This work was supported by the Committee Technology and Innovation (CTI) Switzerland grant 14796-PFLS-LSCTI. MicroPost arrays were generously provided by MicroDuits GmbH.

Micropost 배열 1. 배양 세포 참고 : 모든 단계는 불임을 보장하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. 여기에 지정된 볼륨은 T25 세포 배양 플라스크에 대한 것입니다. 세포 배양 배지 및 세포 레시피 파종 밀도 골암 세포주 HuO9 및 M132에 최적화되어있다. <ol><li> micropost 배열에 파종을위한 세포 배양을 준비합니다. <ol><li> 표준 광학 현미경에 배양 플라스크를 배치하여 세포 배양 품질을 검사한다. 세포가 덮여 얼마나 많은 문화 플라스크 바닥의 추정에 의한 전형적인 성장과 형태를 보여 있는지 확인합니다. 70 % -80 %의 범위는 건강한 성장 속도를 반영한​​다. 그들은 죽은 세포 및 / 또는 자란 문화를 대표로 세포를 부동의 양에주의를 기울이십시오. </li><li> 4 ㎖의 1X 인산염과 중간 및 세척을 제거하여 세포를 Trypsinize은 식염수 (PBS) 버퍼를 버퍼. 셀 때까지 실온에서 0.8 ㎖의 1X 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 첨가하고, 배양약 2-4 분 소요 S를시키다. 현미경으로 프로세스를 확인하고 가끔 빠지을 지원하기 위해 조심스럽게 플라스크를 누릅니다. </li><li> 5 ml의 세포 배양 배지 (둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM), 10 % 소 태아 혈청 (FBS와 / F12), 1 % 페니실린 / 스트렙 (PEN / 패 혈성)) 반응을 정지하고 가만히 잔여 세포를 씻어을 추가 플라스크의 바닥에. 그 후 균일 한 혼합물을 얻기 위해 상하 수회 현탁액을 피펫. 효과적인 빠지을 얻기 위해 플라스크의 원래의 성장 영역에서 모든 솔루션을 피펫해야합니다. </li><li> 15 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 3 분 동안 0.5 XG에서 테이블 상단 원심 분리기를 사용하여 원심 분리. </li><li> 상층 액을 제거하고 최대 피펫 팅에 의해 5 배 아래로 5 ml의 배지에서 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 그렇게하는 동안 거품의 발생을 방지해야합니다. </li><li> 셀 카운팅 챔버와 microsco 광을 사용하여 세포 농도를 결정PE. 세포 집합체에 대한 세포 계수 챔버에서 세포 현탁액을 확인하고 다음 실험을 위해 단지 하나의 세포를 가지고 확인합니다. 피펫은 세포를 분리 집계를 형성하기 위해 다시 여러 번 아래로 경향합니다. </li><li> 25,000 세포 / ml의 세포 용액을 얻기 위해 충분한 배지로 세포 현탁액을 희석. 밀폐 튜브를 수회 반전시킴으로써 잘 섞는다. </li></ol></li><li> 세포 파종을위한 micropost 배열을 준비합니다. 중요 참고 :이 잠재적 microposts를 손상시킬 수있는 직접적으로 불필요한 거품이 소개되어 특히, micropost 배열에 피펫하지 마십시오. 또한, micropost 배열이 결코 모세관 힘이 microposts의 붕괴로 이어질 발생하는 것으로 밖으로 건조하지 있는지 확인하십시오. <ol><li> 핀셋을 사용하여 12- 웰 플레이트의 웰에 직면하고 1 ㎖의 에탄올 (99 %)을 첨가하여 습윤 micropost 어레이 부착 유리 기판을 배치했다. 20 ~ 30 초 동안 실온에서 품어. </li><li> 에탄올을 희석잘 측에 약 1 ㎖의 멸균 탈 이온수 (DI 물)을 첨가하고 전사 피펫 또는 흡인 장치를 사용하여 약 1ml의 흡입에 의해 단계적. 이 단계에서 적어도 3 번 반복합니다. </li><li> 추가하고 약 1 ml의 흡입에 의해 같은 방식으로 PBS 버퍼와 DI-물을 교체합니다. 이 단계를 3 번​​ 반복합니다. </li><li> 추가하고 약 매체의 1 ml의 흡입에 의해 매체와 PBS 버퍼를 교체합니다. 이 단계를 3 번​​ 반복합니다. </li></ol></li><li> 각 준비 micropost 배열의 상단에 피펫 1 ml의 세포 용액 (25,000 세포). 멀티 웰 플레이트 닫고 인큐베이터로 전송 (CO 2 5 %, 37 ° C). 세포 부착 및 6 -7 시간 동안 microposts 위에 성장 보자. </li><li> 가벼운 현미경을 사용하여 때때로 접착 공정을 검사합니다. 세포의 대부분은 여러 microposts에 걸쳐 퍼져 나타납니다 있는지 확인합니다. </li></ol> 2. 고정 및 염색 세포 참고 : 모든 단계를하고여기에 주어진 볼륨은 12 웰 플레이트의 단일 잘위한 것입니다. 그것은 microposts의 붕괴가 발생합니다 액체의 흡인 후 우물에서 건조를 방지하기 위해 한 번에하지 더 열두 우물의 네 이상을 처리하는 것이 좋습니다. <ol><li> 우물에서 대기음 매체와 세척 세포를 1 ml의 PBS 버퍼로 2 배. 배양 동안 micropost 배열에 축적 된 세포 파편을 제거하고 죽은 세포를 분리 PBS로 세척하는 동안 부드러운 힘을 적용해야합니다. </li><li> 5 분 동안 0.5 ml의 3.7 % 완충 포르말린 용액으로 세포를 고정한다. </li><li> 1 ml의 멸균 탈 이온수와 micropost 배열 배를 세척하여 포름 알데히드 용액을 교체합니다. </li><li> 약 90 초 동안 (50 % 물, 40 % 에탄올 및 10 % 아세트산 0.05 % 쿠마시 브릴리언트 블루)와 색소 세포를 염색. 1 ml의 멸균 탈 이온수로 2 배 오프 초과 염색 액을 씻으십시오. 배열을 micropost 1 ml의 탈 이온수를 추가합니다. </li><li> 광학 현미경을 사용하여 염색 결과를 확인한다. 반복 T세포체가 가시화 되기에는 너무 희미 경우 그 단계를 염색. </li><li> 4 ° C에서 냉장고에 상단에 염색 된 세포에 저장 micropost 배열. 