Name: odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth
Uploaded: 2017-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
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저자는 미국 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 JDA에 U54 RR022220 및 P50 GM076547 교부금으로이 연구에 대한 지원을 인정합니다. FDM은 Canadian Institute for Health Research의 박사후 연구원입니다. 우리는 룩셈부르크 시스템 생물 의약 센터와 룩셈부르크 대학의 지원에 감사드립니다.

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

ODELAY 분석법은 재현 가능하고 신뢰할 수있는 표현형 측정을 보장하기위한 몇 가지 중요한 포인트를 가지고 있습니다. 첫 번째 중요한 점은 효모 배양 물의 일관된 준비입니다. 로그 성장에서 효모 세포를 수확하기 위해주의를 기울여야합니다. 양식이 포화 된 경우, 개체군의 이질성이 증가하여 유전 적 또는 환경 적 요인 ( 예 : 탄소원)으로 인한 이질성을 혼란스럽게 할 수 있습니다 11 . 두 번째 중요한 점은 일관된 미디어 준비입니다. 일반적으로 대량의 10X 스톡 미디어 솔루션을 생성 한 다음 배치 효과를 최소화하기 위해 시간 경과에 따라 사용해야합니다. 가능하면 체중으로 배지를 배합하는 것은 한천의 밀도와 아가로 오스의 전체 수분 함량을 면밀히 관찰함으로써 시간이 지남에 따라 배지의 일관성을 향상시키는 데 도움이됩니다. 세 번째 중요한 포인트는 아가로 오스의 기계적 변형을 최소화하거나 제거하는 것입니다.dia. 매체의 기계적 변형은 유리 슬라이드에서 아가로 오스를 분리하는 동안 가장 일반적으로 발생합니다. 많은 실험 기술과 마찬가지로이 단계를 익히려면 실습이 필요합니다. 도 4 에 도시 된 바와 같은 지연 시간의 변화는 종종 아가로 오스 배지의 기계적 변형, 성형 된 한천 두께의 변화 또는 불안정한 광원과 같은 3 가지 요인 중 하나와 관련된다. 아가로 오스 매체가 얼룩이 지어진 어레이에서 Z 높이가 변하면 높이 변화가 자동 초점 루틴의 범위를 압도하여 초기 이미지의 초점이 약간 벗어날 수 있습니다. 이러한 이유 때문에 중앙의 여러 지점에서 스포트라이트 된 어레이의 가장자리를 따라 초점 높이를 확인하여 자동 초점 루틴이 초점을 찾을 수있는 충분한 Z 범위를 갖도록하십시오. 필요한 경우 자동 초점 패널을 사용하여 초점 범위를 늘리고 초점 단계 수를 늘립니다. 세 번째 가능한 조건이온은 불안정하거나 깜박 거리는 광원으로 특정 Z 높이에 대해 계산 된 초점 점수를 방해 할 수 있습니다. 텅스텐 할로겐 전구는 전구가 다 타기 전에 잘 깜박입니다. 열악한 초점의 효과는 성장 곡선이 제 1 및 제 2 시점 ( 도 5a ) 사이에서 감소하고, 인접한 지점이 동일한 딥 ( 도 5b )을 갖지 않는 일례에서 관찰된다. 이 경우, 빈약 한 초점 상태는 텅스텐 할로겐 광원을 대체함으로써 완화되었다. 실제로 저자들은 100W 텅스텐 할로겐 전구의 깜박 거림을 줄이기 위해 현미경을 많이 사용할 때 500 시간마다 또는 대략 2 개월마다 전구를 교체해야한다는 사실을 발견했습니다. 깜박 거리는 전구로 인한 초점 문제를 피하려면 텅스텐 할로겐 광원을 자주 교체하거나 할로겐 전구를 다이오드 광원으로 교체하십시오. 안그림 6 은 배가 시간의 변화가 적고 균일 한 지연 시간을 보이는 데이터 세트의 예입니다. 이 데이터 세트는 오토 포커스를 수행하는 동안 시간이 지남에 따라 더 안정적인 조명을 제공하는 다이오드 조명 장치로 촬영되었습니다. 문헌에서 미디어 준비를 최적화하기 위해 여기에 언급 된 많은 점들이 명백하게 보일 수 있지만, 대부분의 대규모 스크린은 서로 잘 복제되지 않습니다 8 , 11 . 따라서, 우리는 재현 가능한 표현형 스크린이 생성 될 수 있도록 배양 물 및 아가 로스 배지의 준비를주의 깊게 기술 하였다. ODELAY 분석법은 합성 유전자 배열이나 Scan-O-Matic 분석법과 같은 피닝 기반 분석법과 비교할 때 현재 처리량이 제한적입니다. 이 방법은 측정되는 균주의 수를 증가 시키지만, 개별 세포를 분해하는 능력은 부족합니다.그러므로 우리는 clonal 효모 균주 내에서 관찰 된 개체 이질성을 측정 할 수 없다. 이 개체의 이질성의 기원은 현재 이해되지 않지만 여기에 설명 된대로 기술과 계산의 병합은 기본 세포 메커니즘을 객관적으로 다루기위한 기회를 제공합니다 12 . 저자는 ODELAY가 현재 특정 현미경 브랜드 및 신체 유형에 대해서만 최적화되어 있음을 참고하고자합니다. 다른 현미경 시스템 용으로 ODELAY를 수정하는 것은 간단하지만 오픈 소스 API 13에 대한 지식이 필요합니다. 그러나 API와 ODELAY 스크립트는 서로 다른 시스템과 실험 분석에 쉽게 적용 할 수 있도록 작성되었습니다. ODELAY는 원래 효모를 위해 개발되었지만 변형없이 Mycobacterium smegmatis의 성장을 관찰 할 수있었습니다. 미생물을 형성하는 다른 콜로니의 관찰은제공된 소스 코드에 대한 변경으로 가능 11 . 일반적으로, ODELAY는 다양한 환경 조건과 유전 섭동 하에서 성장한 미생물을 비교하기위한 강력하고 유연한 도구입니다.

