우리는 데이비드 O'Brochta 박사와 곤충 유전 기술 조정 연구 네트워크의 모든 구성원들이 유전 기술의 구현에 대해 우리와 다른 사람들에게 제공하는 도움과 훈련을 주셔서 감사합니다. 우리는 특히 컬렉스 배아를 주입하고 부화할 수 있도록 미세 조작 프로토콜을 최적화한 찬나 알루비헤어에게 감사드립니다. 또한 Meuti 연구소에서 일하는 학부 생인 데반테 시몬스와 조셉 우르소(Joseph Urso)와 트랜스제닉 모기를 돌보고 선별하는 데 도움을 준 데반테 시몬스와 조셉 우르소, ITF의 조라 엘름카미(Zora Elmkami)가 모기를 사육하고 주사를 준비하는 데 도움을 준 것에 대해 감사드립니다. 이 작품은 MEM에 제공 OSU에 감염증 연구소에서 학제 간 씨앗 보조금에 의해 지원되었다.

<ol>
	<li>Hamer, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culex+pipiens+(Diptera:+Culicidae):+a+bridge+vector+of+West+Nile+virus+to+humans.">Culex pipiens (Diptera: Culicidae): a bridge vector of West Nile virus to humans.</a> Journal of Medical Entomology. 45 (1), 125-128 (2008).</li><li>Bailey, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+St.+Louis+encephalitis+virus+from+overwintering+Culex+pipiens+mosquitoes.">Isolation of St. Louis encephalitis virus from overwintering Culex pipiens mosquitoes.</a> Science. 199 (4335), 1346-1349 (1978).</li><li>Sabry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+realistic+index+of+experimental+transmission+efficiency+for+Bancroftian+filariasis.">A new realistic index of experimental transmission efficiency for Bancroftian filariasis.</a> The Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (4), 283-290 (1991).</li><li>Cancrini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aedes+albopictus+and+Culex+pipiens+implicated+as+natural+vectors+of+Dirofilaria+repens+in+central+Italy.">Aedes albopictus and Culex pipiens implicated as natural vectors of Dirofilaria repens in central Italy.</a> Journal of Medical Entomology. 44 (6), 1064-1066 (2007).</li><li>Wilton, D. P., Smith, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+diapause+in+three+geographic+strains+of+Culex+pipiens+(Diptera:+Culicidae).">Ovarian diapause in three geographic strains of Culex pipiens (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 22 (5), 524-528 (1985).</li><li>Mattingly, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Culex+pipiens+complex.">The Culex pipiens complex.</a> Transactions of the Royal Entomological Society of London. 102 (7), 331-342 (1951).</li><li>Eldridge, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+temperature+and+photoperiod+on+blood-feeding+and+ovarian+development+in+mosquitoes+of+the+Culex+pipiens+complex.">The effect of temperature and photoperiod on blood-feeding and ovarian development in mosquitoes of the Culex pipiens complex.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 17 (1), 133-140 (1968).</li><li>Spielman, A., Wong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+control+of+ovarian+diapause+in+Culex+pipiens.">Environmental control of ovarian diapause in Culex pipiens.</a> Annals of the Entomological Society of America. 66 (4), 905-907 (1973).</li><li>Fritz, M. L., Walker, E. D., Miller, J. R., Severson, D. W., Dworkin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Divergent+host+preferences+of+above-and+below-ground+Culex+pipiens+mosquitoes+and+their+hybrid+offspring.">Divergent host preferences of above-and below-ground Culex pipiens mosquitoes and their hybrid offspring.</a> Medical and Veterinary Entomology. 29 (2), 115-123 (2015).</li><li>Meola, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+temperature+and+humidity+on+embryonic+longevity+in+Aedes+aegypti.">The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti.</a> Annals of the Entomological Society of America. 57 (4), 468-472 (1964).</li><li>Dong, S., Lin, J., Held, N. L., Clem, R. J., Passarelli, A. L., Franz, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+in+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">Heritable CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> PloS one. 10 (3), (2015).</li><li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes.">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li><li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+an+efficient+genomic+editing+system+with+CRISPR/Cas9+in+the+vector+mosquito+Aedes+albopictus.">Construction of an efficient genomic editing system with CRISPR/Cas9 in the vector mosquito Aedes albopictus.</a> Insect Science. 26 (6), 1045-1054 (2019).</li><li>Itokawa, K., Komagata, O., Kasai, S., Ogawa, K., Tomita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+the+causality+between+CYP9M10+and+pyrethroid+resistance+using+the+TALEN+and+CRISPR/Cas9+technologies.">Testing the causality between CYP9M10 and pyrethroid resistance using the TALEN and CRISPR/Cas9 technologies.</a> Scientific Reports. 6, 24652 (2016).</li><li>Li, M., Li, T., Liu, N., Raban, R. R., Wang, X., Akbari, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+generation+of+heritable+germline+mutations+in+the+disease+vector+Culex+quinquefasciatus+using+clustered+regularly+interspaced+short+palindrome+repeats-associated+protein+9.">Methods for the generation of heritable germline mutations in the disease vector Culex quinquefasciatus using clustered regularly interspaced short palindrome repeats-associated protein 9.</a> Insect Molecular Biology. 29, 214-220 (2019).</li><li>Anderson, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+gene+editing+in+the+West+Nile+Virus+vector,+Culex+quinquefasciatus+Say.">CRISPR/Cas9 gene editing in the West Nile Virus vector, Culex quinquefasciatus Say.</a> PloS one. 14 (11), (2019).</li><li>Van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-based+adaptive+and+heritable+immunity+in+prokaryotes.">CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes.</a> Trends in Biochemical Sciences. 34 (8), 401-407 (2009).</li><li>Heyer, W. D., Ehmsen, K. T., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+homologous+recombination+in+eukaryotes.">Regulation of homologous recombination in eukaryotes.</a> Annual Review of Genetics. 44, 113-139 (2010).</li><li>Monnerat, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+albitarsis+embryogenesis:+morphological+identification+of+major+events.">Anopheles albitarsis embryogenesis: morphological identification of major events.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 97 (4), 589-596 (2002).</li><li>Davis, C. W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+study+of+larval+embryogenesis+in+the+mosquito+Culex+fatigans+Wiedemann+(Diptera:+Culicidae)+and+the+sheep-fly+Lucilia+sericata+Meigen+(Diptera:+Calliphoridae).">A comparative study of larval embryogenesis in the mosquito Culex fatigans Wiedemann (Diptera: Culicidae) and the sheep-fly Lucilia sericata Meigen (Diptera: Calliphoridae).</a> Australian Journal of Zoology. 15 (3), 547-579 (1967).</li><li>Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (29), 2967-2976 (2014).</li><li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+with+CRISPR-Cas9+in+the+mosquito+Aedes+aegypti.">Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti.</a> Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li><li>Gokcezade, J., Sienski, G., Duchek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+CRISPR/Cas9+plasmids+for+rapid+and+versatile+genome+editing+in+Drosophila.">Efficient CRISPR/Cas9 plasmids for rapid and versatile genome editing in Drosophila.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (11), 2279-2282 (2014).</li><li>Hwang, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+genome+editing+using+RNA-guided+nucleases.">Efficient in vivo genome editing using RNA-guided nucleases.</a> Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).</li><li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+end-joining+repair+for+efficient+site-specific+gene+insertion+after+TALEN/CRISPR+mutagenesis+in+Aedes+aegypti.">Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (13), 4038-4043 (2015).</li><li>Hammond, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CRISPR-Cas9+gene+drive+system+targeting+female+reproduction+in+the+malaria+mosquito+vector+Anopheles+gambiae.">A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 78-83 (2016).</li><li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> eLife. 3, 04766 (2014).</li></ol>