항상 물 속에서 그들을 유지하기 위해 확인합니다. </li></ol> 3. 세포 이미징 참고 : 4 단계는 무한 보정 광학없이 현미경에 적용됩니다. <ol><li> 고해상도 이미징을위한 얇은 유리 바닥 페트리 접시에 2 ml의 디 - 물을 추가합니다. </li><li> microposts면이 위를 향하도록하여 영상 접시에 핀셋을 사용하여 micropost 배열을 전송합니다. </li><li> 광학 현미경의 이동 무대에 영상 페트리 접시를 놓습니다. </li><li> 스케일 수가 유리 기판, 실리콘 엘라스토머와 위에 액체의 굴절률 부정합을 보상하기 위해, 광 경로를 따른 모든 재료의 전체 두께를 나타낸다까지 촬상에 사용 렌즈의 보정 링을 돌려. 이 microposts의 밝은 모습으로 이어질한다코어. </li><li> 다운 50 %, 조명 측에 조리개를 닫고 일반 명 시야 모드 활성화 광로에서 어떠한 위상차 링을 제거한다. </li><li> microposts가 관찰 들판을 가로 질러 수평 라인을 형성 micropost 배열을 맞 춥니 다. 시작점 (예를 들어, 왼쪽 상단)을 정의하고 다수의 이미지를 복용하는 동안 micropost 배열을 스캔 스테이지에서 페트리 접시 단계적으로 이동합니다. </li><li> 20 배 또는 40 배 목표를 사용하여 카메라의 최고 해상도 설정으로 모든 이미지를 가져 가라. 이미지의 중심에서 단일 세포를 목표로. </li><li> micropost 팁에 초점이 될 때까지 기판을 통해 Z 축을 따라 스윕. 현미경의 미세 조정 초점 휠을 사용하여 약 2 ~ 3 μm의에 대한 micropost 바닥에 초점을 향해 돌립니다. </li><li> (한 번에 하나의 촬상 파라미터 휩쓸고 하나의 어레이 부분의 테스트 이미지의 시리즈를 취함으로써 표준 촬상 확립 수순 예, 노출 시간,조리개 설정, 램프 설정 등). MechProfiler 이미지를 분석하고 빠르고 신뢰성있는 분석을위한 적절한 매개 변수 세트를 결​​정합니다. </li></ol> 오픈 소스 소프트웨어 &quot;MechProfiler&quot;4. ​​이미지 분석 주 : 모든 소프트웨어 기능은 마우스 왼쪽 버튼을 이용하여 포인팅 디바이스로 활성화 될 수있다. 그러나, 숙련 된 작업자가 양손 효율적인 이미지 처리를 가능하게하는 키보드의 좌측 절반으로 설계 문서화 단축 키를 사용한다. <ol><li> 이미지 분석 소프트웨어 MechProfiler를 시작하고 &quot;열기&quot;를 클릭하여 분석 할 필요가 이미지의 범위를 엽니 다. </li><li> 소프트웨어 개발자에 의해 주어진 &quot;설정&quot;섹션에 모든 매개 변수를 삽입합니다. 맞춤형 소프트웨어 매뉴얼 상세히 기재된 절차에 따라서 (즉, 형상 및 최소 임계 거리)를 구성해야 파라미터를 결정. </li><li> 이미지 분석의 - 한 - &quot;자르기&quot;를 사용하여 관심 영역에 자르기로 (클릭하고 마우스 버튼으로 드래그 누름). 그려진 사각형 안에 두 번 클릭하여이 작업을 완료합니다. </li><li> &quot;세포 윤곽을 그리기&quot;및 셀에 연결된 모든 microposts을 포함하여 도면에 대한 십자 커서를 사용을 클릭하여 각각의 눈에 보이는 세포 개요 하나씩을 표시. </li><li> &quot;취소 게시물&quot;을 클릭하여 원치 않는 microposts을 취소하고 그리기 십자 커서를 사용합니다. 이미지 섹션 외부의 셀에 속하거나 그 어떤 다른 이유가 아니라 관심의 세포에 의해 편향되는 모든 microposts을 묶습니다. </li><li> 소프트웨어 서브 루틴 마우스 클릭하여 &quot;무게 중심 찾기&quot;를 시작합니다. 바로 옆에 자신의 중앙에 붉은 십자가가 눈에 보이는 모든 microposts가 등록 될 때까지 &quot;무게 중심 찾기&quot;버튼에 필터 설정을 조정합니다. 필터 설정이 너무 경우가 너무 높은 경우, MU 낮은 microposts은 무시 될 것이다ltiple 위치는 하나의 micropost에 대해 표시됩니다. 분석 세션 동안 일정하게 설정 필터를 유지합니다. </li><li> 여러되거나 누락 micropost 위치와 무게 중심의 매뉴얼 편집 기능 &quot;수동 편집&quot;를 사용합니다. 클릭을 가로 질러 드래그하여 문제의 micropost을 선택하려면 마우스 크로스 헤어를 사용합니다. 사각형 내부를 두 번 클릭하고 자동으로 닫힙니다 확대 된 이미지 섹션에서 누락 된 빨간색 마커를 배치합니다. 이 그린 셀 개요를 벗어나면 이러한 micropost 폐기 진행하기 전에 (단계 4.5 참조). </li><li> 마우스 클릭으로 &quot;그리드 생성&quot;기능을 활성화하여 이상적인 micropost 그리드를 찾아보십시오. 위치 그린 셀 내부 윤곽선 블루 링으로 도시 진정한 micropost 헤드, 대응 확인. </li><li> 마우스 클릭으로 해당 &quot;마누엘 편집&quot;기능을 사용하여 필요한 셀 영역 내부에 잘못 그리드 메이커를 수정합니다. 한때의 micropost을 선택 십자선을 사용하여클릭을 가로 질러 드래그하여 estion. 나타나는 사각형 내부를 두 번 클릭하고 자동으로 닫힙니다 확대 된 이미지 섹션에서 누락 된 파란색 마커를 배치합니다. </li><li> micropost의 화상 부 내측 위치 및 생성 된 이상적 그리드 간의 차이에 기초하여 계산 된 편차 값들의 히스토그램을 얻기 위해 마우스 버튼을 클릭하여 &quot;계산 처짐&quot;를 사용. </li><li> &quot;저장&quot;에 마우스를 클릭하여 값의 테이블을 포함한 완전한 분석을 저장합니다. </li><li> &quot;보기 재설정&quot;편리 오른쪽 키보드 커서 키를 사용하여 수행 할 수 있습니다 &quot;다음 이미지&quot;에 다른 이미지 섹션 또는 마우스 클릭을 분석 클릭하거나 이미지 분석을 계속합니다. </li></ol> 5. 데이터 분석 - Mechanoprofiling <ol><li> 분석 된 이미지가있는 폴더에서 오피스 스프레드 시트 프로그램을 사용하여 파일 &quot;results.xls&quot;를 엽니 다. 그것은 알루미늄과 데이터를 포함분석 된 셀의 모든 micropost의 처짐 및 작업 (즉, 기판의 변형 에너지)와 같은 표준 파생 조치를 포함하여 L 계산 된 값. </li></ol>

