견인력 현미경 검사는 세포 생성 힘을 측정하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 경험이 부족한 사용자가 더 쉽게 액세스할 수 있도록 견인력 데이터의 수집 분석을 단순화합니다. 기존 레퍼런스 리스필 포스 현미경 플랫폼에 비해 이 기술의 주요 장점은 다광 석판 소그래피가 개별 실험 요구에 따라 빠르고 쉬운 패터닝 설정을 재설계할 수 있다는 것입니다.
텍스트만으로는 시각적 표현을 통해 이해하기 쉬운 이 새로운 참조 없는 견인 플랫폼의 제작 및 구현에 많은 주요 단계가 있습니다. 염기 하이드로겔의 광중합화를 위해 먼저 퍼플루오로알록시 알칸의 얇고 평평한 시트에 프리 폴리머 용액의 3마이크로리터를 추가하고, 평평한 150 마이크로미터 두께의 PDMS 스트립을 둘러싸고 있지만 접촉하지 않고 사전 폴리머 용액의 낙하한다. PDMS에 아크릴 사일란화 커버슬립을 배치하고, 표지 슬립 아래에 중앙에 미리 폴리머 방울을 배치하여 PDMS 스페이서의 두께로 전폴리머 액적액을 평평하게 한다.
끼워진 프리 폴리머 용액을 약 1분 동안 UV 광에 노출시다. 하이드로겔이 완전히 형성되면 PDMS 스페이서에서 커버슬립을 조심스럽게 분리하십시오. 고성능 양면 아크릴 접착제를 사용하여 커버슬립에 오픈 바텀 페트리 접시를 부착합니다.
하이드로겔이 함유된 커버슬립을 페트리 접시에 고수할 때 는 특별한 주의를 기울이십시오. 젖은 접시 또는 응용 프로그램 동안 너무 적은 압력은 샘플을 파괴, 형성 누출을 허용합니다. 접착 접착 접착 표면에 압력을 가하여 커버슬립, 접착제 및 페트리 접시 사이에 완전한 씰을 만들어 유리를 깨지 않도록 주의하십시오.
멸균 여과 된 PBS를 사용하여 하이드로겔을 헹구는다. 그런 다음 하이드로겔 합성을 위해 준비된 실험실 용액의 800 마이크로리터에 NVP8 마이크로리터를 추가합니다. 이진 이미지를 디지털 마스크로 변환하려면 MATLAB을 열고 실행 스크립트를 열고 실행합니다.
m MATLAB 스크립트. 변환을 위해 바이너리 TIF 파일을 선택하고 폴더를 선택하여 지역의 파일을 저장합니다. 선택한 이미지의 미크론에 원하는 최종 크기를 입력합니다.
입력 이미지는 이러한 매개 변수와 일치하도록 배율이 조정되고 차원이 조정됩니다. 관심 있는 생성기 옵션 영역에서 단일 픽셀 배열을 만들려면 작은 영역/단일 픽셀 에서 틱 제거 상자를 선택 해제하려면 사각형 틱 박스를 확인하고 수평 중단 선 에서 사용을 선택 취소합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다. OVL 파일은 이전에 지정된 폴더에서 찾을 수 있습니다.
현미경 소프트웨어에서 파일을 열고 두 개의 광자 레이저 스캐닝 리소그래피 동안 레이저 셔터를 제어하는 원하는 영역을 로드합니다. 다음 단계는 최소한의 조명으로 조건에서 수행해야 합니다. 저조도 조건에서 fiducial 마커 어레이의 제조를 위해 이전에 준비된 NVP 실험실 용액의 200 마이크로리터를 알렉사 플루어 6332와 철저히 혼합하고 하이드로겔을 함유한 접시에서 모든 PBS를 제거합니다.
기저 하이드로겔을 완전히 포괄하는 액적으로 HYDROgel에 PEG-633 혼합물을 추가하고 페트리 접시를 현미경 스테이지의 샘플 홀더에 적재합니다. 그런 다음 접시를 덮고 패턴 화액이 빛으로부터 보호되는 최소 30 분 동안 하이드로겔에 담가 두도록 합니다. 이미징용 현미경을 구성하려면 Alexa Fluor 488을 시각화하기 위한 적절한 레이저 및 필터를 선택합니다.