RH는 곤충 유전자 변형 서비스를 제공하는 곤충 변환 시설에서 작동합니다.

이 프로토콜은 Culex 모기의 게놈으로 특정 돌연변이를 소개하는 방법을 제시하고 또한 그밖 모기의 게놈을 편집하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 주입 물질을 준비하는 방법뿐만 아니라 모기가 계란을 낳도록 유도하는 방법과 그 계란을 준비하고 주입하는 방법에 대한 자세한 비디오 개요를 제공한다는 점에서 중요합니다. 우리는 또한 개별 뗏목에 계란을 낳고 따라서 원하는 돌연변이를 위해 각 여성에서 자손의 작은 비율을 가리기 위하여 여성 Cx. pipiens의 생물학을 이용하는 방법의 요약합니다. 여기에 제시된 방법은 Cx. pipiens에 최적화되었지만, 다른 모기 또는 곤충의 게놈을 편집하기 위하여, 작은 조정으로, 적응될 수 있습니다. 추가적으로, 여기에서 기술된 미세 조작 및 미세 주입 프로토콜은 탈렌스 또는 아연 핑거 뉴클레아제와 같은 트랜스포슨, dsRNA 또는 그밖 엔도니슬리스를 포함하여 곤충 배아에 몇몇 다른 물질을 주입하는 것이 가능합니다. 더욱이, 베벨링 프로토콜은 가변 개방 크기로 미세 주입 바늘을 생성하므로 다양한 주입 물질을 주입하는 데 사용할 수있는 바늘을 생성합니다. 바늘의 개방된 크기는 바늘이 베약된 후 공기의 압력을 서서히 감소시키고 새로 열린 바늘끝에서 공기의 거품이 흐르는 압력을 지적함으로써 추론될 수 있다. 기포를 생성하는 데 필요한 공기 압력이 적다는 것은 바늘이 개구부 크기가 더 크다는 것을 나타내며, 반대로 공기 압력이 높을수록 바늘이 개구부 크기가 더 작다는 것을 나타냅니다. 개구부 크기가 큰 바늘은 더 큰 입자와 더 점성 물질을 주입하는 것이 좋지만 배아에 더 큰 손상을 입히고 따라서 생존을 줄일 수 있습니다.
미세 주입 실험은 여러 면에서 시계에 대한 경쟁입니다. 첫째, 초리온이 경화되고 blastoderm 형성이 발생하기 전에, oviposition의 처음 2 시간 안에 개별 적인 태아를 주입해야 합니다. 따라서 모기가 oviposition 챔버에 처음 배치되었을 때, 주사를 위해 계란을 조작하는 데 걸리는 시간 (20-30 분 이상 권장), 모든 배아를 주입하는 데 걸리는 시간을 주의해야합니다. Cx. pipiens는 그들의 주변에 아주 과민하고 모기는 일반적으로 개별 유리 유리 유리 병에서 3-5 일 동안 만 살아남기 때문에 돌연변이를 위한 성인 모기를 검열할 때 시간도 제한됩니다. 따라서 가능한 한 빨리 모기 푸팔 엑설비아를 검사하는 것이 필수적입니다. 대안적으로, 하나는 또한 단일 모기다리14에서게놈 DNA를 추출할 수 있었다 14. 그러나 모기는 먼저 얼음에 마취되어야 합니다. 우리는 차가운 치료와 사지의 손실이 모기 생존과 실행 가능한 계란을 짝짓고 낳는 능력에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지에 지쳐 있었기 때문에, 우리는 대신 돌연변이에 대한 버려진 pupal exuvia를 선별하기로 결정했습니다. exuvia 내의 gDNA 수준은 모기 다리 안쪽에 있는 보다는 확률이 낮습니다, 이것은 pupal 단계에서 모기를 분리하는 추가 노력과 시간을 추가합니다, 그러나 또한 모든 성인이 그들의 적당한 새장에 풀어 놓일 때 짝을 지키지 않도록 합니다, 절대적으로 중요합니다. 우리는 결과가 가치가 있다고 생각하지만, 다리를 제거하는 것이 실험적 요구에 대한 더 나은 행동 과정이 될 수 있는지 다른 사람들에게 고려하도록 격려합니다.