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The lead author (NG) is co-founder of MicroDuits GmbH, the commercial supplier of the micropost arrays used in this study. No other authors have any potential conflicts of interest with this work.

이 작품은 실질적으로 진입 기술 및 실제적인 장벽을 낮춤으로써 견인 힘 현미경 분야의 발전을 추구한다. 이 장벽은 양측에서 온다. 가장 먼저 재현성 제조 및 실험적 micropost 배열을 의뢰하기 위해 극복해야 할 많은 비 사소한 기술적 문제가 있습니다. 전형적인 실험이 수백 또는 세포의 수천의 분석이 필요할 수 있습니다 염두에두고 - 둘째, 마찬가지로 적지 않은 단일 셀 힘의 신뢰할 수있는 반자동 분석이 필요하다. 전술 한 기술은 주민 엔지니어링 전문 지식이없는 세포 생물학 실험실 내에서 micropost 기반 견인 힘 현미경에 액세스 할 수 있도록하기 위해 개발되었습니다. 이 문서에 제시된 센서 및 분석 기술은 비전문가가 쉽게 정확하게 하나의 세포에 의해 가해지는 힘을 분석 할 수 있어야합니다. 그렇다 세포 생물학 (L)에 액세스로부터적어도 중급 밝은 필드 현미경 AB는 설명 방법은 몇 가지 추가 기술적 인 요소가 필요합니다. 여기에 대부분의 사용자는 기술의 힘과 다양성에도 불구하고, 심지어 제한된 경험을 가진 유효한 견인 힘 현미경 실험을 수행 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 고려되어야 제시된 프로토콜의 세 가지 중요한 측면이있다. 첫째는 micropost 배열은 항상 붕괴 그 모세관 힘에 방지하기 위해 액체로 덮여 있는지 확인하는 것이 필요하다. 두 번째는 최선의 노출 시간, 아이리스의 조리개와 보정 링의 위치를​​ 변화시키면서 동일한 배열 위치의 일련의 이미지를 취함으로써 수행된다 micropost 취득한 화상에 대한 촬상 파라미터를 최적화 할 필요가있다. 그것은 micropost 팁에 대한 정확한 초점 평면을 찾는 것이 중요하며,이 형태는 센서 어레이의 작은 차원 깊이 주어진 경험을한다. 공개적으로 접근 가능한 이미지 분석 소프트웨어 MechProfiler의 discusse을 다운로드해야합니다 세 번째여기 거라고하는 상세한 사용자 매뉴얼 및 교육 예는 다운로드 사이트에서 구할 수 있습니다. 적합한 현미경 설정을 구성 할 수 있도록 수동으로 제공되는 예를 분석하는 소프트웨어를 사용 경험 한 후, 사용자는 촬상 설정에 시험 화상이 사용될 취해야한다. 얻어진 화상에 기초하여, 형상의 임계 값은 마찬가지로 최적화되어야한다. 단일 micropost 화상은 몇 시간 내에 (셀 수백 분석) 통계적으로 중요한 결과의 발생을 허용 관계없이 하나 이상의 셀을 포함하는지 여부의 오픈 소스 MechProfiler 소프트웨어를 사용하여 분 이내에 훈련 사용자에 의해 분석 될 수있다 . 일부 조정이 필요 다른 태양은 어떤 응용 세포 염색 과정의 최적화이다. 세포가 과도하게 묻은 경우 소프트웨어는 올바른 micropost의 위치 등록이 실패 할 수 있습니다. 염색이 너무 약한 경우, 다른 한편으로는 검출 할 수있는 사용자에 의해 더 많은 노력이 필요얇은 세포 돌기로 &quot;true&quot;로 세포의 윤곽이 누락 될 수 있습니다. 그러나, 세포 염색 및 배열 이미징 절차의 고정 프로토콜을 적용하여이 오류의 범위는 허용 가능한 낮은된다. 이 작업 동안 다른 세포 염색 절차 크리스탈 바이올렛, 트윈 20 또는 트리톤 X 또는 에오신를 추가하여 염료의 조합과 같은 계면 활성제의 존재하에 다양한 농도에 기초하여, 시험 하였다. 그럼에도 불구하고, 실험에서 실질적으로 변화 염색의 강도뿐만 아니라 안정성을 실험한다. 전술 한 바와 같이 브릴리언트 블루 G만을 사용은 여전히​​ 박형 전지 윤곽을 볼 수 있지만, 충분한 강도로 현상 된 형상 접근을 방해하지 않고 결합 허용 가능한 세포 얼룩 내성을 보여 주었다. 일반적으로 제시된 기술을 수정하는 옵션이 있습니다. 형광 현미경 염색 소기관으로 여기에 제시된 시야 기술을 조합함으로써, 예를 들어세포 역학의 맥락에서 기본 세포 프로세스에 대한 추가 정보를 제공 할 수있는 핵 또는 액틴 필라멘트 네트워크, 등을들 수있다. 또한, 사용한 장쇄 알킬 carboxycyanines (DII 또는 DIO) microposts 형광해진다. 14 그럼에도 불구하고,이 기술에서 각각의 표시 편차를 제어하는 것이 중요하다. 보충도 10 및 그림 11은 잠재적 인 함정을 설명한다. 거꾸로 현미경을 사용하여 녹색 형광 채널 (그림 10B와 10C)에서 쿠마 블루 G 염색 NIH 3T3 섬유 아세포의 세포 찍은 이미지는 잘못된 위치 분석 (그림 10E)로 이어지는 주요 micropost 기관이 아닌 자신의 팁을 제시한다. 셀 얼룩에 의한 형광 신호의 흡수로 인해 수 밝은 필드 모드 micropost 팁 몇 군데되지 않을 수 있습니다 (그림 10A)로 전환 한 후 다시 집중하기 위해 최선의 노력에도 불구하고. 이것은 IMA 대조적이다직립 현미경 (도 11B-11F)의 황색 형광 채널로 촬영 GES가 상기 복수 선명한 이미지는 Z 축을 따라 얻을 수있다. 여기에서 사용자는 이미지가 불량 편향 값을 호출 피할 micropost 바닥에 가까운 어딘가에 매우 팁 (도 11C)에 초점면으로 취하고되지 않도록 할 필요가있다. 그것은 micropost 분석 기술의 한계가 있다는 것을 또한 주목해야한다. 예를 들어, 검출 된 편차의 정확도는 광학 설치의 품질에 의존한다. 현미경은 종종 연결된 카메라의 감광도가 다수의 화소보다 더 높은 우선 순위를 갖는 형광 이미징을 위해 최적화된다. 당연히, 이것은 더 큰 픽셀 크기의 이미지로 이끈다. 또한,이 세포 돌기 기판 하단에 도달하면 명 시야 이미지를 결정할 수 있음을 유의해야한다. 그러나, 상업적 micropost 어레이는 촛점을 사용하여 테스트 하였다현미경 사용. 그것은 세포가 micropost 배열의 나머지 micropost 팁에만 접착을 촉진 아닌 바이너리 코팅을 받아 들일 것으로 보인다 것으로 나타났습니다. 또 다른 요인은 0.2 μm의 것으로 밝혀졌다 micropost 어레이의 위치 오차로부터 도출한다. 함께 2.8 윈 / μm의 주어진 스프링 상수이 0.6 윈의 힘 판독의 오류로 이어집니다. micropost 분석에 대한 또 다른 제약은 여러 셀에 의해 공유 microposts에서 적용 힘이 결정되지 않을 수 있다는 사실에서 유래. 따라서, 오직 고립 된 단일 세포를 분석 할 수있다. 제시된 프로토콜에 대한 특별한 제한은 신뢰할 수있는 결과를 얻기 위해 사용자에 대한 교육 일정량을 필요 민감한 형상 접근의 올바른 애플리케이션으로부터 유도한다. micropost 어레이는 수평 또는 관찰 영역의 가장자리를 따라 수직 라인을 형성하도록 정렬되는 것을 또한, 빠른 분석을 위해 사용자는 이미지를 취한다. DespitE 육각형 그리드 지오메트리 내의 microposts를 찾기위한 소프트웨어 알고리즘이보다 5 ° 오프 축 회전 각도에 의해 microposts의 촬상을 한정되지 않는다는 불완전한 microposts 후 리드를 함유하지 않고 어려운 화상 부분을 잘라낼 수 있도록 사실 &quot;그리드 생성&quot;기능의 실패에. 이러한 경우에 사용자는 micropost 위치를 분석하기 시작하기 전에 통합 회전 기능을 사용할 수있다. 설명 된 방법은 주로 두 골암 세포주 HuO9라는 부모 세포주, 및 M132 표시된 유래 높은 전이 라인의 특성을 적용 하였다. 이 문맥 백에 여섯 단세포 이미지 시야 모드에서 촬영하고 MechProfiler 소프트웨어를 사용하여 분석 하였다. 후속 데이터 마이닝은 부모 세포주 HuO9가 약간 더 힘을 발휘하고 일반적으로 전이성 세포주 M132에서 세포보다 세포 당 microposts을 커버 것으로 나타났다. 그러나 세포예상 결과 광범위한 기여 정착의 순간에서 세포주기의 다른 단계에 따라서 동기화되지 않았다. 24 시간까지의 기간에 걸쳐 라이브 셀 이미지를 취함으로써, 그것은 다른 사람이, 확산 차단을 마이그레이션하고 다른 속도 (보충 동영상 참조) 다시 마이그레이션 반면 확산 후 많은 세포가 초기 위치에 유지 한 것으로 나타났습니다. 이것은 셀의 기계적 프로필 종종 일정하지 및 세포 집단에 걸쳐 또는 현재 활동에 따라 단일 셀 내에서 크게 달라질 수 있음을 나타낸다. 또 다른 요인은 셀이 셀은 평탄면에 부착하고 미세한 단계로 이주 할 수 고전 TFM, 대조적 인 다른 micropost 도달 이산 마이그레이션 단계를 수행하도록 강요된다 micropost 배열에 해당 될 수있다. 그러나, 이러한 작은 단계를 분석하기 위해 매우 진보 m에 대한 액세스를 요구하는 초점 포인트의 밀착성 형광 이미지를 고려할 필요가있다icroscopes 매우 정교한 이미지 분석 소프트웨어. 그럼에도 불구하고, 큰 개체군 내의 기계적 프로필 분포는 여전히 종종 세포주의 특성을 정의한다. 따라서 다수의 셀의 특성을 가능하게 높은 처리량 방법이 필수적이다. 여기에 제시된 수동 이미징 프로세스 및 오픈 액세스 소프트웨어는 완전 자동 현미경 시스템에 확장을위한 큰 잠재력을 품고. 요약하면 강력한 견인 힘 현미경의 접근 방식은 표준 세포 생물학 실험실에서 쉽게 채용입니다 표시됩니다. 이미지 분석에 세포 파종에서 전체 워크 플로우는 간단하고 효과적이다. 여기에 설명 된 프로토콜이 완전히 기능하지만, 개선도 생균 촬상으로부터 이미지 시퀀스의 해석을 단순화 직교 레이아웃 및 개발 절차 micropost 어레이를 처리 할 수​​ 있도록 분석 알고리즘을 적응 진행 중이다. 뼈 암세포 리튬에 대한 결과와 문맥NES, 여기에 설명 된 방법은 이러한 분석법 골 암 환자로부터 생검 세포의 전이 잠재 성을 예측하기 위해 임상있게 예후 값을 보유 할 수 있는지 여부를 설정하기 위해 임상에서 생검 화면 셀에 사용될 수있다. 이러한 분석은 치료 전략에 영향을 미칠 것이다. 다른 잠재적 인 애플리케이션은 잠재적으로 약물의 효능 또는 독성을 수립을 지원하기 위해, 평활근 세포 또는 심근 세포와 같은 세포에 기계적 활성 시험 약학 적 활성 화합물에 관한 것이다.

