이 방법은 연구자가 간단하고 효과적인 지역 기반 분석을 사용하여 세포의 공동 배양을 분석하고 계산하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 널리 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 구현하기가 비교적 쉽고 공동 배양 설정 내에서 다양한 세포 유형을 식별하는 안정적이고 정확한 수단을 제공합니다. 이 방법은 세포의 특정 공동 배양이 조직 재생을 돕기 위해 어떻게 시너지 효과를 발휘하는지에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
이 방법은 또한 단일 배양 바이오마커 연구를 검증하기 위해 사용될 수 있다. 시작하기 위해, 미가공 264.7 대식세포를 섭씨 37도에서 배양하고, 단배양을 위해 5%이산화탄소를 FBS, 페니실린-스트렙토마이신, 중탄산나트륨 및 베타-메르캅토에탄올로 보충된 DMEM 한 밀리리터에서 25, 000 세포 센티미터 평방 평방 당 25의 밀도로 5밀리리터 세포 배양 플라스크에서 배양한다. NIH/3T3 세포를 10%FBS 및 1%페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 DMEM에서 배양한다.
공동 배양 영상화를 위해, 원시 264.7 대식세포 및 NIH/3T3 섬유아세포를 하나의 부분 원료 264.7 배지 및 한 부분 NIH/3T3 배지를 포함하는 공동 배양 배지를 사용하여 센티미터 평방 당 25, 000 세포의 다양한 비율 및 총 밀도로 함께 배양한다. 시딩 후, 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 인큐베이션하여 80%세포 합류의 생존 가능한 세포 밀도에 도달한다. 40X 목표가 장착된 반전 현미경을 사용하여 세포 이미지를 획득하려면 알고리즘의 용량을 결정하여 다양한 이미지 품질을 가진 이미지를 정확하게 평가합니다.
다양한 초점으로 이미지를 획득하여 비 구근 이미지와 구근 이미지를 모두 생성하고 원시 czi 파일로 내보냅니다. 영역 기반 방법을 사용하여 셀의 이미지를 가져오려면 분석할 이미지 파일을 복사하여 Bin에 붙여넣고 명령을 실행하여 파일 이름을 입력합니다. 실행을 눌러 프로그램을 시작합니다.
재구성을 통해 이미지를 분석한 다음 소스 함수를 사용하여 재구성하여 닫음으로써 각 명령을 실행하여 배경에서 전경을 확대합니다. 백분위수 기반 식별 시스템을 이용하여 재구성된 이미지들을 이진화시키기 위해, 주어진 이미지의 적어도 0.5%를 포함하는 가장 큰 픽셀 값을 갖는 최대 관련 픽셀로부터의 백분위수 차이를 사용하여 백분위수 차이를 사용하여 백그라운드로부터 셀들을 구별한다. 원시 264.7 대식세포의 픽셀 값을 분석 및 평가하여 값이 최대 관련 픽셀의 4.5% 내에 있는지 확인합니다.
그런 다음 픽셀을 셀룰러로 표시합니다. 전구 세포 프로파일을 포함하는 이미지의 경우, 세포 중심에서 잘못된 이진화를 수정하기 위한 반복적인 절차를 구현하십시오. 전체 셀 커버리지에 대한 초기 추측값을 결정합니다.
알고리즘을 실행하고 알파와 카파의 초기 추정치를 사용하여 이미지를 분석하여 섬의 일부를 채 웁니다. 그런 다음 사후 분석 셀 수와 커버리지를 사용하여 카파를 다시 계산하십시오. 이미지의 이진화 후 평균 셀 영역을 결정하려면, 명령을 실행하여 이미지 내에서 발견되는 모든 중심 위치와 원의 반경의 벡터를 구하십시오.
반경 출력을 사용하여 평균화하여 평균 셀 면적을 계산하고 최소 10개의 셀을 분석하여 정확한 면적 식별을 보장합니다. 앞에서 설명한 대로 명령을 사용하여 이미지 분석을 수행합니다. 그런 다음 원시 264.7 및 NIH / 3T3 세포의 이미지를 사용하여 매개 변수 phi를 실험적으로 결정하여 원시 264.7 및 NIH / 3T3 세포를 포함하는 공동 배양 분석을 수행하십시오.
초기 phi 값을 추측하고 세포 수 및 커버리지가 원시 264.7 및 NIH/3T3 공동 배양에 특정한 수동 카운트와 밀접하게 일치할 때까지 반복합니다. 단일 배양 이미지에 대해 이전에 설명된 바와 같이 총 세포 커버리지에서 원시 264.7 세포 카운트를 결정한다. phi 파라미터 없이 유역 형질전환 이미지를 다시 분석하여 대식세포와 섬유아세포를 모두 검출한다.
이전에 설명된 표준 임계값 지정 및 영역 기반 정량화 방법을 사용하여 얻은 원시 264.7 셀 픽셀을 선택적으로 빼서 NIH/3T3 섬유아세포 데이터를 획득합니다. 비구근 생 264.7 대식세포의 분석이 수행되었고 알고리즘 출력이 기록되었다. 알고리즘을 이용한 이미지의 평균 면적 계산은 226개의 세포를 계수하는 반면, 수동 카운트는 6%의 근사 오차 값을 갖는 241개의 세포를 식별하였고, 구근 생 264.7 대식세포의 분석도 수행되었다.
알고리즘 카운팅 알고리즘을 이용한 이미지의 평균 면적 계산은 12%의 대략적인 오차 값을 갖는 252개 세포의 수동 카운트에 의해 검증된 221개의 세포를 미가공 264.7 대식세포 및 NIH/3T3 섬유아세포를 모두 함유하는 공동배양물의 분석을 수행하였다. 원시 264.7 대식세포 카운트에 대한 알고리즘 출력은 137개였고, 수동 카운트는 대략 오차 값이 11%인 155개의 세포를 식별하여 세포 계수 알고리즘의 견고성을 결정하기 위해 5개의 원시 264.7 대식세포 이미지를 자동 세포 식별 및 수동 사용자 카운트로 계수하였다. 주사위 계수는 5개의 이미지에 걸쳐 0.85의 평균 파라미터로 얻어졌다.
이 프로토콜 내의 중요한 단계는 백분위수 기반 파라미터를 사용하는 것이며, 이는 단일배양 및 공동배양 이미지 모두에서 강력한 세포 검출을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 분자 생물학 기술을 사용하여 공동 배양 시스템에서 특정 세포 집단 및 바이오마커 개발을 정의하는 바이오마커를 평가하기 위해 추가 분석을 위해 관심있는 세포를 확인하는 데 사용될 수 있습니다.
