Diese Methode kann verwendet werden, um Forschern zu helfen, Co-Kulturen von Zellen mit einer einfachen und effektiven flächenbasierten Analyse zu analysieren und zu zählen. Diese Technik ist mit weit verbreiteter Software relativ einfach zu implementieren und bietet ein zuverlässiges und genaues Mittel zur Identifizierung verschiedener Zelltypen innerhalb einer Kokulturumgebung. Diese Methode kann Aufschluss darüber geben, wie spezifische Co-Kulturen von Zellen synergisieren, um die Geweberegeneration zu unterstützen.
Diese Methode kann auch zur Validierung von Monokultur-Biomarker-Studien eingesetzt werden. Zu Beginn kultivieren rohe 264,7 Makrophagen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für die Monokulturbildgebung in einem Milliliter DMEM, ergänzt mit FBS, Penicillin-Streptomycin, Natriumbicarbonat und Beta-Mercaptoethanol in einem Fünf-Milliliter-Zellkulturkolben bei einer Dichte von 25.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Kultur NIH / 3T3-Zellen in DMEM ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin.
Für die Kokulturbildgebung werden rohe 264,7-Makrophagen und NIH/3T3-Fibroblasten unter Verwendung von Kokulturmedium verwendet, das einen Teil rohes 264,7-Medium und einen Teil NIH/3T3-Medium zusammen bei unterschiedlichen Verhältnissen und einer Gesamtdichte von 25.000 Zellen pro Quadratzentimeter enthält. Nach der Aussaat inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um eine lebensfähige Zelldichte von 80% Zellzusammenfluss zu erreichen. Um Zellbilder mit einem inversen Mikroskop zu erfassen, das mit dem 40X-Objektiv ausgestattet ist, bestimmen Sie die Fähigkeit des Algorithmus, Bilder mit einer Reihe von Bildqualitäten genau auszuwerten.
Erfassen Sie Bilder in Graustufen mit unterschiedlichen Schwerpunkten, um sowohl Nicht-Bulbus- als auch Bulbus-Bilder zu erzeugen, und exportieren Sie sie in die Czi-Rohdatei. Um Bilder von Zellen mit der flächenbasierten Methode zu erhalten, kopieren Sie die Bilddatei zur Analyse, fügen Sie sie in den Papierkorb ein und geben Sie den Dateinamen ein, indem Sie den Befehl ausführen. Klicken Sie auf Ausführen, um das Programm zu starten.
Analysieren Sie die Bilder durch Öffnen durch Rekonstruktion, gefolgt von Schließen durch Rekonstruktion mit Quellfunktionen, um den Vordergrund aus dem Hintergrund durch Ausführen des jeweiligen Befehls zu vergrößern. Um die rekonstruierten Bilder unter Verwendung eines perzentilbasierten Identifikationssystems zu binarisieren, unterscheiden Sie die Zellen vom Hintergrund, indem Sie eine Perzentildifferenz von dem maximal relevanten Pixel mit dem größten Pixelwert verwenden, der mindestens 0,5% eines bestimmten Bildes ausmacht. Analysieren und bewerten Sie die Pixelwerte für unformatierte 264.7-Makrophagen und stellen Sie sicher, dass die Werte innerhalb von 4,5% des maximal relevanten Pixels liegen.
Markieren Sie dann das Pixel als zellulär. Implementieren Sie für Bilder, die Bulbus-Zellprofile enthalten, ein iteratives Verfahren, um eine fehlerhafte Binarisierung in den Zentren der Zellen zu korrigieren. Bestimmen Sie eine erste Schätzung für die gesamte Zellabdeckung.
Führen Sie den Algorithmus aus und analysieren Sie Bilder mit ersten Schätzungen von Alpha und Kappa, um einen Teil der Inseln zu füllen. Verwenden Sie dann die Zellzahlen und die Abdeckung nach der Analyse, um kappa neu zu berechnen. Um die durchschnittliche Zellfläche nach der Binarisierung des Bildes zu bestimmen, erhalten Sie einen Vektor aller Mittelpositionen und Radien von Kreisen, die innerhalb des Bildes gefunden wurden, indem Sie den Befehl ausführen.
Verwenden Sie die Radienausgänge, um die durchschnittliche Zellfläche durch Mittelung zu berechnen und mindestens 10 Zellen zu analysieren, um eine genaue Flächenbestimmung sicherzustellen. Führen Sie die Bildanalyse mit den zuvor beschriebenen Befehlen durch. Führen Sie dann eine Analyse von Co-Kulturen durch, die rohe 264.7- und NIH / 3T3-Zellen enthalten, indem Sie experimentell einen Parameter phi unter Verwendung von Bildern von rohen 264.7- und NIH / 3T3-Zellen bestimmen.
Erraten Sie einen anfänglichen Phi-Wert und iterieren Sie, bis Zellzählung und Abdeckung eng mit den manuellen Zählungen übereinstimmen, die für die rohe 264,7- und NIH / 3T3-Kokultur spezifisch sind. Bestimmen Sie die rohen 264,7 Zellzahlen in der Gesamtzellabdeckung, wie zuvor für die Monokulturbilder beschrieben. Analysieren Sie das transformierte Bild der Wasserscheide erneut ohne den Phi-Parameter und erkennen Sie sowohl Makrophagen als auch Fibroblasten.
Erfassen Sie NIH/3T3-Fibroblastendaten durch selektive Subtraktion von rohen 264,7 Zellpixeln, die mit den zuvor beschriebenen Standardschwellenwert- und flächenbasierten Quantifizierungsmethoden erhalten wurden. Es wurde eine Analyse von nicht-bulbus rohen 264,7-Makrophagen durchgeführt und Algorithmusausgaben aufgezeichnet. Durchschnittliche Flächenberechnungen des Bildes mit Algorithmus zählten 226 Zellen, während eine manuelle Zählung 241 Zellen mit einem ungefähren Fehlerwert von 6% identifizierte.
Die durchschnittlichen Flächenberechnungen des Bildes unter Verwendung des Algorithmus zählten 221 Zellen, verifiziert durch eine manuelle Zählung von 252 Zellen mit einem ungefähren Fehlerwert von 12%Die Analyse von Kokulturen, die sowohl rohe 264,7-Makrophagen als auch NIH / 3T3-Fibroblasten enthielten, wurde durchgeführt. Die Algorithmusausgaben für die rohe Makrophagenzahl von 264,7 betrugen 137, während eine manuelle Zählung 155 Zellen mit einem ungefähren Fehlerwert von 11% identifizierte.Um die Robustheit des Zellzählalgorithmus zu bestimmen, wurden fünf rohe 264,7-Makrophagenbilder durch automatische Zellidentifikation und manuelle Benutzerzählungen gezählt. Der Würfelkoeffizient wurde mit einem durchschnittlichen Parameter von 0,85 über fünf Bilder erhalten.
Der entscheidende Schritt innerhalb dieses Protokolls ist die Verwendung von Perzentil-basierten Parametern, die eine robuste Zelldetektion sowohl in Monokultur- als auch in Co-Kultur-Bildern ermöglichen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Zellen von Interesse für die weitere Analyse unter Verwendung molekularbiologischer Techniken zu identifizieren, um Biomarker zu bewerten, die spezifische Zellpopulationen und die Entwicklung von Biomarkern in Kokultursystemen definieren.