돌연변이에 대한 검열을 신속히 하는 가장 좋은 방법은 절단 부위의 양쪽에 상동성 서열에 의해 측면형 단백질과 같은 유전 마커를 포함하는 플라스미드를 주입하는 것입니다. 상동성 지향 수리 (HDR)를 사용하여 노크 돌연변이의 비율은 일반적으로 비 동형 최종 결합 (NHEJ), 녹아웃 돌연변이 (HDR = 0.71 %보다 낮다; NHEJ=24.87%; 22).따라서 마커의 삽입은 훨씬 낮은 주파수로 발생할 가능성이 높지만, 형광 현미경으로 모기 유충을 신속하게 검사할 수 있게 함으로써 제공되는 시간 절감은 프로젝트에 따라 위험할 만한 가치가 있을 수 있다. 또한, HDR 및 노크인 돌연변이의 비율은 또한 잘 특징적인 배아 양성기구에 의해 구동되는 Cas9 단백질의 유전 서열을 포함하는 플라스미드를 주입할 때 향상되고, U6프로모터(24,26)에의해 구동되는 gRNA. 이것은 태아 발달초기에, 핵이 급속하게 분할될 때 (세포 주기의 S 단계), 오류 경향이 있지만 편법 NHEJ 기계장치가 이중 좌초 된 휴식을 복구하는 바람직한 방법인 것으로 보인다기 때문에 (검토18). 그러나, 배아발생이 진행됨에 따라 세포 기계는 이중 좌초 된 휴식 (늦은 S 단계 및 G2 상)을 복구하기 위해 보다 정확한 HDR 메커니즘을 사용하기 위해 준비된다. 배아 발달 초기에 Cas9 서열을 포함하는 플라스미드를 주입하면 Cas9 단백질이 대부분의 표적 세포에 도달할 수 있으며, 배아가 여전히 동기화 상태이고 세포막이 형성되기 전에 약간의 지연이 발생하지만 Cas9 단백질을 전사하고 번역하는 데 필요한 약간의 지연은 개발 중인 배아가 유전자를 정확하게 사용하여 유전자를 정확하게 복구할 가능성이 더 높은 시기에 활성화될 가능성을 높이는 것으로 보인다. 예를 들어, Lin et al.27은 gRNA로 복합된 Cas9 단백질이 세포 주기의 M 단계에서 체포된 인간 세포주에서 주입되었을 때 HDR의 비율이 ~33%로 향상되었다는 것을 발견했습니다. 플라스미드에 Cas9및 gRNAs를 전달하는 추가 이득은 주사 도중 바늘을 막을 확률이 적기 때문에 더 적은 점성이 있다는 것입니다 (R. Harrell, 개인적인 관측). 그러나, embyronic 프로모터가 Culex 모기에서 특징과 검증될 때까지, 여기에서 기술한 바와 같이 Cas9 단백질 또는 mRNA를 주입하는 것이 좋습니다.
또한 모기를 사육하고 선별하는 데 전념해야 하는 시간을 감안할 때 이 작업에 전념하는 전임 기술자, 학생 또는 연구원을 한 명 이상 두는 것이 좋습니다. 또한 주어진 실험에 필요한 null 돌연변이가 얼마나 많은지, 그리고 null 라인 내에서 유전적 다양성의 중요성을 전략적으로 고려하는 것이 좋습니다. 우리는 돌연변이가 있던 F1과 F2 세대에 있는 모기를 확인할 수 있었습니다, F2 모기의 소수만이 성인기에 살아남았고 이종수 돌연변이 모기는 실행 가능한 자손을 생성하지 못했습니다. 우리는 이것이 돌연변이와 관련이 훨씬 적다고 생각하고, 우리가 그(것)들을 검열하는 동안 남성과 여성 모기 둘 다 유리 관에 국한된 시간의 긴 기간의 결과일 확률이 높습니다. 고립의이 장기간 된 기간은 가장 가능성이 성공적으로 짝짓기 하는 그들의 능력을 방해 하 고, 여성의 경우, 혈액 식사를 얻고 실행 가능한 계란을 낳는. 단일 세대를 위해 교차하거나 최적화된 스크리닝 기술을 갖추면 향후 이 문제가 발생하지 않도록 해야 합니다. 따라서,이 프로토콜을 따라 우리는 연구원이 성공적으로 Culex 모기의 널 라인을 생성 할 수있을 것이라고 확신하고, 사소한 조정, 추가 곤충.