미생물의 성장 phenotypes은 주어진 환경 조건에 대한 근본적인 유전 적 적합성의 강력한 지표입니다. 성장은 고전적으로 3 개의 다른 성장 체제로 구분됩니다 : 지연 기, 로그 기 및 정지상 성장 1 . 각 성장 단계는 다양한 환경 적 및 유전 적 조건에 따라 달라지는 적합성의 다른 측면을 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 유기체가 기하 급수적 인 성장을 시작하기 전에 지연 단계에 머무르는 시간 또는 지연 시간은 변화된 환경 조건에 반응하는 유기체의 능력을 나타낼 수 있습니다 2 . 생체 적합도의 가장 보편적 인 측정 기준 인 로그 - 위상 성장 동안 배가되는 시간은 복제를 위해 환경 물질을 대사 및 이용함으로써 생물체가 분열하는 능력의 전반적인 효율성을 보여줍니다. 로그 위상 이후의 성장이 급격히 감소하는 고정 위상 (stationary phase)은 피트니스의 또 다른 지표로, 규칙적인spot-based 효모 성장 분석에서 성장 종점으로 사용됩니다. 몇몇 효모 성장 분석은 현재 이용 가능하며 효모 3 , 4 , 5 에서 성장 표현형을 평가하기위한 표준 방법으로 고려됩니다. 이 분석법은 주로 고체 또는 액체 배지에서 효모를 성장시키는 방법을 기본으로합니다. 고체 배지에서, 콜로니 피닝 분석은 핀으로 고체 한천에 소수의 세포를 옮기고 효모 세포는 정의 된 기간 동안 성장하도록 허용됩니다. 식민지가 그 다음에 이미지화되고 종단점에서 크기가 비교된다. 이러한 콜로니 고정 분석법은 유전체 와이드 스크린을 생성하기 위해 견고하고 확장 성이 입증되었습니다. 최근에는 flat-bed 스캐너와 SLR (Single Lens Reflex) 카메라를 사용하는 주기적 이미징이 이러한 분석에 통합되어 시간 경과에 따른 콜로니 증가를 기록합니다 7 , 8, 9 . 그러나, 이들 장치의 해상도는 단일 세포를 검출하는 것을 방해하므로, 이러한 콜로니 피닝 검정법은 래그 시간을 직접 관찰하지 않고 콜로니로 성장하는 개별 세포들 사이의 변이를 관찰 할 수 없다. 액체 기반 성장 분석은 또한 게놈 전체 화면을 수행하기 위해 사용되었습니다 3 . 시간 경과 현미경으로 액체 성장 분석을 결합하면 유전 적으로 동일한 개별 세포의 배가 시간에 인구 이질성이 나타 났으며 이는 유전 조절과 환경 적응을 이해하는 데 중요한 관점을 제공합니다. 그러나이 분석은 지연 시간 및 운반 용량과 같은 다른 성장 측면을 측정하지 않습니다. 여기에 우리는 ODELAY 11 이라는 분석법을 사용하여 고체 배지에서 미생물을 형성하는 세 가지 성장 단계를 특성화하는 방법을 제시합니다. ODELAY는 utili로 구성되어 있습니다.높은 처리량의 시간 경과 현미경으로 고체 세포에서 단일 세포가 식민지로 자라는 이미지를 기록합니다. 식민지로 자라는이 개별 세포 집단은 종말 종점 점수와 같은 덜 민감한 측정치에 의해 검출되지 않는 근본적인 개체 이질성을 나타낸다. 우리는 효모에 대한 방법을 시연하지만, ODELAY는 명 시야 현미경에서 대조를 보이는 모든 유기체에 적용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Agarose UltraPure</td><td>ThermoFisher</td><td>16500500</td><td>Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm</td></tr><tr><td>Yeast Extract Peptone (YEP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr><tr><td>Complete Suplement Mixture (CSM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MP114560222</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P2906</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Strain BY4741</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4741</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Strain BY4742</td><td>ThermoFisher</td><td>95400.BY4742</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon tubes</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>1 case</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tubes</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross</td><td>VWR</td><td>48382-179</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate flat bottom</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Hydra liquid handleing robot</td><td>Thermo</td><td>1096-DT-100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hydra 100 mL tips Extended Length DARTS</td><td>Thermo</td><td>5527</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Plate Reader</td><td>Biotek</td><td>H4MLFAD</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica 10X/0.3NA objective</td><td>Leica</td><td>11506289</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB with image processing tool box</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroManager</td><td>Open Imaging</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software</td></tr><tr><td>ODELAY Microscope Chamber</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings</td></tr><tr><td>ODELAY Agar Molds</td><td></td><td></td><td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings</td></tr></tbody></table>

odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth

미생물의 성장 phenotypes은 근본적인 유전 적 적합성의 강력한 지표이며, 3 가지 성장 체제 : 래그 - 위상, 로그 - 위상 및 정지 - 위상으로 분리 될 수있다. 각 성장 단계는 다양한 환경 적 및 유전 적 조건과 관련된 적합성의 다른 측면을 나타낼 수 있습니다. 3 가지 성장 단계의 고해상도 및 정량 측정은 일반적으로 어렵습니다. 여기에서는 효모의 살아있는 배열 (ODELAY)의 One-Cell Doubling Evaluation이라는 분석법을 사용하여 고체 배지에서 3 가지 성장 단계를 모두 특성화하는 상세한 방법을 제시합니다. ODELAY는 시간 경과 현미경을 사용하여 고체 배지에서 식민지로 자라는 개별 세포의 성장 표현형을 정량화합니다. 이 방법은 식민지로 자라는 유 전적으로 동일한 세포에서 각 성장 매개 변수로 개체 이질성을 직접 관찰 할 수 있습니다. 이 집단의 이질성은 유전 적 및 후 성적 규제를 이해하는 독특한 관점을 제공하며유전 및 환경 섭동. ODELAY 방법은 효모를 사용하여 시연되지만 밝은 영역 현미경으로 보이는 모든 콜로니 형성 미생물에 활용할 수 있습니다.

