이 절차의 전반적인 목표는 성인 마우스에 있는 뉴런의 장기 기록 및 재건을 위한 해마의 등쪽 중간 지역에서 건강한 급성 조각을 준비하는 것입니다. 우리 같은 많은 실험실, 특별 한 학습 및 탐색에 그것의 역할에 대 한 등산 해 마공부. 이러한 목적을 위해 사용되는 일반적인 기술은 행동 실험, 해부학 추적 및 지역 별 조작입니다.
우리는 비디오 녹화 내에서 생체 내 의 직접적인 상관 관계를 허용하는이 기술과 전기 생리학을 결합하는 뇌 슬라이스 방법을 개발했다. 이 프로토콜의 장점은 뇌 조직의 생존력을 향상시키기 위해 보호 용액을 사용하여 트랜스 버사 슬라이스를 얻는 간단한 절차를 결합한다는 것입니다. 이 접근법은 성숙한 동물이 행동 실험에서와 같이 사용될 때 특히 적합합니다.
이 절차를 시작하려면 이 섹션에 필요한 장비를 싱크 옆에 준비하십시오. 150 밀리리터 비커와 직경 10cm의 유리 페트리 요리 2개를 얼음 위에 준비합니다. 플라스틱 페트리 접시의 바닥까지 라인의 세 부분을 그리고 얼음 트레이에 가까운이 접시를 배치합니다.
당신은 또한 진동에 대한 접착제와 표본 홀더가 필요합니다. 그런 다음 수술 벤치에 큰 가위, 작은 가위, 둥근 팁 핀셋, 미세 팁 핀셋, 얇은 금속 주걱, 큰 금속 주걱 및 피펫을 장착합니다. 절단 용액으로 페트리 요리를 벗깁니다.
한 접시는 머리의 해부를 수행하고 다른 하나는 뇌의 해부를 위해. 후자에, 또한 필터 용지의 조각을 배치합니다. 또한 30 밀리리터 절단 용액으로 비커를 채웁니다.
이것은 경전 관류에 필요합니다. 진동 트레이에 얼음 냉기 절삭 액액을 채우고 모든 용액을 카보겐 버블링 장치로 산소처리하십시오. 냉동 절단 용액으로 만든 분쇄된 얼음을 차가운 신선한 컷인 솔루션에 추가하여 온도를 유지합니다.
슬라이스하는 동안 블레이드에서 얼음을 유지하기 위해주의를 기울이십시오. capitation 후 거의 모든 단계는 솔루션 내에서 수행됩니다. 이 최소한의 신진 대사 산소 부족을 유지 하는 데 도움이.
일정한 산소 화하에서 절단 용액으로 채워진 인큐베이션 챔버를 준비합니다. 챔버를 미리 데운 수조에 섭씨 35도에 놓습니다. 여러 개의 독립적인 우물로 슬라이스 저장 챔버를 준비하고 저장 솔루션으로 채웁니다.
실온에서 일정한 산소를 유지하십시오. 조직은 형광 단백질 또는 빛 활성화 된 opsonin을 표현하는 경우. 챔버를 어둠 속에서 유지하는 것이 좋습니다.
예를 들어 상자 내부입니다. 환원 관류를 수행한 후, 얼음 냉간 절단 용액으로 마우스 머리를 페트리 접시에 넣습니다. 두개골을 드러내기 위해 미세 한 가위로 피부를 엽니 다.
포라멘 매그넘에서 시작하여, 비강 봉합사에 도달할 때까지 처진 봉합사를 따라 잘라냅니다. 뇌의 손상을 피하기 위해 가위를 약간 당겨주의하십시오. 두개골 의 바닥에 두 개의 측면 절개를합니다.
둥근 팁 핀셋을 사용하여 정수리 뼈를 당깁니다. 또한 수막을 제거주의하십시오. 방치하면 추출 하는 동안 뇌를 손상시킬 수 있습니다.
작은 주걱을 사용하여 두개골 의 기지에서 뇌를 부드럽게 풀어주세요. 작은 주걱으로 두개골 신경에서 뇌를 분리하고 두 번째 페트리 접시에 있는 작은 필터 종이에 뇌를 옮겨. 미리 차가운 블레이드를 사용하여 세로 균열을 따라 반으로 뇌를 잘라.