컬렉스 모기는 전 세계의 온대 및 열대 지역에 분포되어 있으며 웨스트 나일 바이러스1,세인트 루이스 뇌염2뿐만 아니라 개 심장벌레3 및 elephantiasis4를일으키는 필리알 선충을 포함한 여러 치명적인 바이러스를 전송합니다. Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens 및 Cx. pipiens 성추행을포함하는 Culex pipiens 복합체의 구성원은 생물학의 많은 양상에서 눈에 띄는 변화를 보여줍니다. 예를 들어, Cx. quinquefasciatus 및 Cx. pipiens 성추행은 겨울휴면5,6, Cx. pipiens 피피엔스는 짧은 일7,8에대한 응답으로 강력한 계절 반응을 표시하고 diapause를 입력 할 수 없습니다. 또한 Cx. pipiens 성추행은 더 인류애호가경향이 있는 반면 Cx. pipiens와 Cx. quinquefasciatus는 더 많은 동물 애호가6. 그러나 미국과 전 세계 많은 다른 장소에 걸쳐, Cx의 하이브리드로 질병 전염에 강한 영향을 미치는 이 종간 교배. pipiens pipiens 와 Cx. pipiens 성추행은 기회 피더이며 조류와 인간 을 모두 물린것입니다 9,따라서 웨스트 나일 바이러스에 대한 다리 벡터역할을. Culex 모기의 생물학의 이것과 그밖 매혹적인 양상을 공부하는 것은, 부분적으로, Culex 모기는 정지및 건조 저항하는 계란10을 생성하는 Aedes 모기 보다는 실험실에서 서있기 약간 더 어렵기 때문에 및 기능적인 분자 공구가 Culex 종을 위해 잘 개발되지 않기 때문에 방해되었습니다.
CRISPR/Cas9 게놈 편집은남부 집 모기, 컬렉스 퀸케파시아투스14,15,16을포함하여 몇 가지 중요한 모기 종11,12,13의생물학을 평가하는 데 사용되는 강력한 기술이다. 제니퍼 두나와 엠마뉴엘 샤펜티에가 개발한 이 기술은 세균 유래, CRISPR 관련 엔도니클로스(Cas 단백질; Van der Oost 외17)에의한 바이러스에 대한 자연적인 세균 방어를 이용합니다. 동물 배아에 주입할 때, Cas9 단백질은 적당한 가이드 RNA와 조합하여 게놈 내의 이중 좌초 된 휴식을 생성할 수 있습니다. 이것은 가장 빈번하게 게놈의 특정 지구에 엔도누엔리스 활성을 지시하는 가이드 RNA로 복합되는 Cas9 단백질을 사용하여 행해집니다. Cas9 단백질이 사이트별 이중 좌초 휴식을 만든 후, 세포 기계는 두 가지 메커니즘 중 하나를 사용하여 휴식을 복구하려고합니다. 첫 번째는 오류가 발생하기 쉽고 종종 비기능성 단백질을 초래할 수 있는 게놈의 아웃프레임 삽입 및 삭제를 생성하는 비동상종 결합(NHEJ)을 통해 두 끝을 결집시켜 녹아웃 돌연변이를 생성합니다. 또는 셀룰러 기계는 유사한 시퀀스를 찾아 파손을 올바르게 복구하여 동종 학 지향 수리(HDR)를 사용할 수 있습니다. 유사한 서열은 유기체 내의 제2 염색체에 의해 제공될 수 있다(리뷰18참조). 그러나, 수리된 서열이 원래 서열과 정확히 일치하면 Cas9 단백질은 DNA를 다시 절단할 수 있을 것이다. 대안적으로, 연구원은 또한 대체 수리 순서를 가진 표적 서열의 절단 사이트의 양쪽에 동종 서열을 포함하는 기증자 플라스미드를 포함할 수 있습니다 - 종종 형광 마커 단백질, 원래 유전자의 변형 된 버전, 또는 기타 수정 - 게놈에 복사 및 삽입 할 수 있습니다, 또는 "노크-인."
타이밍은 배아를 주입 할 때 중요하며, 특히 CRISPR / Cas9 게놈 편집을 사용하여 곤충의 돌연변이를 만들 때 특히 그렇습니다. 이는 Cas9 단백질과 gRNA가 배아가 동기화 상태에 있을 때만, 세포막이 형성되기 전에, 그리고 다중 핵이 배아 내에서 접근할 수 있을 때만 돌연변이를 생성하는 가장 큰 능력을 갖기 때문이다. 모기의 경우, 핵은 온도19에따라 oviposition 후 주변 ~ 2-4 시간 동안 도달하므로 성공적인 미세 주입이 이 시간 전에 발생해야합니다. 추가적으로, Cas9 단백질은 주입에서 유래된 개별이 세포의 모자이크를 포함할 것이라는 점을, 몇몇은 원하는 돌연변이를 가진, 그리고 그 외는 접근할 수 있는 어떤 핵 DNA든지 자를 것입니다. 이러한 돌연변이가 성공적으로 상속되기 위해서는 Cas9 단백질이 미래의 계란과 정자를 초래할 생식선에 있는 DNA를 잘라야합니다. 생식선에서 돌연변이가 생성되도록 하기 위해 곤충 생식선의 선조인 배아 내극 세포의 위치에 가까운 모든 물질을 주입하는 것이 가장 좋습니다. 극 세포는 Culex 배아20의후방 끝 근처에 위치한다. 배아를 주입하는 것 외에도 원하는 돌연변이를 감지하기 위해 자손을 횡단하고 선별하기 위한 신중한 계획을 개발하는 것이 필수적입니다.
이 프로토콜은 gRNA를 생성하고 주입 믹스를 준비하기 위해 Cas9 단백질로 복합하는 방법뿐만 아니라, 쿨렉스 피피엔스의 여성 모기가 계란을 낳는 방법과 CRISPR / Cas9 매개 게놈 편집을 위해 그 계란을 준비하고 주입하는 방법을 설명합니다. 추가적으로, 우리는 원하는 돌연변이가 얻어졌다는 것을 확인하기 위하여 주입된 태아 및 그들의 자손을 후면, 교차 및 스크린하는 방법을 기술합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 컬렉스 피피엔스의벅아이 균주에서 관심 있는 유전자, 사이클에대한 null 돌연변이를 생성했습니다. 이 균주는 원래 콜럼버스, 오하이오에서 필드 수집 모기에서 2013 년에 설립되었으며 Meuti 실험실에 의해 유지됩니다. 이 프로토콜은 쿨렉스 모기뿐만 아니라 다른 모기 종에서 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 요구하는 추가 연구에 사용될 수 있으며, 더 일반적으로 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 모든 곤충 종에 사용하는 것과 관련이 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Artificial Membrane Feeder</td><td>Hemotek</td><td>SP5W1-3</td><td>Company location: Blackburn, UK</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330019</td><td>Company location: Carlsbad, CA, USA</td></tr><tr><td>Borosilicate glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-6</td><td>Company Location: Sarasota, FL, USA</td></tr><tr><td>BV10 Needle Beveler</td><td>Sutter Instruments</td><td>BV-10-B</td><td>Company Location: Nobato, CA, USA</td></tr><tr><td>Whatman Circular filter paper (12.5 cm)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA1001125</td><td>Company