<html> 시간 경과 현미경으로 성장하는 효모의 예제 이미지는 그림 3B에 표시됩니다. 시간 경과 영상을 처리 한 후 효모 균주 BY4741 및 BY4742를 비교하는 대표적인 데이터 세트가 그림 4에 나와 있습니다. 이 예제 데이터 세트에서는 플레이트의 서로 다른 위치 사이에서 배가 시간이 거의 변하지 않았습니다. 아가로 오스 매체가 제대로 준비되지 않은 경우, 아가로 오스 겔의 변형 된 영역과 일치하는 스폿 위치에서 두 배가되는 시간과 지연 시간에 명백한 편차가있을 것입니다. 두 배의 시간은 상대적으로 균일 한 것처럼 보이지만,이 예는 지연 시간 측정의 변화를 보여줍니다. 보다 일관된 데이터 세트가 그림 6에 나와 있습니다. 이 데이터 세트에서 지연 시간과 배가 시간은 일정합니다. files / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1 : Agar Mold Assembly. 한천 몰드의 성분은 ( A )에 표시되어있다. ( B )와 같이베이스를 조립 한 다음 작은 바인더 클립으로베이스를 고정하십시오. 더 긴 수직 조각을베이스의 공동 ( C )에 놓은 다음 ( D )와 같이 슬라이드를 몰드에 넣습니다. 유리 슬라이드 ( E )에서 한천을 일관되게 분리하는 데 필요한 금형 절단 각도 및 금형 각도를 보여주는 측면도. 엄지 손가락과 집게 손가락의 위치와 한천의 직선을 슬라이드 ( F )에서 분리하고 수평 화살표를 확인하십시오. 분리 선은 수직 화살표 방향으로 균등하게 떨어져야합니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> = &quot;jove_content&quot;fo : keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="그림 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> 그림 2 : Sonication 및 스포팅 방법. 플레이트를 얼음물로 초음파 처리하고 원심 분리기 버킷 홀더를 사용하여 플레이트 ( A )를 받쳐줍니다. 아가로 오스 판 ( B )에 점을 찍기 위해 3.8.1 단계의 판을 놓으십시오. 또한 가장 왼쪽의 팁 상자에 C10 위치에 팁 하나가 있고 그 다음 4 개의 다른 끝이 잘려있어 플레이트 홀더 ( C )가 부러지지 않도록 팁을 정렬하십시오. 나머지 24 개의 팁을 4 개의 상자에 놓고 내부 24 개의 팁 위치가 채워지도록하십시오 ( D ). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; 그림 3 : ODELAY 그래픽 사용자 인터페이스. &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot;( A )에 대한 그래픽 사용자 인터페이스의 스크린 샷. 이 인터페이스는 카메라를 모니터링하고 epifluorescent 및 bright-field 모드의 현미경 조명 설정을 조정합니다. 빨간색 화살표는 Focus 및 Transmitted 버튼을 가리키고 카메라를 활성화하여 이미지를 빠르게 획득하고 전송 된 광 셔터를 각각 엽니 다. 파란색 화살표는 원점에 대한 스테이지 이동 및 &quot;원점 이동&quot;버튼과 &quot;설정&quot;버튼으로 원점을 설정하는 데 사용됩니다. 녹색 화살표가 &quot;재설정&quot;및 &quot;ODELAY !!!&quot;를 가리 킵니다. 버튼을 사용하여 ODELAY 이미지 모드를 현재 상태로 재설정하고 ODELAY 이미지 수집을 시작합니다. 얼룩이 진 후 0, 3, 6, 9 시간에 고체 배지에서 성장하는 효모의 저속 영상 ( B ). &quot;ODELAY_IPT.m&quot;또는 th에 대한 그래픽 사용자 인터페이스의 스크린 샷<html> e ODELAY 이미지 처리 도구 ( C ). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> 그림 4 : ODELAY 출력의 예. 이 데이터 세트는 YPD 미디어의 BY4741 및 BY4742 변형을 비교합니다. 이 그림은 잘 준비된 아가로 오스 슬라이드의 예입니다. 그러나 자동 초점 설정이 최적이 아닙니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 각 열에 표시되는 데이터는 다음과 같습니다. 식민지 영역의 Log 2 에 수용 할 수있는 용량. 분당 시간, 분 단위로 주어진다. 지체 시간 (min). 이 예제에서 한천 슬라이드의 모든 스팟의 배가 시간은 칼럼을 향한 두 배의 증가 된 시간으로 잘 정렬됩니다. 그러나 지연 시간은이 데이터 세트에서 상당히 다릅니다._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt;이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> 그림 5 : 성장 곡선의 예. 이 예는 불량한 초기 초점으로 인해 예상 지연 시간 (t 지연 )이 증가 할 수있는 ( A ) 반면 인접 위치는 지연 시간이 더 짧다는 것을 보여줍니다 ( B ). t d 는 분 단위의 배가 시간이고 t lag 는 분 단위의 지연 시간입니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="도 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> 그림 6 : 잘 실행 된 테스트 실험의 예 전자텅스텐 할로겐 전구를 다이오드 조명 장치로 교체하고 자동 초점이 올바르게 설정되었는지 확인한 후 BY4742 스트레인의 한 예. 모든 배증 시간은 잘 겹치고 지연 시간은 일정한 것처럼 보입니다. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