- 기계에 민감한 세포 기반 분석은 역학 세포 생물학에서 재생할 수있는 중심적인 역할을 반영하는 다양한 애플리케이션으로, 부착 세포를 조사 할 수 있습니다. 이 애플리케이션은 세포 내 프로세스 또는 전체 셀 동작을 구동하는 기본 메커니즘에 초점을 맞추고있다. 한편, 예컨대 세포 외 매트릭스 조성물 또는 매트릭스 강성 같은 외부 환경 요인 극적 셀의 기계적 및 생물학적 반응에 영향을 미칠 수있다. (1) 같은 약학 적 활성 화합물의 많은 클래스의 사용 후에 관측 될 수 있고, 효과가있는 아르 종종 세포 배양 모델을 이용하여 특징으로한다. (2) 등의 골격 구조 및 기능의 변화와 관련된 세포 표현형으로 표시 변경을 유도 할 수 자발 또는 실험적으로 유도 된 유전자 돌연변이에 의한 것과 같은 다른 한편 유전자형 특성에서. (3)이 예는 많은 수의 몇 가지주제에있는 세포의 기계적 표현형 관련이며,이 모든 유용하게 micropost 배열로 조사되었다. 이 글을 쓰는 시점에서, 약 200 기사 세포 micropost 상호 작용을 설명하는 발표되었다. 이 작품은 micropost 편향 원칙의 이론적 인 측면뿐만 아니라 제조에 실제적인 지침을 설명합니다. 세포와 유연한 micropost 배열의 상호 작용을 설명하는 첫 번째 기사는 연속 부드러운 기판을 탄 등 nanonewton 규모의 세포 수축력을 추정하는 데 사용되는 고전적인 견인 힘 현미경 (TFM)과는 대조적으로 2003 년 4 탄 및 동료에 의해 ​​출판되었다. 실리콘 엘라스토머로 이루어지는 다수의 근접하게 이격 된 수직 빔을 사용하는 방법을 설명했다. 이 기술의 주요 장점은 두 가지 주요 기능에서 등장. 유지하면서 제 휴대 명백 기판의 강성을 변경하기 위해 하나의 유일한 micropost 치수를 변경해야달리 일정하므로, 표면 토폴로지 및 화학의 차이를 피하는 기판 조성물. 둘째 microposts는 이산 개별 초점 유착 정도의 힘과 공간 해상도로 분석 할 수 있습니다 및 표준 TFM에 의해 유사한 분석에 고유 한 분석 문제를 줄일 수있는 개별 스프링과 같은 역할을합니다. 오늘 micropost 배열에 대한 응용 프로그램의 범위는 크게 몇 하나의 셀에 대한 힘의 단지 매핑을 초과합니다. 예를 들어, 아키야마는 곤충 근육 탑재 자율 마이크로 로봇을 개발하기 위해서는, micropost 어레이 액츄에이터 방 애벌레로부터 격리 등쪽 혈관 조직의 사용을보고한다. (5) 그러나 microposts 대부분의 게시 된 응용 프로그램은 감염이나 암과 같은 질환의 연구에 초점을 맞추고있다. 예를 들어, micropost 어레이는 나이 세리아 gonorrh 번들의 타입 IV의 필리의 구동력 발생을 연구하기 위해 사용되어왔다. 신호 캐스케이드 감염 향상과 연관된 6 기타 세포 골격 타겟팅 약학 화합물로 처리 유방암 세포를 연구 microposts를 사용한 콜로니 OEA. 7 micropost 편향 종종 셀을 가정 단부 하중 고전 캔틸레버 빔 이론을 이용하여 설명하는 매우 micropost의 선단에 부착. 편향 δ 원인이 여기에 적용되는 힘 (F)은 micropost의 &quot;휨 강성&quot;K에 의존에 의해 계산된다 : <img alt="식 (1)" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq1.jpg" /> (1) E, I, L 및 인 영률 각각 관성 빔 길이의 면적 모멘트. 기판 휨이 교류로 촬영되지 않습니다 그러나,이 방정식의 결과는 빔 전단 이후 작업뿐만 아니라 굴곡의 힘의 근사치를 제공카운트. microposts 전형적 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)와 같은 부드러운 재료로 제조되는 것을 고려할 때 이러한 요소가 포함될 필요가 실리콘 고무 기반. . Schoen 외는 micropost (L / D) 및 해당 중합체의 포아송 비 (V)의 종횡비에 기초하여 이러한 교정 인자가 있다는 것을 증명 8 그것은로 주어진다. : <img alt="식 (2)" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq2.jpg" /> (2) T 기울기는 (V) 동일한 문서에서 발견 될 수있는 피팅 파라미터 = 1.3를 포함 틸팅 계수되면서 : <img alt="식 (3)" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq3.jpg" /> (3) 즉 micropost 보정의 강성 K CORR은 순수한 굽힘 강성 K = K 벤드의 생성물 및 보정 계수 CORR 의미주어진: <img alt="식 (4)" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq4.jpg" /> (4) 따라서, 셀 력 계산 이제 판독 식 (1)의보다 정교한 변형을 사용하여 수행한다 : <img alt="식 (5)" src="/files/ftp_upload/53350/53350eq5.jpg" /> (5) 보정의 영향은 즉시 micropost 치수에 대한 일반적인 값을 사용으로 더 분명해진다. 예를 들면, 원형 단면과 PDMS 계 실리콘 고무로 만들어진 5 ㎛의 직경 15 마이크론 길이 micropost는 0.77의 보정 계수에 이르게하기 때문에 보정 전 계산은 23 %가 소비 된 전지의 힘을 과대 평가한다. 이것은 훨씬 더 심각한 작은 종횡비 microposts에 대한된다. 