Location: St. Louis, MO, USA</td></tr><tr><td>Conical tube (50 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td>Company Location: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Fisherbrand course filter paper with fast flow rate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-800</td><td>Company Location: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Cover glass (24 x 40 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-311-20</td><td>Company Location: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Dental dam</td><td>Henry Schein Inc</td><td>1010171</td><td>Company Location: Melville, NY USA</td></tr><tr><td>Scotch double-sided tape</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0879005</td><td>Company Location: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>FemtoJet 4i microinjector</td><td>Eppendorf</td><td>5252000021</td><td>Company Location: Hamburg, Germany</td></tr><tr><td>Glass vial (2 dram)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>033401C</td><td>Company Location: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Halocarbon oil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8898-50ML</td><td>Company Location: St. Louis, MO, USA</td></tr><tr><td>P-2000 Laser Needle Puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000/G</td><td>Company Location: Nobato, CA, USA</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-998-944</td><td>Company Location: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>PC-100 Weighted Needle Puller</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td>This is compatabile with the earlier PC-10 model, which has been discontinued. Company Location: Amityville, NY, USA</td></tr><tr><td>Phire Direct PCR Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F140WH</td><td>Company Location: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Kodak Photo-Flo (1%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-268-05</td><td>Company Location: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Quartz glass mirocapillary tubes, 1 mm outer diameter</td><td>Capillary Tube Supplies Limited</td><td>QGCT 1.0</td><td>Company Location: Cornwall, UK</td></tr><tr><td>Guide-it&amp;trade; sgRNA Screening Kit</td><td>Takara, Bio USA</td><td>632639</td><td>This kit allows you to determine if gRNAs cut DNA sequences in vitro. Company Location: Mountain View, CA, USA</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SL2-100ML</td><td>Company Location: St. Louis, MO, USA</td></tr><tr><td>Small petri dishes (35X10 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-190-0273</td><td>Company Location: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Sodium citrate chicken blood</td><td>Lampire biologicals</td><td>7201406</td><td>Company Location: Everett, PA, USA</td></tr><tr><td>Fisherbrand Square petri dish (10 cm x 10 cm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td>Company Location: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Tegaderm</td><td>Henry Schein Inc.</td><td>7771180</td><td>Company Location: Melville, NY USA</td></tr><tr><td>Tropical fish food</td><td>Tetramin</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filter paper</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-927-826</td><td>Company Location: Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>Whatman filter paper, 4.25 cm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1001-042</td><td>Company Location: St. Louis, MO, USA</td></tr></tbody></table>