가장 작은 주걱을 사용하여 두 반구를 분리합니다. 가장 큰 주걱을 사용하여 내측 표면이 아래로 향하고플라스틱 페트리 접시에 하나의 반구를 전송합니다. 두 번째 절단에 대한 참조를 갖도록 정수리 피질을 평행선 중 하나와 정렬합니다.
필터 용지 를 사용하여 과도한 용액을 건조시십시오. 블레이드를 선과 평행하게 배치하고 반구의 복부 부분을 잘라냅니다. 이 평평한 표면은 나중에 시편 홀더에 붙어 있을 것입니다.
유리 페트리 접시의 산소 면 용액으로 반구를 반환하고 두 번째 반구에서 동일한 절차를 수행합니다. 시아노아크릴레이트 접착제 한 방울을 진동표본 홀더에 놓고 주걱으로 퍼뜨려 얇은 층을 만듭니다. 주걱의 둥근 면을 사용하여 복부 면아래로 진동 홀더에 반구를 옮길 수 있습니다.
정수리 피질에서이 슬라이스를 시작하면 해마의 등쪽 영역을 수집하는 데 필요한 시간을 줄일 수 있습니다. 접착제를 고화시키기 위해 몇 방울의 냉간 절단 용액을 추가합니다. 시편 홀더를 진동 트레이로 옮기고 적절한 설정으로 뇌를 슬라이스하여 등삼 해마 영역이 보일 때까지 슬라이스합니다.
그런 다음 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 조각을 수집합니다. 각 슬라이스를 인큐베이션 챔버로 옮기고 12분 동안 쉬게 합니다. 그 동안, 다음 조각을 절단 진행합니다.
인큐베이션 12분 후, 슬라이스를 저장 챔버로 옮킨다. 그리고 실험이 시작될 때까지 휴식을 취하십시오. 우리의 준비의 순도를 보여주기 위하여는, 우리는 일반적으로 등등 해마에서 기록하는 데 사용되는 관상 준비와 비교합니다.
여기에 도시된 차동 간섭 대조 현미경은 2개월 된 마우스로부터 급성 슬라이스에서 축축자류의 상부 블레이드로부터 획득하였다. 트랜스버슬라이스에서 뉴런은 대부분 매끄러운 표면을 보였고 검은 화살로 표시된 테두리만 대조될 가능성이 있습니다. 그러나 코로날 슬라이스의 뉴런은 종종 코스가 나타나고 흰색 화살표로 표시된 강하게 대조된 윤곽을 표시했습니다.
이것은 트랜스 버사클 슬라이스에 있는 뉴런의 더 나은 생존을 건의합니다. 이 인상에 따라, 우리의 transversal 슬라이스에 패치 하는 동안 형성을 밀봉 하는 평균 시간은 관상 슬라이스에서 보다 훨씬 더 신속 했다. 세포 무결성에 대한 일반적인 프록시로서, 우리는 과립 세포와 파르브알부민 양성 인터 뉴런의 휴식 막 잠재력이 관상 동맥과 트랜스 베르사체 슬라이스의 두 세포 유형에서 훨씬 더 양극화되는 것을 기록합니다.
결국 관상 제제에서 배제되어야 하는 훨씬 더 많은 세포가 발생했습니다. 과립 세포 축축이 대위 평면에서 실행됨에 따라 기록 된 세포의 재구성으로 인해 준비 과정에서 완전한 축축절 수목을 회수했습니다. 이것은 축축이 쉽게 절단되었을 수 있는 관상 슬라이스의 경우는 아니었습니다.
또한, 대지 슬라이스에서 파르브알부민 양성 인터 뉴런의 형태학적 재구성은 수지상 척추와 같은 작은 세부 사항의 시각화를 포함하여 광범위한 축사 및 수지상 식소의 묘사를 허용했다. 무엇보다도, 우리는 성인 마우스를위한 높은 신경 생존력을 가진 성지 해마 조각을 얻기 위해 슬라이스 방법을 제시했습니다. 이 방법은 해마의 중간 등쪽 부분에 초점을 맞춘 해부학 및 행동 연구와 전기 생리학적 체외 조사를 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