우리는 개별 효모 세포의 증식 표현형을 정량화하기위한 방법을 제시한다.이 효소 세포는 누룩의 살아있는 배열 (ODELAY)의 One-Cell Doubling 평가라고 불리는 시간 경과 현미경을 사용하여 고체 배지에서 식민지로 자라 난다. 식민지로 자라는 유 전적으로 동일한 세포의 인구 이질성을 직접 관찰하고 정량화 할 수 있습니다.

ODELAY : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 ​​대규모 방법

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

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비디오: ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in mRNA synthesis has been shown to be compensated by a simultaneous decrease in mRNA degradation to restore normal steady-state levels. Hence, the genome-wide quantification of mRNA synthesis, independently from mRNA decay, is the best direct reflection of RNA polymerase II transcriptional activity. Here, we discuss a method using non-perturbing metabolic labeling of nascent RNAs in Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). Specifically, the cells are cultured for 6 min with a uracil analog, 4-thiouracil, and the labeled newly transcribed RNAs are purified and quantified to determine the synthesis rates of all individual mRNA. Moreover, using labeled Schizosaccharomyces pombe cells as internal standard allows comparing mRNA synthesis in different S. cerevisiae strains. Using this protocol and fitting the data with a dynamic kinetic model, the corresponding mRNA decay rates can be determined.

Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity

The protocol described here is based on the genome-wide quantification of newly synthesized mRNA purified from yeast cells labeled with 4-thiouracil. This method allows to measure mRNA synthesis uncoupled from mRNA decay and, thus, provides an accurate measurement of RNA polymerase II transcription.

Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

Global defects in RNA polymerase II transcription might be overlooked by transcriptomic studies analyzing steady-state RNA. Indeed, the global decrease in ...

연구

유전학

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and chronological life spans are two established paradigms used to study aging in yeast. Replicative aging is defined as the number of daughter cells a single yeast mother cell produces before senescence; chronological aging is defined by the length of time cells can survive in a non-dividing, quiescence-like state 2. We have developed a high-throughput method for quantitative measurement of chronological life span. This method involves aging the cells in a defined medium under agitation and at constant temperature. At each age-point, a sub-population of cells is removed from the aging culture and inoculated into rich growth medium. A high-resolution growth curve is then obtained for this sub-population of aged cells using a Bioscreen C MBR machine. An algorithm is then applied to determine the relative proportion of viable cells in each sub-population based on the growth kinetics at each age-point. This method requires substantially less time and resources compared to other chronological lifespan assays while maintaining reproducibility and precision. The high-throughput nature of this assay should allow for large-scale genetic and chemical screens to identify novel longevity modifiers for further testing in more complex organisms.

Chronological aging in yeast refers to the loss of cell viability associated with time in stationary phase. Here we describe a high-throughput method for quantitatively determining yeast chronological life span.

지드 셀의 파생물로 효모 연대기의 수명 Quantifying

The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has proven to be an important model organism in the field of aging research 1. The replicative and ...

생물학

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae has been used extensively to study the biology of aging, and several determinants of yeast longevity have been shown to be conserved in multicellular eukaryotes, including worms, flies, and mice 1. Due to the lack of easily quantified age-associated phenotypes, aging in yeast has been assayed almost exclusively by measuring the life span of cells in different contexts, with two different life span paradigms in common usage 2. Chronological life span refers to the length of time that a mother cell can survive in a non-dividing, quiescence-like state, and is proposed to serve as a model for aging of post-mitotic cells in multicellular eukaryotes. Replicative life span, in contrast, refers the number of daughter cells produced by a mother cell prior to senescence, and is thought to provide a model of aging in mitotically active cells. Here we present a generalized protocol for measuring the replicative life span of budding yeast mother cells. The goal of the replicative life span assay is to determine how many times each mother cell buds. The mother and daughter cells can be easily differentiated by an experienced researcher using a standard light microscope (total magnification 160X), such as the Zeiss Axioscope 40 or another comparable model. Physical separation of daughter cells from mother cells is achieved using a manual micromanipulator equipped with a fiber-optic needle. Typical laboratory yeast strains produce 20-30 daughter cells per mother and one life span experiment requires 2-3 weeks.