preparing and injecting embryos of culex mosquitoes to generate null mutations using crispr/cas9

컬렉스 모기는 웨스트 나일 바이러스와 개 심장벌레와 코끼리와 같은 filarial 선충에 기인한 질병을 포함하여 인간과 동물의 건강에 부정적인 영향을 미치는 몇몇 질병의 중요한 벡터입니다. 최근에는 제네라 아노필스와 에데스에속하는 모기를 포함하여 여러 곤충 종의 갓 배치된 배아에 가이드 RNA(gRNA)로 복합된 Cas9 단백질을 주입하여 현장 지향 돌연변이를 유도하는 데 사용되어 왔다. 컬렉스 모기를 조작하고 주입하는 것은 이 모기가 다른 모기 종처럼 뗏목에서 알을 똑바로 세우기 때문에 약간 더 어렵습니다. 여기에서 우리는 gRNA를 디자인하는 방법, Cas9 단백질로 그(것)들을 복잡하게 하고, Culex pipiens의 여성 모기를 계란을 낳기 위하여 유도하고, Cas9/gRNA를 가진 미세 주입을 위한 새로 놓인 태아를 준비하고 주입하는 방법을 기술합니다. 우리는 또한 원하는 돌연변이를 위해 주입된 모기를 후방및 스크린하는 방법을 설명합니다. 대표적인 결과는 이 기술이 Culex 모기의 게놈에 있는 사이트 지시돌연변이를 유도하기 위하여 이용될 수 있고, 약간의 수정으로, 그밖 모기 종에 있는 널 돌연변이를 생성하는 것을 이용될 수 있다는 것을 보여줍니다.

