이 비디오에서는 전송된 경현미경 기술을 사용하여 모델 곰팡이 아스퍼질러스 니둘란스의 이미지를 캡처하는 라벨 무료 라이브 이미징 프로토콜을 설명합니다. 우리는 액체와 고체 매체 모두에서 아스퍼 길러스 니둘란의 성장 운동학을 분석하고 정량화하기 위해이 이미지를 사용합니다. 이 프로토콜을 시각적으로 표현하면 사용자가 이미지 캡처 및 현미경 이미지 처리의 중요한 단계에 익숙해질 수 있습니다.
필라멘트 곰팡이 성장을 측정하는 데 사용되는 일반적인 방법은 영양 천을 함유 한 페트리 접시에 두 개의 접종 곰팡이 포자가 며칠 후 개발 식민지의 직경을 측정하는 것입니다. 그러나, 이 방법은 미세한 성장 차이를 정량화하기에 충분히 민감하지 않습니다. 따라서 시간 경과 현미경 검사를 이용한 단일 세포 측정이 개발되었다.
이 측정은 정확하고 정량적인 결과를 제공할 뿐만 아니라 인구 내의 다른 세포의 성장 역학을 반영할 수 있습니다. 더욱이, 이 접근은 내인성 및 환경 신호에 곰팡이 성장 반응에 관련시킨 분자 기계장치의 더 나은 이해를 목표로 합니다. 먼저 15밀리리터의 액체 영양사 한고를 페트리 요리에 붓는다.
뚜껑을 상단에 놓고 식힙니다. UV 방사선을 사용하여 플레이트를 살균하십시오. 스톡에서 관심의 곰팡이 변형을 줄무늬하기 전에, 그것은 붉은 뜨거운 때까지 분젠 버너에서 조정 루프를 가열, 한천에 찔러 루프를 냉각.
튜브를 소용돌이치며 적절한 영양 요구 사항으로 보충된 최소한의 매체의 표면을 가로질러 루프를 줄입니다. 섭씨 37도에서 2~3일 동안 플레이트를 배양합니다. 멸균 이쑤시개를 사용하여 단일 콜로니아를 완만하게 터치하여 소수의 코니디아를 완전한 미디어 플레이트에 부드럽게 만지십시오.
섭씨 37도에서 3~4일 동안 플레이트를 배양합니다. 아스퍼질러스 니둘란스의 코니디아는 멸균 1.5 밀리리터 소용돌이 튜브에서 수확되며, 1.0 밀리리터의 오토클레이브 증류수는 부피당 0.05%의 부피를 함유하고 있으며, 트위엔 80은 콘니디아 덩어리의 수를 줄입니다. 반전 된 천 방법의 수정 된 버전은 천 중간 표면에 필라멘트 곰팡이를 이미징하는 데 사용됩니다.
처음에는 10 개의 마이크로 리터 알리쿼트(10개의 미세리터 알리쿼트)가 활발하게 소용돌이 를 피력으로 유지하며, 밀리리터당 약 2배 104개의 세포가 페트리 접시에 15밀리리터 의 최소 배지에 15밀리리터의 10개의 무게로 한 개의 무게를 가진 알수 있습니다. 조사할 개발 단계에 따라 실험 문화를 배양한다. 여기서 우리는 섭씨 30도에서 3 일 동안 배양합니다.
그 후, 멸균 메스를 사용하여 식민지를 함유한 한천 블록을 슬라이스한다. 여기서 우리는 식민지 마진에서 한천의 쐐기를 자르고 반전하고 한천 조각을 8 개의 잘 슬라이드로 놓습니다. 10 마이크로 리터 알리쿼트의 활발한 소용돌이 원전 현탁액은 적절한 보충제로 최소 배지 200 마이크로리터를 함유하는 웰 슬라이드의 우물에서 4개의 힘으로 약 2배 10의 힘으로 진행한다.
매번 검사할 시간과 온도를 위한 인큐베이션. 현미경의 선택은 사용 가능한 장비에 따라 달라집니다. 어쨌든, 설정된 현미경에는 반전 된 단계, 환경 챔버 또는 적어도 정밀한 공기 온도 제어가있는 방이 포함되어야합니다.
처음에 온도 조절기와 현미경 챔버를 예열하여 원하는 온도를 안정화시합니다. 여기서 우리는 섭씨 30도에서 온도를 설정합니다. 현미경, 스캐너 전원, 레이저 전원 및 컴퓨터를 켜고 이미징 소프트웨어를 로드합니다.
