Este método fue diseñado para cuantificar la competencia dependiente del contacto a través del sistema de secreción de tipo VI entre cepas bacterianas a nivel de una sola célula. Esta técnica utiliza el área celular total en lugar de los recuentos celulares para cuantificar las competiciones bacterianas, lo que facilita a los investigadores sin acceso a un software de análisis de imágenes patentado. Este método se puede modificar fácilmente para cuantificar la competencia entre diversos microbios cultivables.
Además, la configuración experimental se puede optimizar para su uso en microscopios verticales o invertidos. Para empezar, prepare la solución de almohadilla de agarosa disolviendo la agarosa de fusión baja al 2% en PBS marino. Calentar la solución brevemente durante unos 30 segundos en el microondas y el vórtice hasta que la agarosa se disuelva por completo.
Mantenga esta solución en un baño de agua de 55 grados Celsius hasta que esté lista para usar. A continuación, envuelva un trozo de cinta de laboratorio alrededor de un portaobjetos de vidrio cinco veces. Repita el envoltorio de la cinta en la misma diapositiva, de modo que la distancia entre las dos piezas de cinta sea ligeramente menor que el ancho de la cubierta.
Para garantizar una superficie plana de la almohadilla de agarosa, pipetee la solución de agarosa caliente entre las dos piezas de cinta e inmediatamente coloque una cubierta en la parte superior de modo que la cubierta haga contacto con el líquido y empuje cualquier burbuja en la solución de agarosa. Deje que la almohadilla de agarosa se solidifique a temperatura ambiente durante al menos una hora. Luego corte esta almohadilla de agarosa con una cuchilla de afeitar en cuatro almohadillas de 5 milímetros cuadrados para ser utilizadas para la obtención de imágenes.
Para preparar las cepas para la coincubación, salga cada cepa de las existencias congeladas en las placas de agar LBS suplementadas con los antibióticos apropiados e incube durante la noche a 24 grados centígrados. Al día siguiente, elija dos colonias de cada cepa y resuspenda las colonias en medio LBS suplementado con antibióticos. Incuba colonias resuspendidas durante la noche a 24 grados centígrados con agitación a 200 rotaciones por minuto.
A la mañana siguiente, cada subcultivo biológico replica uno en 1, 000 veces el medio LBS fresco sin antibióticos e incuba hasta que las células alcanzan una densidad óptica de aproximadamente 1.5 a 600 nanómetros. Mida y registre la densidad óptica a 600 nanómetros para todas las muestras. Normalizar cada muestra a una densidad óptica de una diluyendo el cultivo con medio LBS.
Mezcle las dos cepas competidoras en una proporción igual agregando 30 microlitros de cada cepa normalizada a un tubo etiquetado de 1.5 mililitros. Vórtice el cultivo de cepas mixtas durante uno o dos segundos. Mezcle las cepas competidoras para cada réplica biológica y tratamiento para generar un total de cuatro tubos de deformación mixta.
Concentrar cada cultivo mixto tres veces mediante centrifugación para asegurar células competidoras suficientemente densas para la matanza dependiente del contacto durante la coincubación. Deseche el sobrenadante, resuspante cada pellet en 20 microlitros de medio LBS y realice procedimientos de concentración para cada muestra. Si toma imágenes en un microscopio invertido, comience por detectar dos microlitros de un cultivo mixto en el fondo de la cubierta número 1.5 de una placa de Petri de 35 milímetros y coloque la almohadilla de agarosa sobre el punto de co-incubación.
Coloque una funda de vidrio circular de 12 milímetros sobre la almohadilla de agarosa. Repita la detección y colocación de la cubierta para las tres culturas mixtas restantes, lo que dará como resultado cuatro platos para ser fotografiados. Antes de continuar, deje que las diapositivas se asienten en la mesa de trabajo durante unos cinco minutos para permitir que las células se asienten en la almohadilla de agar para evitar el movimiento durante el proceso de obtención de imágenes.
Comience por enfocarse en las células que usan DIC para minimizar los efectos del fotobleaching. Basado en el tamaño promedio de una sola célula bacteriana, use un objetivo de aceite 100X. Ajuste el tiempo de exposición y la configuración de adquisición para cada canal con una detección de fondo mínima.
Seleccione al menos cinco campos de visión y adquiera imágenes en cada canal apropiado. Abra el software de análisis de imágenes e importe los archivos de imagen que se van a analizar. Convierta la imagen a escala de grises, separe los canales y comience por establecer un umbral y crear una máscara binaria de la imagen prep procesada.
Seleccione Analizar y, a continuación, en el menú desplegable, seleccione Establecer escala e introduzca los valores adecuados para la configuración de la microscopía. A continuación, vaya a establecer medidas y seleccione Área. En la pestaña analizar, seleccione analizar partículas con la configuración predeterminada.
Si hay escombros presentes en la muestra, el tamaño o la circularidad podrían ajustarse para filtrar las partículas no celulares. Seleccione Mostrar y, a continuación, Contornos para que el resultado del análisis de filtrado incluya un contorno numerado de todas las partículas analizadas. Exporte las mediciones a un software de hoja de cálculo para su posterior análisis y gráficos.
Se muestran las imágenes de fluorescencia representativas de cada tratamiento experimental. El cultivo mixto concentrado antes de la detección dio lugar a células diana redondeadas o desaparecidas durante dos horas, lo que indica una inhibición exitosa. Cuando el cultivo mixto no está concentrado, las células permanecen dispersas en el portaobjetos.
Sin suficiente contacto de célula a célula, la cepa objetivo no es inhibida por la cepa letal. Las células objetivo no desaparecieron ni se redondearon cuando se coincubó con un mutante T6SS en condiciones de hacinamiento o dispersión. Por lo tanto, el objetivo estaba desinhibido en cualquiera de los tratamientos.
Los resultados del análisis de partículas se graficaron y analizaron tanto para la cepa objetivo como para la cepa inhibidora. Más del 100% del área objetivo inicial en el punto de tiempo final representa un aumento neto en el objetivo e inferior al 100% del área objetivo inicial indicó una disminución neta en el objetivo. El crecimiento neto de la cepa inhibidora se observó en todos los tratamientos.
Sin embargo, el porcentaje del área inicial para la cepa inhibidora fue significativamente mayor cuando un inhibidor de tipo salvaje se co-incubó con el objetivo en condiciones de hacinamiento en comparación con todos los demás tratamientos. Para obtener imágenes claras, la almohadilla de agarosa debe ser lo más plana posible. Corte las piezas de cinta adhesiva antes de envolverlas alrededor de la diapositiva para asegurarse de que tienen la misma longitud.