설명된 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 Cx. pipiens의배아를 주입할 수 있었고, 주입된 태아 중 생존율이 높은 것을 관찰하였다(~55%, 도 1). 이전 시험은 달걀 여포의 전방이 의학 드레싱 스트립에 부착되었기 때문에 생존의 비율이 낮았으며, 모기 유충이 초리온에서 탈출하고 성공적으로 물로 수영하는 것을 막았습니다. 전방 끝이 의료 드레싱의 스트립을 넘어 크게 증가 애벌레 생존을 보장하고, 성인기및 재생(그림 2B)에개발 할 수있는 고품질자에서 초래한다.
후속 실험 및 스크리닝은 circadian 클럭 유전자주기(cyc;)에대한 null 돌연변이를 나타낸다. KM355981)은 주입된 배아의 세균선으로만들었다(도 3). 우리의 프라이머가 절단 부위 근처의 낭성 유전자의 큰 영역을 증폭시켰다는 점을 감안할 때, 이종화구, F1 모기에서 두 개의 분리된 밴드를 관찰하기가 어려웠습니다. 이는 절단 부위 주변에 ~100-200 bp인 조각을 증폭시키는 프라이머를 설계하는 유틸리티와 의심되는 모든 돌연변이 모기를 시퀀싱하는 것의 중요성을 보여줍니다. 시퀀싱은 선별된 모기의 약 10%가 우리가 설계한 첫 번째 가이드 RNA의 Cas9 절단 부위 근처에서 작은 삽입 또는 삭제를 보였다는 것을 밝혔습니다(그림3),이것은 매우 효과적인 gRNA이고 미세 주입 도중 극 세포를 성공적으로 표적으로 했다는 것을 시사합니다. F1 개인 성공적으로 교제 하 고 실행 가능한 자손을 생산 (F2 세대), 일부는 또한 돌연변이를 포함.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61651/61651fig1.jpg"> 그림 1: 베벨보리케이트 바늘의 예. 이 바늘은 실리콘 보로실리케이트 마이크로카세필레 튜브에서 제조되었고, PC-10 수직 바늘 풀러를 사용하여 끌어당긴 다음 BV-10 Beveller에 베브레드를 사용했습니다. 바늘은 ~ 63배 배율 하에서 볼 수 있습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61651/61651fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61651/61651fig2.jpg"> 그림 2: F0 세대의 생존은 그들의 발전을 통해. (A)주입된 배아를 포함하는 3개의 슬라이드에서 부화한1st 인스타 애벌레의 이미지. (B)각 생활 단계에서 개인의 수의 그래픽 표현. 주입된 801개의 배아 중 44111마리의 성애가 부화되었고, 이들 149명 중 149명이 새끼를 낳았고, 그 결과 총 121명의 성인(남성 73명, 암컷 43명)이 새끼를 낳았다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61651/61651fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61651/61651fig3.jpg"> 그림 3: 원하는 돌연변이의 전염을 보여주는 대표적인 결과. 상위 2개의 서열은 컬렉스 퀸케파스카이투스에서 사이클 유전자의 서열을 나타낸다(Cx.quinq; XP_001865023.1) 및 Cx. pipiens (WT의 야생 유형 여성) F; KM355981). 아래 시퀀스는 세 남성 F1 자손의 시퀀스를 나타냅니다 (I.DM1; II.JM4; II.K10M). 녹색 상자는 Cas9 단백질 (CGG)에 의해 인식된 PAM 서열을 나타내고 녹색 화살표는 Cas9 단백질이 게놈 DNA를 갈라진 위치를 나타냅니다. 이러한 결과는 2 또는 4 뉴클레오티드의 짧은 삭제가 F1 남성에서 상속되었다는 것을 보여줍니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61651/61651fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9는 비모델 유기체에서 유전자 기능을 특성화하는 데 점점 더 사용됩니다. 이 프로토콜은 주입 믹스 준비에서 모기 배아를 획득하고 주입하는 것뿐만 아니라 주입 된 모기와 원하는 돌연변이에 대한 자손을 후면, 교차 및 선별하는 방법에 이르기까지 Culex pipiens의녹아웃 라인을 생성하는 방법을 설명합니다.

CRISPR/Cas9를 사용하여 Null 돌연변이를 생성하기 위해 컬렉스 모기의 배아를 준비하고 주입합니다.

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

preparing-injecting-embryos-culex-mosquitoes-to-generate-null

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

6.8K 조회수.  The Ohio State University. CRISPR/Cas9는 비모델 유기체에서 유전자 기능을 특성화하는 데 점점 더 사용됩니다. 이 프로토콜은 주입 믹스 준비에서 모기 배아를 획득하고 주입하는 것뿐만 아니라 주입 된 모기와 원하는 돌연변이에 대한 자손을 후면, 교차 및 선별하는 방법에 이르기까지 Culex pipiens의녹아웃 라인을 생성하는 방법을 설명합니다.

비디오: Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

연구

유전학

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been co-opted as a powerful tool for precise eukaryotic genome engineering. Here, we present a rapid and simple method using chimeric single guide RNAs (sgRNA) and CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for the efficient and precise generation of genomic point mutations in C. elegans. We describe a pipeline for sgRNA target selection, homology-directed repair (HDR) template design, CRISPR-Cas9-RNP complexing and delivery, and a genotyping strategy that enables the robust and rapid identification of correctly edited animals. Our approach not only permits the facile generation and identification of desired genomic point mutant animals, but also facilitates the detection of other complex indel alleles in approximately 4 - 5 days with high efficiency and a reduced screening workload.