전통적으로, micropost 이미지 분석은 이상적인 빔 굽힘 이론에 근거하고있다. 2005 년 MICR의 사용을 개척 한 그룹opost 어레이 micropost 분석에 적합한 이미지 분석 소프트웨어를 발표 9 소프트웨어는 소프트웨어 라이센스가 필요하고 사용자가 각각의 위치에 대한 세 개의 이미지를 취한다.; 전송 모드와 스테인드 세포에 형광 모드에서 또 하나의 micropost의 상단과 하단면에서 한 각. 각각의 상부 및 하부 위치를 비교 한 후 소프트웨어가 힘 벡터 필드를 결정하고, 포스트 당 힘과 같은 관련 파라미터를 계산 micropost. 기타 소프트웨어 패키지는 존재와 그 분석의 원칙은 간단하게 그들을 설명하는 해당 기사에 언급되어 있지만, 이러한 분석 소프트웨어 패키지는 일반적으로 공개적으로 사용할 수 없습니다. (10, 11) 셀 매핑 힘을 위해 설계 micropost 어레이는 모든 이웃 microposts 사이의 등거리 간격 장점이 후자의 직교 micropost 레이아웃 또는 육각형 하나에 되로 분류 될 수있다. 일반적인 microposts 하원형 단면을 적이 그들의 사이즈 타원 또는 사각형 단면 microposts 또한보고되었다 그러나, 길이가 50 ㎛ 인 내지 1.0 μm의 직경이 10 ㎛ 내지 2. (4)를 배열한다. 12,13 micropost 재료로서 PDMS 기반 실리콘의 혼합물의 혼합물을 사용하는 나노 입자를 추가로 허용한다. 코발트 나노로드를 추가 예를 들어 micropost의 자기 활성화를 가능하게하고, 따라서 잠재적 인 실험 디자인에 자유의 또 다른 학위를 제공합니다. 14 대부분의 그룹은 커버 유리와 같은 또는 페트리 접시 내부 평면 딱딱한 기판 상에 자신의 micropost 배열을 생산하고 있습니다. 그러나 맨과 동료들은 최근에 신축 막에 형성된 micropost 배열을보고했다. 15 세포 수축성의 관점에서 라이브 셀 세포 내 동적 응답을 공부하는 동안이 부착 세포에 세포 스트레칭 힘의 응용 프로그램을 할 수 있습니다. 널리 사용되는 가장 맛 음료SU8 포토 레지스트를 이용하여 실리콘 웨이퍼 위에 마이크로 구조를 생성하는 데 사용되는 간단한 표준 클린 룸 공정에서 Sniadecki 동료. 16-18의 통찰력 프로토콜에 기재된 바와 같이 micropost 어레이 제작 오리스 공정은 소프트 리소그래피에 기초한다. 이것은 실리콘 고무 몰드로 이송 구조 위에 캐스팅 된 상기 복사 프로세스가 이어진다. 제 2 단계에서, 이들 몰드 선택된 기판 위에 실리콘 고무를 사용하여 초기 미세 구조를 복제하기 위해 사용된다. 그러나 microposts위한 제조 공정을 확립 그들의 애플리케이션과 관련된 서적의 큰 증가에도 불구하고 마이크로 공학 전문가에도 상당한 시간이 소요; 허용 가능한 품질 레벨을 산출하기 위해 특정 테스트 환경과 micropost 레이아웃 최적화 및 적응을 필요로하는 많은 공정 단계가있다. 상업 micropost 배열은 준비-T에 사용할 수 있습니다지속적으로 높은 품질의 오 사용 ( &quot;기성&quot;) 형식입니다. 따라서 그들은 현장 생산에 필요한 복잡하고 긴 제조 공정에 대한 대안이다. 이 논문에서 시판 micropost 어레이는 단일 시야 현미경 이미지를 사용하여 셀룰러 힘을 매핑하는데 사용 하였다. 더 중요한이 문서에서는이 원고에 대한 보충 자료 등을 다운로드 할 수 있습니다 MechProfiler라는 이름의 완전한 기능을 오픈 소스 소프트웨어를 설명합니다. 소프트웨어 적극적 유지 버전도 http://www.orthobiomech.ethz.ch에서 찾을 수있다. &quot;기성품&quot;분석과 호환 오픈 소스 분석 소프트웨어의 조합은 현저히 TFM 정확한 실험을 달성하기 엔트리 장애물을 낮춘다. 클린 룸 시설이나 소프트웨어 개발 전문 중 하나에 대한 액세스 권한이없는 연구원은 성공적으로 세포의 힘을 분석 할 수 있습니다. 이 메케에 초점을 사용자로 하여금ensitivity 분석 출력보다는 기술 자체, 및 더 넓은 지역에 사용할 견인력을 측정한다. 또한, 이것은 micropost 어레이 전자동 스크리닝 향해 방법을 포장하는 중요한 단계이다. MechProfiler 분석 소프트웨어는 파일 형식 TIFF, PNG, BMP와 JPG의 이미지를 처리​​합니다. 이미지는 형광, 위상차 또는 밝은 장광 현미경을 사용하여 수행 될 수있다. 독립 실행 형 프로그램은 (이용 가능한 그림 12) 무료 matlab에 컴파일러 런타임과 함께 실행하고 기본 알고리즘은 약 1 분에 하나 또는 여러 개의 세포와 이미지를 처리하는 사용자 수 있도록 효율적인 이미지 처리를 위해 수 있습니다. 또한, 이들 세포 중 살아있는되거나 &quot;고정&quot;. MechProfiler 소프트웨어 크게 상업용 품질 micropost 어레이의 재현성에 의존하여 데이터 분석 처리량을 증가시킬 수있다, 구체적으로는, 기본 및 #8220은 비 - 편향 &quot;배열의 각 포스트의 위치가 이상적 그리드에 대해 추정 될 수있다 (본 연구에 사용 된 배열에서 그리드 제조 편차를 100nm 이하였다). 단 하나의 관심 영역에 작물, 분석 용 이미지 파일의 선택이 열리면 세포에 의해 덮여 게시물을 정의되거나 또는 폐기해야하는 사후 위치를 결정하고, 편향 / 이상적 그리드에 대해 힘을 산출하고, 최종적으로 표준 Office 스프레드 시트에 포함, 수출 가능성을 가진 모든 세포 관련 데이터를 저장합니다.

