישירות על גבי כל רקמה בבסיס הבאר. מעבירים את הרקמות הנזרעות לחממת תרביות התאים. לאחר שעתיים, הוסיפו 900 מיקרוליטרים של מדיום צמיחה AEC2 שחומם מראש לכל באר, ואז החזירו את הצלחת לחממה.
לאחר 24 שעות של תרבית עם AEC2s ופיברובלסטים, הכינו צלחת של 12 בארות עם מיליליטר אחד של מדיום צמיחה AEC2 שחומם מראש לכל באר, לכל קלטת. פיפט 800 מיקרוליטרים של מדיום מכל באר של אמבט הזריעה, ואז מוציאים את הקסטות מאמבטיית הזריעה ומעבירים אותן בצד ימין עד לצלחת המוכנה של 12 בארות, קלטת אחת לכל באר. שנה את מדיום התרבות בזהירות באמצעות פיפטת פסטר זכוכית כל יומיים למשך התרבות הרצויה.
עקוב אחר מידת אכלוס מחדש של רקמות באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה בהגדלה של פי 5 לאורך כל משך התרבית. צביעת H ו-E של פיגומי רקמות הראתה ארכיטקטורה של נאדיות שהשתמרה לאחר דה-סלאריזציה ללא גרעיני תאים נראים לעין. רקמת אלוואולר נצפתה כאשר פיגומי מטריצה חוץ-תאיים שעברו דה-תאיזציה נצפו בהגדלה של פי 5 על ידי מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה.
נתיבי אוויר וכלי דם מסתעפים גדולים נראו גם בחלק מהפרוסות. ביום השביעי של התרבית, מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה הראתה כי דפוס הרלולריזציה ברקמות ריאה מהונדסות חיקה את מבנה הרקמות במקרים של ריפולציה מוצלחת. גם רה-סלולרזציה לקויה נראתה לעין.
צביעת H ו-E ביום השביעי או השמונה הראתה אכלוס מחדש של הספטה הנאדית. עמידה אימונופלואורסצנטית גילתה פיברובלסטים חיוביים מסוג פרו-קולגן מסוג I אלפא 1, AEC2 חיוביים ל-ABCA3, תאי אנדותל חיוביים ל-CD31, AEC2s חיוביים ל-SPB בשפע. יתר על כן, בדיקת התימידין הראתה הרבה AEC2 מתרבים.
טכניקה זו הקלה על פיתוח אסטרטגיות להנדסת רקמות ריאה ואפשרה לחקור תורים התומכים בהתפשטות תאים מסוג II ובהבחנה בתוך הנאדיות.