In this article we present a general protocol for measuring the replicative life span of yeast mother cells.

버딩 효모에 Replicative 수명 측정

Aging is a degenerative process characterized by a progressive deterioration of cellular components and organelles resulting in mortality. The budding ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

양적 휘트니스 분석 워크플로우

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Analysis of Lipid Droplet Content in Fission and Budding Yeasts using Automated Image Processing

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are used as models in lipid metabolic research or for industrial lipid production. Lipid droplets are highly dynamic storage bodies and their cellular content represents a convenient readout of the lipid metabolic state. Fluorescence microscopy is a method of choice for quantitative analysis of cellular lipid droplets, as it relies on widely available equipment and allows analysis of individual lipid droplets. Furthermore, microscopic image analysis can be automated, greatly increasing overall analysis throughput. Here, we describe an experimental and analytical workflow for automated detection and quantitative description of individual lipid droplets in three different model yeast species: the fission yeasts Schizosaccharomyces pombe and Schizosaccharomyces japonicus, and the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Lipid droplets are visualized with BODIPY 493/503, and cell-impermeable fluorescent dextran is added to the culture media to help identify cell boundaries. Cells are subjected to 3D epifluorescence microscopy in green and blue channels and the resulting z-stack images are processed automatically by a MATLAB pipeline. The procedure outputs rich quantitative data on cellular lipid droplet content and individual lipid droplet characteristics in a tabular format suitable for downstream analyses in major spreadsheet or statistical packages. We provide example analyses of lipid droplet content under various conditions that affect cellular lipid metabolism.

Here, we present a MATLAB implementation of automated detection and quantitative description of lipid droplets in fluorescence microscopy images of fission and budding yeast cells.

자동 이미지 처리를 사용하여 핵분열 및 신진 효모의 지질 방울 함량 분석

Lipid metabolism and its regulation are of interest to both basic and applied life sciences and biotechnology. In this regard, various yeast species are ...

면역학 및 감염병학

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic requirements for eukaryotic protein degradation was initially established in Saccharomyces cerevisiae. Classical analyses of protein degradation have relied on biochemical pulse-chase and cycloheximide-chase methodologies. While these techniques provide sensitive means for observing protein degradation, they are laborious, time-consuming, and low-throughput. These approaches are not amenable to rapid or large-scale screening for mutations that prevent protein degradation. Here, a yeast growth-based assay for the facile identification of genetic requirements for protein degradation is described. In this assay, a reporter enzyme required for growth under specific selective conditions is fused to an unstable protein. Cells lacking the endogenous reporter enzyme but expressing the fusion protein can grow under selective conditions only when the fusion protein is stabilized (i.e. when protein degradation is compromised). In the growth assay described here, serial dilutions of wild-type and mutant yeast cells harboring a plasmid encoding a fusion protein are spotted onto selective and non-selective medium. Growth under selective conditions is consistent with degradation impairment by a given mutation. Increased protein abundance should be biochemically confirmed. A method for the rapid extraction of yeast proteins in a form suitable for electrophoresis and western blotting is also demonstrated. A growth-based readout for protein stability, combined with a simple protocol for protein extraction for biochemical analysis, facilitates rapid identification of genetic requirements for protein degradation. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of short-lived proteins. In the example presented, the His3 enzyme, which is required for histidine biosynthesis, was fused to Deg1-Sec62. Deg1-Sec62 is targeted for degradation after it aberrantly engages the endoplasmic reticulum translocon. Cells harboring Deg1-Sec62-His3 were able to grow under selective conditions when the protein was stabilized.