PEG-488 신호를 사용하여 하이드로겔을 찾아 검출기에서 더 긴 방출 파장의 수집을 차단한다. 수직 및 수평 타일 스캔을 사용하여 XY 평면의 하이드로겔 의 중심을 찾고 이 위치에서 스테이지를 0으로 설정합니다. Z 스택 함수의 선 스캔을 사용하여 하이드로겔의 표면을 찾고 이 위치에서 초점을 0으로 설정합니다.
XY 센터에서 멀리 스캔하는 라인을 반복하여 하이드로겔을 레벨화하여 표면 위치를 식별하고 필요에 따라 현미경 단계에 대한 세트 나사를 조정합니다. 현미경 소프트웨어 작업 공간 내에서 광패팅을 위한 별도의 실험 파일을 만들고 다중 광자 전력을 1.8%로 설정하고 스캔 속도를 6으로 설정합니다. 이미지 프레임과 픽셀의 크기를 조정하여 픽셀당 픽셀 크기0.1 마이크로미터, 가로세로 비율이 100대 1로 조정되고 영역 파일을 지역 탭에 로드합니다.
매크로를 사용하여 모든 영역을 설정하여 Z 스택 함수를 획득하고 켭니다. 총 깊이 28마이크로미터및 총 9개의 Z 슬라이스 수에 대해 간격을 3.5 마이크로미터로 설정합니다. 그런 다음 위치 함수를 사용하여 수압 마커 어레이가 포토패턴이 되는 하이드로겔의 특정 위치를 설정합니다.
흡수 시간이 30분 마크에 도달하면 5분마다 하이드로겔 표면의 연속 Z-스택 라인 스캔을 획득하여 제로 포커스 위치에 비해 표면의 위치 변화에 따라 부종을 확인합니다. 5분 간격동안 표면 위치의 변화가 발생하지 않은 경우, 패터닝 설정을 실행하고 488 나노미터 레이저를 사용하여 수로겔의 표면이 패터닝 중에 움직이지 않았는지 확인한다. 그런 다음 현미경에서 하이드로겔을 제거하고 페트리 접시에서 PEG-633 용액을 흡인하고 멸균 여과 된 PBS로 접시를 헹구는다.
셀 및 수탁 마커 이미지를 획득하려면 Petri 접시를 샘플 홀더로 돌려 보내 패턴 영역을 찾습니다. 관심 있는 세포를 찾아 세포의 전달 되거나 형광성 영상을 습득한다. 그런 다음 입증된 바와 같이 세포 아래에 패턴 배열의 Z 스택을 획득하고, 세포의 전송 또는 형광 이미지의 두 번째 세트를 획득한다.
이미지 스택을 수집할 때 결과 이미지는 이미지 스택 내에서 Z 위치의 함수로서 강도가 진동하는 패턴 피처의 정기적인 배열을 표시해야 합니다. 추적. m 스크립트는 전처리 품질을 평가하기 위해 형광 선량 마커의 Z 프로젝션, 검출된 센트로이드의 플롯, 물체 감지 품질을 평가하기 위한 Z 위치의 함수로 코딩된 색상, Z 방향으로 열에 연결된 검출된 마커 중심을 나타내는 트랙의 플롯 을 포함하여 여러 가지 진단 이미지를 제공합니다.
DISP 3D.m 스크립트는 지정된 이미지 스택에서 감지된 각 피처의 각 열에 대한 Z 위치의 함수로서 강도 플롯을 제공하여 선량마커 강도 프로파일의 품질을 평가합니다. 두 DISP 3D.
m 및 DISP 전단. m함께 각 카르테시안 좌표 치수에서 측정된 변위 소음의 히스토그램과 변위의 보간 된 열지도를 제공합니다. 또한 인터프 final3D_2.
m은 아웃소싱 코드를 사용하여 계산된 표면 견인력의 열지도를 제공합니다. 이 절차 에서 기억해야 할 가장 중요한 점은 LAP가 포함된 솔루션이 빛에 민감하며 주변 광원으로부터 가능한 한 많이 보호되어야 한다는 것입니다. NVP는 휘발성 유기 화합물이며 항상 화학 적 흐름 후드에서 처리되어야한다는 것을 기억하십시오.
