이 방법은 단일 세포 수준에서 세균균 균주 사이의 유형 VI 분비 시스템을 통해 접촉 의존적 경쟁을 정량화하도록 설계되었습니다. 이 기술은 세포 수가 아닌 총 세포 영역을 사용하여 세균 경쟁을 정량화하므로 독점적인 이미지 분석 소프트웨어 액세스가 없는 연구원이 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 방법은 다양한 컬처 가능한 미생물 간의 경쟁을 정량화하기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다.
또한 실험 용 설정은 수직 또는 반전 된 현미경에 사용하기 위해 최적화 될 수 있습니다. 우선, 해양 PBS에 2% 낮은 녹는 아가로즈를 용해하여 아가로즈 패드 용액을 준비한다. 아가로즈가 완전히 용해될 때까지 전자레인지와 소용돌이에서 약 30초 간 간단히 가열합니다.
이 솔루션을 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 55도의 수조에 보관하십시오. 다음으로, 유리 슬라이드 주위에 실험실 테이프조각을 5번 감쌉니다. 동일한 슬라이드에서 테이프를 반복하여 두 테이프 조각 사이의 거리가 커버슬립 너비보다 약간 작습니다.
평평한 아가로즈 패드 표면을 보장하기 위해 파이펫 웜 아가로즈 용액은 두 개의 테이프 사이에 있으며 커버 슬립이 액체와 접촉하고 아가로즈 용액의 거품을 밀어 내는 등 즉시 커버 슬립을 위에 놓습니다. 아가로즈 패드가 실온에서 적어도 한 시간 동안 고형화하게 하십시오. 그런 다음 이 아가로즈 패드를 면도날로 절단하여 이미징에 사용할 수 있는 4개의 5 평방 밀리미터 패드로 자른다.
공동 배양을위한 균주를 준비하기 위해, 적절한 항생제로 보충 LBS 천 접시에 냉동 주식에서 각 변형을 줄이며 24 섭씨에서 하룻밤 을 배양. 다음 날, 각 균주에서 두 개의 식민지를 선택하고 항생제 보충 LBS 배지에서 식민지를 다시 중단. 인큐베이션은 1분당 200회전에서 흔들림으로 섭씨 24도에서 하룻밤 사이에 식민지를 다시 중단했습니다.
다음 날 아침, 하위 배양은 각각 항생제 없이 1, 000배 신선한 LBS 배지로 복제하고 세포가 600나노미터에서 약 1.5의 광학 밀도에 도달할 때까지 배양합니다. 모든 시료에 대해 600나노미터의 광학 밀도를 측정하고 기록합니다. LBS 배지로 배양을 희석하여 각 샘플을 하나의 광학 밀도로 정규화합니다.
라벨이 부착된 1.5 밀리리터 튜브에 각 정규화된 균주의 30 마이크로리터를 추가하여 두 개의 경쟁 균주를 동등한 비율로 혼합합니다. 1~2초 동안 혼합 변형 배양을 소용돌이시다. 각 생물학적 복제 및 치료에 대한 경쟁 균주를 혼합하여 총 4개의 혼합 균주 튜브를 생성합니다.
공동 배양 중에 접촉 의존적 인 살인을 위해 충분히 조밀 한 경쟁 세포를 보장하기 위해 원심 분리에 의해 각 혼합 배양을 세 배로 농축합니다. 상체를 버리고, LBS 배지의 20 마이크로리터에서 각 펠릿을 재연하고 각 샘플에 대한 농도 절차를 수행한다. 반전 된 현미경에 이미징하는 경우, 35 밀리미터 페트리 접시의 숫자 1.5 커버 슬립 바닥에 혼합 문화의 두 마이크로 리터를 발견하고 공동 잠복 자리 위에 아가로즈 패드를 배치하여 시작합니다.
아가로즈 패드 위에 12mm 원형 유리 커버슬립을 놓습니다. 나머지 세 가지 혼합 문화에 대한 커버 슬립을 반복적으로 발견하고 배치하면 4 가지 요리가 이미지화됩니다. 앞으로 진행하기 전에 슬라이드가 약 5 분 동안 벤치 상단에 앉아 세포가 이미징 프로세스 중에 움직임을 피하기 위해 한천 패드에 정착 할 수 있게하십시오.
먼저 DIC를 사용하여 세포에 초점을 맞추어 광표백 효과를 최소화합니다. 단일 세균 세포의 평균 크기에 따라 100X 오일 목표를 사용합니다. 배경 감지를 최소화하여 각 채널의 노출 시간 및 획득 설정을 조정합니다.
각 적절한 채널에서 최소 5개의 뷰 필드를 선택하고 이미지를 수집합니다. 분석할 이미지 분석 소프트웨어를 열고 이미지 파일을 가져옵니다. 이미지를 회색 크기로 변환하고 채널을 분리하고 미리 처리된 이미지의 임계값 및 이진 마스크를 만드는 것으로 시작합니다.
분석을 선택한 다음 드롭다운 메뉴에서 배율 설정을 선택하고 현미경 설정에 적합한 값을 입력합니다. 다음으로 측정값을 설정하고 영역을 선택합니다. 분석 탭에서 기본 설정을 사용하여 파티클 을 분석합니다.
이물질이 샘플에 존재하는 경우 비셀 입자를 필터링하기 위해 크기 또는 원형을 조정할 수 있습니다. 필터 아웃 분석의 출력에 분석된 모든 파티클의 번호가 매겨진 윤곽선이 포함되도록 표시 를 선택한 다음 윤곽선을 선택합니다. 추가 분석 및 그래프를 위해 측정값을 스프레드시트 소프트웨어로 내보냅니다.
각 실험 치료의 대표적인 형광 이미지가 표시됩니다. 발견하기 전에 혼합 배양을 집중하면 2 시간 이상 둥글거나 사라진 표적 세포가 성공적으로 억제되었음을 나타냅니다. 혼합 배양이 집중되지 않을 때, 세포는 슬라이드에 분산되어 있습니다.
충분한 세포 대 세포 접촉없이, 표적 균주는 치명적인 균주에 의해 억제되지 않습니다. 대상 셀은 혼잡하거나 분산된 조건에서 T6SS 돌연변이와 공동 배양할 때 사라지지도 않고 둥글게 되지 않았습니다. 따라서, 표적은 어느 치료에서도 억제되지 않았다.
입자 분석 결과는 표적 변형 및 억제제 균주 모두에 대해 그래프화 및 분석되었습니다. 최종 시점의 초기 목표 영역의 100% 이상은 목표의 순 증가를 나타내며 초기 목표 영역의 100% 미만은 대상의 순 감소를 나타냈다. 억제제 균주의 순 성장은 모든 치료에 걸쳐 관찰되었다.
그러나, 억제제 균주에 대한 초기 영역의 백분율은 야생형 억제제가 다른 모든 치료법에 비해 혼잡한 조건에서 대상과 공동 배양되었을 때 상당히 높았다. 선명한 이미지를 얻으려면 아가로즈 패드는 가능한 한 평평해야 합니다. 테이프 조각을 잘라내어 슬라이드 주위에 포장하여 길이가 동일한지 확인합니다.