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

성장 기반의 결정 및 단백질 분해에 대한 유전 요구 사항의 생화학 적 확인에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

Precise, High-throughput Analysis of Bacterial Growth

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the systems level. Recent studies have reported correlations between bacterial growth and genome-wide events, such as genome reduction and transcriptome reorganization. Correctly analyzing bacterial growth is crucial for understanding the growth-dependent coordination of gene functions and cellular components. Accordingly, the precise quantitative evaluation of bacterial growth in a high-throughput manner is required. Emerging technological developments offer new experimental tools that allow updates of the methods used for studying bacterial growth. The protocol introduced here employs a microplate reader with a highly optimized experimental procedure for the reproducible and precise evaluation of bacterial growth. This protocol was used to evaluate the growth of several previously described Escherichia coli strains. The main steps of the protocol are as follows: the preparation of a large number of cell stocks in small vials for repeated tests with reproducible results, the use of 96-well plates for high-throughput growth evaluation, and the manual calculation of two major parameters (i.e., maximal growth rate and population density) representing the growth dynamics. In comparison to the traditional colony-forming unit (CFU) assay, which counts the cells that are cultured in glass tubes over time on agar plates, the present method is more efficient and provides more detailed temporal records of growth changes, but has a stricter detection limit at low population densities. In summary, the described method is advantageous for the precise and reproducible high-throughput analysis of bacterial growth, which can be used to draw conceptual conclusions or to make theoretical observations.

Quantitative evaluation of bacterial growth is essential to understanding microbial physiology as a systems-level phenomenon. A protocol for experimental manipulation and an analytical approach are introduced, allowing for precise, high-throughput analysis of bacterial growth, which is a key subject of interest in systems biology.

세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석

Bacterial growth is a central concept in the development of modern microbial physiology, as well as in the investigation of cellular dynamics at the ...

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The fermentable carbon concentration mainly governs how the yeast cells generate ATP; thus, the variation in fermentable carbohydrate levels drives the energetic metabolism of S. cerevisiae. This paper describes a high-throughput method based on exponential yeast growth to estimate the effects of concentration changes and nature of the carbon source on respiratory and fermentative metabolism. The growth of S. cerevisiae is measured in a microplate or shaken conical flask by determining the optical density (OD) at 600 nm. Then, a growth curve is built by plotting OD versus time, which allows identification and selection of the exponential phase, and is fitted with the exponential growth equation to obtain kinetic parameters. Low specific growth rates with higher doubling times generally represent a respiratory growth. Conversely, higher specific growth rates with lower doubling times indicate fermentative growth. Threshold values of doubling time and specific growth rate are estimated using well-known respiratory or fermentative conditions, such as non-fermentable carbon sources or higher concentrations of fermentable sugars. This is obtained for each specific strain. Finally, the calculated kinetic parameters are compared with the threshold values to establish whether the yeast shows fermentative and/or respiratory growth. The advantage of this method is its relative simplicity for understanding the effects of a substance/compound on fermentative or respiratory metabolism. It is important to highlight that growth is an intricate and complex biological process; therefore, preliminary data from this method must be corroborated by the quantification of oxygen consumption and accumulation of fermentation byproducts. Thereby, this technique can be used as a preliminary screening of compounds/substances that may disturb or enhance fermentative or respiratory metabolism.

Saccharomyces cerevisiae Exponential Growth Kinetics in Batch Culture to Analyze Respiratory and Fermentative Metabolism

Here we present a protocol to estimate the respiratory and fermentative metabolism by fitting the exponential growth of Saccharomyces cerevisiae to the exponential growth equation. Calculation of the kinetic parameters allows for the screening of influences of substances/compounds on fermentation or mitochondrial respiration.

Saccharomyces cerevisiae 호흡과 발효 대사 분석을 배치 문화 지 수 성장 속도 론

Saccharomyces cerevisiae cells in the exponential phase sustain their growth by producing ATP through fermentation and/or mitochondrial respiration. The ...

ODELAY : 효모 성장의 다 변수 정량화를위한 대규모 방법

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Saccharomyces cerevisiae 4-thiouracil와의 정량화로 대사 새로 합성 mRNA로 RNA 중 합 효소 II 활동에 대 한 프록시

지드 셀의 파생물로 효모 연대기의 수명 Quantifying

버딩 효모에 Replicative 수명 측정

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단일 효모 세포에서 MAPK 유도 표현의 시간적 정량화

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

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세균성 성장의 정확한, 높은 처리량 분석

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