<table><tbody><tr><td>T25 cell culture flasks</td><td>Nunc</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS-buffer</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0.5% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Medium DMEM/F12</td><td>Sigma</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>FBS South America</td><td>Life Technologies</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin 100x</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge vials</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin</td><td>MicroDuits</td><td>MPA-col1/FN</td><td>Micropost dimensions: &amp;Oslash;=6.4&amp;#160;&amp;micro;m, l=18.2 &amp;micro;m; grid=13 &amp;micro;m, k&lt;sub&gt;corr&lt;/sub&gt;=2.87&amp;#160;nN/&amp;micro;m</td></tr><tr><td>Ethanol abs p.A.</td><td>Merck</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Nunc</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Formalin solution, neutral buffered 10%</td><td>Sigma</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Blue G-250</td><td>Sigma</td><td>27815</td><td>Coomassie blue</td></tr><tr><td>Methanol ACS p.A.</td><td>Merck</td><td>1.06009</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dish</td><td>WillCo Wells BV</td><td>GWSb-3522</td><td>35 mm diameter, aperture 22&amp;nbsp;mm</td></tr><tr><td>T-100 Eclipse</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Inverted microscope</td></tr><tr><td>D3-L3</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>Camera controler</td></tr><tr><td>DS Fi2</td><td>Nikon</td><td></td><td>Camera</td></tr></tbody></table>

