この手順の全体的な目標は、長期の記録と成人マウスのニューロンの再構築のために海馬の後頭の中間領域から健康な急性スライスを準備することです。私たちのような多くの研究室は、特別な学習とナビゲーションにおけるその役割のために後海馬を研究しています。この目的で使用される一般的な手法は、行動実験、解剖学的トレース、および地域固有の操作です。
我々は、ビデオ録画内のinvivodataの直接相関を可能にするために、この技術と電気生理学を組み合わせる脳スライス法を開発しました。このプロトコルの利点は、脳組織の生存率を高めるために保護溶液を使用して、トランスバーサルスライスを得るための簡単な手順を組み合わせることです。このアプローチは、成熟した動物が行動実験のように使用される場合に特に適しています。
この手順を開始するには、シンクの横にこのセクションに必要な機器を準備します。氷の上に150ミリリットルのビーカーとそれぞれ10センチメートルの直径の2つのガラスペトリ皿を準備します。プラスチックペトリ皿の底までラインの3つの部分を描き、この皿をアイストレイの近くに置きます。
また、ビブラートの接着剤と標本ホルダーが必要になります。その後、大きなはさみ、小さいはさみ、丸みを帯びた先端ピンセット、細かい先端ピンセット、薄い金属へら、大きな金属へら、および伝達ピペットを手術ベンチを装備する。ペトリ皿の皮を切り取る溶液で皮をむきます。
頭の解剖を行う一つの皿と脳の解剖のための他の。後者では、また、フィルターペーパーの一部を配置します。ビーカーに30ミリリットルの切断液を充填します。
これは、心筋灌流のために必要とされます.バイブビドームトレイに氷冷切断液を充填し、すべての溶液をカルボーゲンバブリング装置で酸素化してください。冷たい新鮮なカットイン溶液に切削液の凍結バッチから作られた砕いた氷を加えて、温度を下げ続けます。
スライスしながらブレードから氷を保つために、注意してください。資本化後のほぼすべてのステップは、ソリューション内で実行されます。これは、最小限に代謝酸素欠乏を維持するのに役立ちます.
一定の酸素化の下で切断液で満たされたインキュベーションチャンバーを準備する。チャンバーを摂氏35度の温める湯浴場に入れます。いくつかの独立した井戸とスライス貯蔵室を準備し、貯蔵溶液でそれを埋める。
室温で一定の酸素化の下でそれを保つ。組織が蛍光タンパク質または光活性化オプソンを発現する場合。暗い状態でチャンバーを保つことが推奨されます。
たとえば、ボックス内です。心筋透渡を行った後、氷冷切断液でペトリ皿にマウスの頭部を置きます。頭蓋骨を露出させるために細かいはさみで皮膚を開きます。
前部マグナムから始まり、座頭縫合糸に沿って切り、口蓋前頭縫合糸に達する。脳の損傷を避けるためにはさみを少し引き上げるには注意してください。頭蓋骨の基部に2つの横切開を行います。
丸みを帯びた先端ピンセットを使用して頭頂骨を引き上げる。また、髄を取り除くように注意してください。左の場合、彼らは抽出中に脳に損傷を与えることができます.
小さなへらを使用して、頭蓋骨の基部から脳を穏やかに緩めます。小さなへらで、脳を脳神経から切り離し、脳を2番目のペトリ皿の小さな濾過用紙に移します。冷やされたブレードを使用して、縦方向の裂け目に沿って脳を半分にカットします。
最小のヘラを使用して 2 つの半球を分離します。最大のスパチュラを使用して、内側の表面を下に向けてプラスチックペトリ皿に1つの半球を転送します。頭頂皮質を平行線の1つに合わせて、2番目のカットの基準を持つ。
過剰な溶液を乾燥させるために、フィルターペーパーを使用してください。ブレードを線に平行に配置し、半球の腹側部分を切断します。この平らな表面は後で標本のホールダーに接着される。
ガラスペトリ皿の酸素化綿溶液に半球を戻し、第二半球で同じ手順を実行します。ビブラートメの標本ホルダーにシアノアクリルの接着剤の滴を置き、薄い層を作成するためにへらでそれを広げます。ヘラの丸い側を使用して腹側を下にして、トランスビトームホルダーに半球を移します。
頭頂皮質からこのスライスを開始すると、海馬の後部領域を収集するために必要な時間が短縮されます。接着剤を固めるために冷たい切断溶液の数滴を追加します。標本ホルダーをビブラートメトレーに移動し、適切な設定で、裏海馬の領域が見えるまで脳をスライスします。
次に、プラスチック転写ピペットを使用してスライスを収集します。各スライスをインキュベーションチャンバーに移し、12分間休ませます。その間、次のスライスを切り取って進みます。
インキュベーションの12分後、スライスを貯蔵室に移します。そして、実験の開始まで休ませてください。私たちの準備の純度を実証するために、我々は一般的に後部海馬から記録するために使用されるコロナ製剤と比較します。
ここに示されている、2ヶ月齢マウスからの急性スライスにおけるデンテート回の上刃から得られた微分干渉対比顕微鏡写真である。横切りスライスでは、ニューロンは主に滑らかな表面を示し、黒い矢印で示される対照的な境界線のみを示した。しかしコロナスライスのニューロンは、しばしばコースを現し、白い矢印で示される強く対照的な輪郭を表示した。
これは、横のスライスにおけるニューロンのより良い生存率を示唆している。この印象に従って、私たちの横断スライスのパッチ形成中のシールの平均時間は、コロナスライスよりも有意に速かった。細胞完全性の一般的な代理として、我々は、顆粒細胞およびparvアルブミン陽性ニューロン間の静止膜電位が、コロナルとトランスバーサルの両方の細胞タイプにおいて有意に多くの脱分極であることを記録する。
これは、最終的にコロナ製剤で除外されなければならなかった有意に多くの細胞をもたらした。顆粒状細胞軸索が横面で動くにつれて、記録された細胞の再構築は、我々の調製における完全な軸索樹型の検索をもたらした。これは、軸索が容易に切断された可能性のあるコロナスライスには当てはまらなかった。
さらに、横膜スライスにおけるパルブアルブミン陽性間ニューロンの形態学的再構築により、樹状脊椎などの細部の可視化を含む広範な軸索および樹状の樹状樹状の樹状化の描写が可能となった。全体として、我々は、成体マウスの高い神経生存率を有する横の海馬スライスを得るためのスライス方法を提示した。この方法は、海馬の中間の後ろ側部分に焦点を当てた解剖学的および行動研究による電気生理学的インビトロ調査を測定するために使用することができる。