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Here, we present a method to engineer the genome of C. elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and homology dependent repair templates.

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

샌드 플라이 (플레보토무스 파파타시) CRISPR/Cas9 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control strategies. CRISPR-based homing gene drive systems have made transgenic technologies more accessible within the scientific community. Evaluation of transgenic mosquito performance and comparisons with wild-type counterparts in small laboratory cage trials provide valuable data for the design of subsequent field cage experiments and experimental assessments to refine the strategies for disease prevention. Here, we present three different protocols used in laboratory settings to evaluate transgene spread in anopheline mosquito vectors of malaria. These include inundative releases (no gene-drive system), and gene-drive overlapping and non-overlapping generation trials. The three trials vary in a number of parameters and can be adapted to desired experimental settings. Moreover, insectary studies in small cages are part of the progressive transition of engineered insects from the laboratory to open field releases. Therefore, the protocols described here represent invaluable tools to provide empirical values that will ultimately aid field implementation of new technologies for malaria elimination.

The protocols reported here illustrate three alternative ways to assess the performance of genetically-engineered mosquitoes destined for vector control in laboratory-contained small cage trials. Each protocol is tailored to the specific modification the mosquito strain bears (gene drive or non-gene drive) and the types of parameters measured.

유전자 조작 된 아노펠리인 모기의 작은 케이지 실험실 시험

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control ...

Digital-Droplet PCR to Detect Indels Mutations in Genetically Modified Anopheline Mosquito Populations

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA sequence variation on a large scale. Specifically, detecting insertions and deletions (indels) at gene-edited sites generated by CRISPR guide RNA (gRNA)/Cas9-mediated non-homologous end-joining (NHEJ) is important for assessing the fidelity of the mutagenesis and the frequency of unintended changes. We describe here a protocol for digital-droplet PCR (ddPCR) that is well-suited for high-throughput NHEJ analysis. While this method does not produce data that identifies individual sequence variation, it provides a quantitative estimate of the sequence variation within a population. Additionally, with appropriate resources, this protocol can be implemented in a field-site laboratory setting more easily than next-generation or Sanger sequencing. ddPCR also has a faster turn-around time for results than either of those methods, which allows a more quick and complete analysis of genetic variation in wild populations during field trials of genetically-engineered organisms.

This protocol provides the steps from DNA extraction to experimental set-up for digital droplet PCR (ddPCR), including analysis for the identification and quantification of non-homologous end-joining (NHEJ) events at target sites following gRNA-induced Cas9 cleavage and DNA repair. Other uses of this method include applications such as polymorphism detection and gene-editing variant verification.

유전자 변형 된 Anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 PCR

Recent advances in mosquito genomics and genetic engineering technologies have fostered a need for quick and efficient methods for detecting targeted DNA ...

Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti

Mosquito gene editing has become routine in several laboratories with the establishment of systems such as transcription-activator-like effector nucleases (TALENs), zinc-finger nucleases (ZFNs), and homing endonucleases (HEs). More recently, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) technology has offered an easier and cheaper alternative for precision genome engineering. Following nuclease action, DNA repair pathways will fix the broken DNA ends, often introducing indels. These out-of-frame mutations are then used for understanding gene function in the target organisms. A drawback, however, is that mutant individuals carry no dominant marker, making identification and tracking of mutant alleles challenging, especially at scales needed for many experiments. 
High-resolution melt analysis (HRMA) is a simple method to identify variations in nucleic acid sequences and utilizes PCR melting curves to detect such variations. This post-PCR analysis method uses fluorescent double-stranded DNA-binding dyes with instrumentation that has temperature ramp control data capture capability and is easily scaled to 96-well plate formats. Described here is a simple workflow using HRMA for the rapid detection of CRISPR/Cas9-induced indels and the establishment of mutant lines in the mosquito Ae. aegypti. Critically, all steps can be performed with a small amount of leg tissue and do not require sacrificing the organism, allowing genetic crosses or phenotyping assays to be performed after genotyping.

Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti

This article details a protocol for rapid identification of indels induced by CRISPR/Cas9 and selection of mutant lines in the mosquito Aedes aegypti using high-resolution melt analysis.

모기 Aedes aegypti에서 고해상도 용융 분석을 사용하여 CRISPR/ Cas9 돌연변이 발생 에 따른 인델 검출

Mosquito gene editing has become routine in several laboratories with the establishment of systems such as transcription-activator-like effector nucleases ...

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

CRISPR-Cas9을 이용한 황열병 모기 이집트숲모기(Mosquito Aedes aegypti )의 게놈 편집

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

CRISPR/Cas9 기술을 이용한 철새 메뚜기의 동형접합 돌연변이 구축

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...