현미경 단계와 초점에 이전에 준비 된 잘 슬라이드를 배치합니다. 이미지 분석 중에 성장 측정을 용이하게 하기 위해 중복되는 셀이 아닌 격리된 셀또는 적어도 혼잡하지 않은 뷰 필드를 찾아보십시오. 필요한 경우 형광 검출기뿐만 아니라 전송된 광 검출기뿐만 아니라 활성화할 전송된 광 현미경 법을 선택하십시오.
현미경을 설정하여 원하는 시간 간격으로 이미지를 획득하고 타임시리즈 수집을 시작합니다. 이미지의 로딩, 시각화 및 처리는 오픈 소스 이미지J 피지 소프트웨어로 수행됩니다. 형식으로 플러그인을 사용하여 피지에 이미지를 가져 오게하여 시작합니다.
기본 색상 모드와 자동 축척을 선택합니다. 오버레이가 분석, 도구, 스케일 바를 이동함에 따라 타임스탬프와 스케일 바를 시각화하기 위해. 배율 막대의 너비, 높이, 색상 및 위치에 대해 원하는 매개변수를 설정합니다.
imageJ 피지 소프트웨어에 이미지 속성을 표시하려면 이미지, 속성으로 이동합니다. 프레임 간격 정보를 관찰합니다. 여기서 우리는 약 15 분의 시간 간격을 사용하고 괜찮습니다 누릅니다.
그런 다음 이미지, 스택, 레이블로 이동하여 올바른 정보를 간격으로 설정합니다. X를 수정하여 레이블의 위치를 설정하고 Y.는 필드 텍스트에서 측정 장치를 설정하고 미리 보기를 누릅니다. 히스토그램 매칭을 사용하여 이미지, 조정, 표백제 보정, 히스토그램 매칭을 선택하여 서로 다른 프레임 간의 조명 보정을 사용하십시오.
수정된 조명이 있는 새 창이 나타납니다. 플러그인에서 MtrackJ 플러그인을 사용, MtrackJ, 성장 하이픈 팁을 추적하려면 트랙을 추가, 도구 모음에 추가 버튼을 선택하고 마우스의 왼쪽 클릭을 사용하여 최면 팁에 첫 번째 지점을 배치. 타임 시리즈는 자동으로 다음 프레임으로 이동합니다.
추적 프로세스를 완료하려면 마지막 지점에서 마우스를 두 번 클릭하거나 이스케이프 키를 누릅니다. 최면 팁 증가를 계산하기 위한 가장 중요한 열인 출력 테이블을 스크롤하는 것은 지정된 프레임의 속도입니다. 안전 트랙 측정, 파일을 추가, 저장, 당신의 선택의 파일 형식에, 예를 들어, CSV, 스프레드 시트 프로그램에 저장된 파일을 가져 와서 시각화 및 추가 테스트를 계산합니다.
영화 버튼을 눌러 모든 표준 멀티미디어 플레이어에서 시각화할 수 있는 트랙이 그려진 프레임이 포함된 RGB 컬러 유형을 생성합니다. 이 프로토콜에 따라 필라멘트 균구 아스퍼질러스 니둘란스의 다양한 성장 및 발달 단계에 해당하는 다양한 이미지를 캡처하고 분석했습니다. 그림은 야생 유형 과 azhAD 델타 ngnA 델타 성장률 측정의 비교를 보여줍니다.
azhAD 델타 ngnA 델타는 두 개의 카복실산에 첨가된 독성 전투기 제품 L의 해독 및 동화에 연루된 두 개의 유전자에서 이중 삭제 변형입니다. 그것은 침수 액체 배양에서 야생 형 변형에 비해 통계적으로 유의낮은 성장 속도 측정을 보여줍니다. 성장의 이 차이는 고체 최소 배지에서 이 두 균주의 식민지 영역을 측정함으로써 검출할 수 없다.
단일 세포, 장기 라이브 이미징은 세포 단백질 역학의 공간 및 측두적인 정보를 얻기 위한 노력의 중요한 가치입니다. 이 프로토콜은 장기 살아있는 세포 이미징을 수행하기에도 적합합니다. 여기서 우리는 GFP 표지 코어 eisosomal 단백질 PilA 및 mRFP 히스토넨 H1을 공동 표현하는 conidia의 발아를 봅트합니다. 여기에서는 사용자로부터 이전의 이미지 분석 경험이 필요 없이 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 방식으로 곰팡이 성장 운동학을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.
이 프로토콜은 곰팡이 성장의 객관적인 정확한 정량화를 허용합니다.