easy and accurate mechano-profiling on micropost arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

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Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

Micropost 배열에 쉽고 정확한 - 기계 프로파일

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

easy-and-accurate-mechano-profiling-on-micropost-arrays

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.1K 조회수.  Balgrist University Hospital. Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost. 

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Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

연구

생체공학

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated through myosin-actin interactions and play an important role in our physiology.  During development, they enable cells to move from one location to the next in order to form the early structures of tissue.  Traction forces help in the healing processes.  They are necessary for the proper closure of wounds or the migration and crawling of leukocytes through our body.  These same forces can be detrimental to our health in the case of cancer metastasis or vascular growth towards a tumor.  The most common method by which to study cells in vitro has been to use a glass or polystyrene dish.  However, the rigidity of the substrates makes it impossible to physically measure cell traction forces, and there are relatively few methods to study traction forces.  Our lab has developed a technique to overcome these limitations.  The method is based on a vertical array of flexible cantilevers, the stiffness and size scale of which are such that individual cells spread across many cantilevers and deflect them in the process.  The pillars we use are 3 &mu;m in diameter, 10 &mu;m tall, and are configured in a regular array with 9 &mu;m center-to-center spacing.  But these physical dimensions can be readily varied to accommodate a variety of studies.  We start with a silicon master, but the final posts are made out of silicone rubber called poly (dimethyl siloxane), or PDMS.  We can measure the deflections under a microscope and calculate the magnitude and direction of traction forces required to produce the observed deflections.  We call these substrates microfabricated post-array-detectors, or mPADs.  Here, we will show you how we fabricate and use the mPADs to assess modulations of cellular contractility.

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we demonstrate how to fabricate and utilize microfabricated post array detectors (mPADs) to assess modulations of cellular contractility.

Microfabricated 포스트 - 배열 감지기 (mPADs) : 기계적 힘을 분리하는 접근

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

생물학

Hollow Microneedle-based Sensor for Multiplexed Transdermal Electrochemical Sensing

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals suffering from chronic medical conditions facile assessment of their immediate physiological state. Furthermore, it could serve as a research tool for analysis of complex, multifactorial medical conditions. In order for such a multianalyte sensor to be realized, it must be minimally invasive, sampling of interstitial fluid must occur without pain or harm to the user, and analysis must be rapid as well as selective.
Initially developed for pain-free drug delivery, microneedles have been used to deliver vaccines and pharmacologic agents (e.g., insulin) through the skin.1-2 Since these devices access the interstitial space, microneedles that are integrated with microelectrodes can be used as transdermal electrochemical sensors. Selective detection of glucose, glutamate, lactate, hydrogen peroxide, and ascorbic acid has been demonstrated using integrated microneedle-electrode devices with carbon fibers, modified carbon pastes, and platinum-coated polymer microneedles serving as transducing elements.3-7,8
This microneedle sensor technology has enabled a novel and sophisticated analytical approach for in situ and simultaneous detection of multiple analytes. Multiplexing offers the possibility of monitoring complex microenvironments, which are otherwise difficult to characterize in a rapid and minimally invasive manner. For example, this technology could be utilized for simultaneous monitoring of extracellular levels of, glucose, lactate and pH,9 which are important metabolic indicators of disease states7,10-14 (e.g., cancer proliferation) and exercise-induced acidosis.15

This article details the construction of a multiplexed microneedle-based sensor. The device is being developed for in situ sampling and electrochemical analysis of multiple analytes in a rapid and selective manner. We envision clinical medicine and biomedical research uses for these microneedle-based sensors.

다중 Transdermal 전기 감지를위한 빈 Microneedle 기반 센서

The development of a minimally invasive multiplexed monitoring system for rapid analysis of biologically-relevant molecules could offer individuals ...

A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various spheroid production methods such as non-adhesive surfaces, spinner flasks, hanging drops, and microwells have been used in studies of cell-to-cell interaction, immune-activation, drug screening, stem cell differentiation, and organoid generation. Among these methods, microwells with a three-dimensional concave geometry have gained the attention of scientists and engineers, given their advantages of uniform-sized spheroid generation and the ease with which the responses of individual spheroids can be monitored. Even though cost-effective methods such as the use of flexible membranes and ice lithography have been proposed, these techniques incur serious drawbacks such as difficulty in controlling the pattern sizes, achievement of high aspect ratios, and production of larger areas of microwells. To overcome these problems, we propose a robust method for fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. This method utilizes a 30 x 30 through-hole array, several hundred micrometer-order steel beads, and magnetic force to fabricate 900 microwells in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate. To demonstrate the applicability of our method to cell biological applications, we cultured adipose stem cells for 3 days and successfully produced spheroids using our microwell platform. In addition, we performed a magnetostatic simulation to investigate the mechanism, whereby magnetic force was used to trap the steel beads in the through-holes. We believe that the proposed microwell fabrication method could be applied to many spheroid-based cellular studies such as drug screening, tissue regeneration, stem cell differentiation, and cancer metastasis.

This manuscript introduces a robust method of fabricating concave microwells without the need for complex high-cost facilities. Using magnetic force, steel beads, and a through-hole array, several hundred microwells were formed in a 3 cm x 3 cm polydimethylsiloxane (PDMS) substrate.

쌍된 구슬 및 Microwells 가변 오목한 형상의 성형에 대 한 자석 배열

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

AFMS의 병렬 활성 캔틸레버 어레이를 통해 고처리량 검사 가능

Active Probe Atomic Force Microscopy with Quattro-Parallel Cantilever Arrays for High-Throughput Large-Scale Sample Inspection

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. However, due to their limited imaging throughput, AFMs have not been widely adopted for large-scale inspection purposes. Researchers have developed high-speed AFM systems to record dynamic process videos in chemical and biological reactions at tens of frames per second, at the cost of a small imaging area of up to several square micrometers. In contrast, inspecting large-scale nanofabricated structures, such as semiconductor wafers, requires nanoscale spatial resolution imaging of a static sample over hundreds of square centimeters with high productivity. Conventional AFMs use a single passive cantilever probe with an optical beam deflection system, which can only collect one pixel at a time during AFM imaging, resulting in low imaging throughput. This work utilizes an array of active cantilevers with embedded piezoresistive sensors and thermomechanical actuators, which allows simultaneous multi-cantilever operation in parallel operation for increased imaging throughput. When combined with large-range nano-positioners and proper control algorithms, each cantilever can be individually controlled to capture multiple AFM images. With data-driven post-processing algorithms, the images can be stitched together, and defect detection can be performed by comparing them to the desired geometry. This paper introduces principles of the custom AFM using the active cantilever arrays, followed by a discussion on practical experiment considerations for inspection applications. Selected example images of silicon calibration grating, highly-oriented pyrolytic graphite, and extreme ultraviolet lithography masks are captured using an array of four active cantilevers (&#34;Quattro&#34;) with a 125 &#181;m tip separation distance. With more engineering integration, this high-throughput, large-scale imaging tool can provide 3D metrological data for extreme ultraviolet (EUV) masks, chemical mechanical planarization (CMP) inspection, failure analysis, displays, thin-film step measurements, roughness measurement dies, and laser-engraved dry gas seal grooves.

저자 스포트라이트: Quattro-Parallel Cantilever Arrays를 사용한 Active Probe Atomic Force Microscopy 소개

Large-scale sample inspection with nanoscale resolution has a wide range of applications, especially for nanofabricated semiconductor wafers. Atomic force microscopes can be a great tool for this purpose, but are limited by their imaging speed. This work utilizes parallel active cantilever arrays in AFMs to enable high-throughput and large-scale inspections.

고처리량 대규모 시료 검사를 위한 Quattro-Parallel Cantilever 어레이를 사용한 Active Probe Atomic Force Microscopy

An Atomic Force Microscope&#160;(AFM) is&#160;a powerful and versatile tool for nanoscale surface studies to capture 3D topography images of samples. ...

공학

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

제조 및 MicroEnvironment의 microArrays의 사용 (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Micropost 배열에 쉽고 정확한 - 기계 프로파일

요약

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이 비디오의 챕터

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

Microfabricated 포스트 - 배열 감지기 (mPADs) : 기계적 힘을 분리하는 접근

다중 Transdermal 전기 감지를위한 빈 Microneedle 기반 센서

쌍된 구슬 및 Microwells 가변 오목한 형상의 성형에 대 한 자석 배열

고처리량 대규모 시료 검사를 위한 Quattro-Parallel Cantilever 어레이를 사용한 Active Probe Atomic Force Microscopy

고처리량 대규모 시료 검사를 위한 Quattro-Parallel Cantilever 어레이를 사용한 Active Probe Atomic Force Microscopy

고처리량 대규모 시료 검사를 위한 Quattro-Parallel Cantilever 어레이를 사용한 Active Probe Atomic Force Microscopy

정량 실시간 PCR (qPCR) 배열을 사용하여 사전 마이크로 RNAS과 microRNAs의 프로 파일링

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

제조 및 MicroEnvironment의 microArrays의 사용 (MEArrays)